This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

The authors have nothing to disclose.

Salgılama sistemleri ve bakteriyel efektör proteinler konakçı hücrelerin sitoplazmasına bu sistemler nakliye, bir çok patojen bakteriler özgü replikatif niş içinde bir enfeksiyona neden kullanan önemli hastalık oluşturma bileşenidir. Birçok araştırma grupları odağı bakteriyel etkileyiciler ve konak proteinler ve ana hücresel yollardaki bu etkileyiciler var etkisi arasındaki etkileşimi araştırmak olmuştur. Çok sınırlı bir araştırma, eğer varsa, ev sahibi proteinleri başarılı bakteriyel efektör translokasyon için gerekli olduğu potansiyeli incelenmiştir. Bu çalışmada biz zorunlu hücre içi patojen Coxiella burnetii, zoonotik Q ateşi neden olan ajan kullanılır. Konakçı hücrelere girmesinden sonra, Coxiella ihtiva-eden vakuol pasif çok yüksek sayılar çoğaltır asidik lizozom türetilmiş çarpıtma, ulaşana kadar kanonik endositik yolu aracılığıyla trafik işlemlerini gerçekleştirir. Dışında advanta alaraknormal konakçı trafik yolunun GE, başarılı bir replikatif niş kurmak Coxiella yeteneği de fonksiyonel bir türü IVB salgılama sistemine (T4SS) ve daha sonra efektör translokasyon 8,17 dayanır. Bu salgı sistemi Legionella iyi karakterize edilmiş nokta / Icm T4SS işlevsel benzer. Bu aptly kendi Coxiella genlerinin 19,20 ile Legionella spesifik nokta / icm mutantlar tamamlayarak gösterilmiştir. Legionella ve Coxiella hem T4SSs replikasyonu için gerekli olmakla birlikte, bu sistemler devreye sokulduğunda zamanlaması oldukça farklı ve kendi replikatif nişler farklı doğasını yansıtır. Legionella T4SS hemen konakçı hücrelerin ve efektör hızlı translokasyonu ile temas ettiğinde tetiklenir bakteri varsayılan endozomal-lizozomal yolu önlemek ve bunun yerine benzersiz bir ER-türevli replikatif vacuo oluşturmanıza olanak sağlarle 42. Bakteriler asidik lizozom kaynaklı çarpıtma 21 ulaştıktan sonra tersine, Coxiella ve T4SS, yaklaşık 8 saat sonrası enfeksiyon kadar etkin değildir. Coxiella pasif o lizozom ulaşana kadar aktif değil endositik yolağı ve translokasyon sistemi ile transit göz önüne alındığında, eşsiz bir fırsat endositik olgunlaşmasını incelemek için bir araç olarak Coxiella kullanmak için kendini göstermektedir. etkileyiciler transloke önce CCV gereksinimi konak proteinler, bir dizi endositik trafik yoluna katılan proteinler konakçı sitoplazmaya efektör proteinler translokasyon için önemlidir, özellikle, ancak bunlarla sınırlı değildir gösterir asitleştirildi hale gelmesine. Belirli bir hedef şekilde siRNA kullanan biz efektör translokasyon özellikle konak proteinlerin rolünü aydınlatmak başlayabilir. Bu çalışmada ökaryotik endositik kadınlara zorla fuhuş düzenleyen iki protein üzerinde duruldudolayısıyla ng yolu ve Coxiella efektör CBU0077 translokasyonunu etkilemek için tahmin edilmiştir. sırasıyla erken ve geç endozomlarda ile Rab5A ve Rab7A kontrol membran füzyon. Kontrol OTP siRNA (Şekil 5B) ile karşılaştırıldığında siRNA kullanılarak bu proteinlerin ya da susturma CBU0077 translokasyon verimliliğinde önemli bir azalma ile sonuçlanmıştır. Burada gösterilen temsilcisi sonuçları önceki yayınlanmış bulguları 21 yansıtmak ve Coxiella efektör translokasyon bu insan Rab proteinlerinin önemini daha da doğrulama sağlamak. Bu teknik aynı zamanda Coxiella Nokta / ICM efektör translokasyon diğer ana işlemler etkisini karakterize etmek için kullanılmıştır. Retromer kompleksi Coxiella hücre içi replikasyonu için önemli olduğu tespit edildi. biz bu retromer o indükler ortamı yaratmak için gerekli olan gösterebilirim bir translokasyon tahlil, retromer bileşenleri susturulması siRNA kullanılarak, ve sonra yaparakCoxiella efektör translokasyon 43. Burada gösterilen Örnek sonucunu doğurmasına rağmen, enfekte OTP kontrol ve siRNA hedef Rab5A ve Rab7A arasında bir karşılaştırma, protokol deney ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir. Örneğin, efektör translokasyon düzeyi de karıştırılmış siRNA veya non-transfekte edilmiş hücreler ile transfekte edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında edilebilir. Bu özel çalışmanın odak noktası zorunlu hücre içi patojen C. oldu burnetti ve endositik ticareti katılan proteinler, ancak, tarif edilmiş olan yöntemler kolay ölümcüllük için salgılama sistemleri kullanan diğer hücre içi ve hücre dışı patojenlerin uyarlanabilir. Gerçekten de, burada kullanılan ana sitoplazması içinde β-laktamaz aktivitesi dayanır flüoresan bazlı translokasyon deneyi, daha önce yoğun patojenlerin 30-32,35,44 bir aralığında kullanılmaktadır. doğal, enfeksiyon koşullarıkullanılan özel hücre çizgileri özel bakterilerin enfeksiyon gereksinimleri yansıtmak için adapte edilmelidir. Ayrıca, bilinen bir endojen efektör ß-laktamaz için içinde açıklanan yöntemlerden başarısı için her şeyden önemlidir erimiş. protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için önemli bir husus burada açıklanan bakteriyel girişi ve sonraki çoğaltma olabilir, belirli bir konak hedefi susturma etkisidir. Burada, Coxiella tarafından efektör translokasyon 24 saat sonrası enfeksiyon ölçülür. Bu durumda, diğer hücre içi bakteri, konak hücreler içine giriş yapmak için organizmanın yeteneği çok önemlidir. Buna ek olarak, belirli bir gen susturma dolayısıyla da görülen translokasyon seviyesinin değiştirilmesi bakteriyel replikasyonu etkileyebilir. siRNA susturma anlamlı bakteriyel giriş ve / veya replikasyonu, ve bunun sonucu olarak translokasyonu etkinliğini etkilemez dair onay, mikroskopi veya bakterinin sayılandırma kullanılarak elde edilebilir. translokasyonBu veriler daha sonra siRNA tedavi başına enfekte hücrelerin sayısı için normalleştirilebilir. Coxiella 24 saat inkübasyon periyodu sırasında çoğaltma az uğrar gibi bakteriyel çoğaltma Burada sunulan veriler eleştirilmiştir değil. Bu yöntem, ilgi konusu genin, yeterli susturulması sağlamak için konakçı hücrelere siRNA verimli transfeksiyona gerektirir. Bu akılda, doğru transfeksiyon reaktifi seçerken son derece önemlidir. Yanı sıra, reaktif ve HeLa 229 hücreleri için optimize edilmiş bu özel çalışmada kullanılan koşullardan, seçim yapmak için çok sayıda başka reaktif vardır. Farklı transfeksiyon reaktifleri kullanılarak demonte verimlilik en uygun reaktif hem de seçili olduğundan emin olmak için RT-qPCR kullanılarak sayısal ve siRNA özel olarak seçilmiş ilgi transkript hedeflediği edilebilir. Bu çalışmada sunulan olmasa da, biz daha önce hem Rab5A demonte verimliliğini göstermiştir ve Rab7A RT kullanarak-qPCR 21. Ayrıca, western blot ile ilgi ve onay hedefe karşı antikorların kullanımı da belirli hedeflere siRNA susturulması teyit edebilir. siRNA kullanırken dikkat çekmek için diğer iki önemli hususlar dışı hedef etkileri olasılığını ve transfekte hücrelerin hücre canlılığı bulunmaktadır. istenmeyen hedefleri de tahrip zaman hedef dışı etkileri ortaya çıkar. Bu fenotipik değişikliklere yol açabilir ve yanlış pozitif neden olabilir. Bu çalışmada tek bir ana hedefi susturmak için dört siRNA dubleksleri bir havuz kullanılmıştır. Belirli bir hedef susturma Bu sonuçlar dört siRNA dupleksleri ayrılması ve translokasyon deneyi tekrar elde edilebilir hedef dışı etkiler nedeniyle değildir translokasyon verimliliği, doğrulama bir azalmaya neden olursa. Dört siRNA dubleksleri dışında en az iki orijinal siRNA havuzuna benzer bir fenotip göstermesi gerekmektedir. Bu sonuçla, biri son derece emin olabilirsiniz gözlemlenmiştir translocation verimliliği hedef dışı etkilerine bağlı değildir. üretilen translokasyon sonuçlarının geçerliliği de hücre canlılığı bağlıdır. translokasyon tahlil sonra bir çekirdek leke uygulama siRNA susturma aşağıdaki hücre canlılığı numaralandırma sağlar. PLK1 durumunda, çok hücre ölümü kolay boyama olmaksızın gözlenebilir; Bununla birlikte, bir epifluorışıma mikroskopi daha kesin bir temsili kullanılarak elde edilebilir. kontrole kıyasla, örneğin,% 50 görülmektedir, belirli bir konakçı hedef, çok hücre ölümü susturduğu, bu mümkün değilse doğru bir resim efektörlerinin translokasyonu için bu özel konakçı protein önemine olarak anlaşılabilir ki. Rab5A ya Rab7A ya susturulması hücre canlılığı (Şekil 5C) üzerinde hafif bir etkiye sahip olmasına rağmen, bu çalışmada gösterildiği gibi, bu azalma gözlenmiştir translokasyon verilerinin geçerliliğini yok etmek için yeterince belirgin değildir. hücre canlılığı foll konusunda Diğer bir faktörsiRNA susmasının nedeniyle önemli bir hücre ölümü genellikle translokasyon oranında bir artışa yol açar gözlemdir. Bu uygun bir şekilde PLK1 (Şekil 5A) için rapor edilen translokasyon veriler ile gösterilmektedir. indirgenmiş hücre sayısı enfeksiyon çokluğu orantılı bir artışla sonuçlanır. Bu enfeksiyon oranını ve dolayısıyla translokasyon oranı artacaktır. Bu çalışmada sunulan olmasa da, efektör translokasyon görselleştirme de ücretsiz bir niceliksel bir sonuç elde edebilirsiniz. Ayrı bir eksitasyon ve emisyon ışığa uzun geçiş dikroik ayna ile donatılmış bir epifluorescent mikroskop kullanarak hücre içi Blam alt-tabaka bir floresans görsel gözlem sağlayabilir. β-laktamaz haberci sistemine bir olası bir alternatif, adenilat-siklaz raportör sistemi kullanmaktır. Burada tarif edilen raportör sistemi benzer şekilde, ilgilenilen gen cyaA (a kalmodulin bağımlı adenilat siklaz genine kaynaştırılır </em&gt;) Bordetella pertussis türetilmiş. Efektör translokasyon immunodeneydir ELISA kiti kullanılarak hücre içi siklik AMP (cAMP) nicelleştirilmesi ile ölçülebilir. CyaA aktivitesi ana sitosolunda mevcut olan yegane konakçı hücre kalmodulin, tamamen bağlı olduğundan, efektör translokasyon cAMP seviyelerinde bir artış ile teyit edilir. Bu yöntem aynı zamanda bakteri 45-47 çeşitli efektör translokasyonu ölçmek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır, ancak, hücre içi cAMP ölçümü cAMP içinde tarif edilen yönteme göre daha zaman alıcıdır olan bir işlem elde etmek için konakçı hücrelerin lize dayanır. Bam alt-tabaka direkt olarak hücrelere ilave edilebilir ve floresan saat içinde ölçülebilir yana FRET tabanlı β-laktamaz raportör sistemi kullanılarak efektör translokasyon ölçümü daha etkilidir. Buna ek olarak, burada açıklanan yöntem, daha kolay bir şekilde, özellikle, bir 96 oyuklu formunda, yüksek hacimli sonuçları üretmek için adapte edilebilirat. Birçok bakteriyel patojenler patojeni yararına konak hücre fonksiyonlarının modülasyonu sağlayan konakçı hücreler içine efektör proteinleri tanıtmak, protein translokasyon sistemleri bağlıdır. Tip IV salgılama sistemleri Legionella, Coxiella ve Brucella ve aynı zamanda hücre içi bakteri tarafından kullanılan Tip III salgılama sistemleri bağlama ve E silen, Chlamydia dahil patojen bir dizi tarafından kullanılan E. coli ve Salmonella. patojenlerin bir dizi ile efektör translokasyon belirli konak proteinlerin susturma ifade etkisini karşılaştırarak, bireysel patojene karşı salgı sistemleri veya özel belirli türlerine göre efektör translokasyon için gerekli konakçı faktörleri bir anlayış aydınlatılamamıştır olabilir. Bu konak-patojen etkileşimleri inceliklerini incelemek için benzersiz bir yaklaşım sağlar.

Coxiella burnetii zoonotik insan enfeksiyon Q ateşe neden benzersiz bir hücre içi patojen olduğunu. Bu hastalık asemptomatik serokonversiyon sıklıkla maruz sonra 1 endokardit yıl olarak tezahür hayatı tehdit kronik enfeksiyona uzanan klinik sunumlar geniş bir yelpazede ile ilişkilidir. İnsan enfeksiyon öncelikle geviş getiren, özellikle, süt inek, koyun ve keçilerde enfeksiyonu için önemli rezervuar, kirlenmiş aerosollerin solunması yoluyla gerçekleşir. Bu hayvanlarda Coxiella enfeksiyonu genellikle subklinik olmasına rağmen, enfeksiyon kürtaj tetikleyebilir ve doğum sıvısı ve plasentanın içinde hatırı sayılır bakteriyel yük yerel çevreyi 1 kirletebilir. Halk sağlığı ve tarım sektöründe hem son zamanlarda Hollanda&#39;da 2 meydana gelen Q humması salgını gözlendi üzerinde büyük bir yük gibi bir kontaminasyon örneğidir olabilir. 2007 ve arasında2010 Q humması 4.000 &#39;den fazla insan vakası teşhis edildi ve bu salgın keçi çiftlikleri 3 önemli kirlenme bağlıydı. Ayrıca, Coxiella şiddetli morbidite ve mortaliteye 4 neden bakteri ve gerekli düşük bulaşıcı dozun çevresel istikrara Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından sınıflandırılmış olarak, bir potansiyel biyolojik silahtır. Coxiella iki aşamada vardır: doğal kaynaklardan izole Faz I organizmalar, son derece öldürücü ve Faz II organizmalar yüksek in vivo zayıflatılmaktadır. Örneğin, Coxiella burnetti dokuz Mile Faz I organizmaların çeşitli in vitro geçiş sonrası, Faz II bakteri kesik lipopolisakarit ile sonuçlanan geri dönüşü olmayan bir kromozom silme içeren üretildi (LPS) 5. Bu suş, C. burnetii NMII, doku kültürü modelleri I Faz fenotipik benzer ve daha güvenli bir modu sağlarAraştırmacılar laboratuvarlarda 5 Coxiella hastalık oluşumunun incelenmesinde l. Son yıllarda birçok atılımlar hızla Coxiella genetik alanında gelişmiş var. En önemlisi, aksenik ortam geliştirilmesi (sitrat sistein orta asitleştirildi - ACCM-2) hem sıvı ve katı ortam 6,7 ile Coxiella hücresiz büyüme sağlamıştır. Bu uyarılabilir gen sentezleme sistemi için, mekik vektörleri ve rasgele transpozon sistemleri 8-11 de dahil olmak üzere Coxiella için genetik araçlar doğrudan gelişmeler ile sonuçlandı. En son, hedeflenen gen inaktivasyonu için iki yöntem de belirli virülans gen adayları 12 incelenmesi için önünü geliştirilmiştir. Alveoler makrofajlar tarafından içselleştirilmesi ardından, Coxiella membrana bağlı bölme içinde yüksek sayılara çoğaltır vakuol (CCV) içeren Coxiella- adlandırılan. CCV konak endositik ticaretini inci gerektirirkaba erken ve geç endozomlar bir lizozom kökenli organel 13 içine olgunlaşır kadar. Bu süreç boyunca, CCV ya geçici görünür ya da dahil olmak üzere, vakuol ile ilişkili, ancak Rab5, Rab7, CD63 ve LAMP-13-15 Ocak, bunlarla sınırlı olmamak kalır konakçı faktörleri kazanır. Konak hücreleri içinde Coxiella çoğaltma tamamen işlevsel Dot / ICM Tipi IVB salgılanması Sistemi (T4SS) 8,16,17 tamamen bağlıdır. Bu salgı sistemi ancestrally konjugasyon sistemleri ile ilgili bir çok protein yapısı ve bakteriyel proteinler sunmak için hem bakteriyel ve vakuoler membranlar yayılan, ev sahibi sitoplazmada 18 içine, etkileyiciler olarak adlandırılan. Coxiella T4SS işlevsel Legionella pneumophila 19,20 iyi karakterize Tip IVB Nokta / ICM salgılama sistemine çok benzer. Coxiella asidik lizozom türetilmiş ulaşıncaya kadar İlginç bir şekilde, T4SS ve daha sonra efektör translokasyon aktivasyonu oluşmazorganel, yaklaşık 8 saat sonrası enfeksiyon 17,21. Bugüne kadar, 130 üzerinden Nokta / ICM efektörler 9,17,22-24 tespit edilmiştir. Bu etkileyiciler çoğu büyük olasılıkla konak hücreleri içinde Coxiella replikasyonu sırasında önemli rol oynamaktadır; Bununla birlikte, sadece bir kaç efektör işlevsel 25-29 karakterize edilmiştir. Bu çalışmada, konakçı hücre sitoplazması içinde β-laktamaz aktivitesi ile (bundan sonra Bam alt-tabaka olarak da adlandırılır) CCF2-AM FRET alt-tabaka (Şekil 1) bölünmesi dayanan bir floresans bazlı translokasyon deneyi kullanmaktadır. ilgi konusu genin yapısal ekspresyonu sağlayan bir raportör plasmidi ile β-laktamaz (Bam)-1 TEM kaynaştırılır. Bam alt-tabaka, bir FRET çifti oluşturan iki florofor (kumarin ve floresein) oluşmaktadır. floresein ve efektör translokasyon yokluğunda yeşil floresan emisyon FRET içinde kumarin sonuçlarının Tahrik olma; Bununla birlikte, Bla halindeM-efektör füzyon proteini, konakçı sitoplazma içerisine doğru olan, elde edilen β-laktamaz aktivitesi böler uyarma aşağıdaki mavi floresan emisyon üretiminde FRET çifti ayırma Bam substratın β-laktam halkası. Bu translokasyon tahlil de C dahil olmak üzere farklı hücre içi ve hücre dışı bakterilerin bir dizi, efektör proteinleri tespit etmek bir yaklaşım olarak kanıtlanmıştır burnetti, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatojenik E. E. coli, Salmonella ve Brucella 17,30-35. Coxiella efektör translokasyon belirli konak faktörlerinin rolünü belirlemek için biz özellikle küçük müdahale RNA (siRNA), RNA girişim olarak bilinen gen susturma için köklü bir yöntem kullanmaktadır. Başlangıçta Caenorhabditis elegans tespit RNA interferans doğal Defe için kullanılan korunmuş bir endojen hücresel süreçvirüslere karşı nse yanı sıra gen regülasyonu 36,37. Diziye özgü siRNA bağlanmasından sonra, mRNA degradasyonu özgü gen susturma ve demonte 38 elde (RNA-bağlı susturulması kompleksi) RISC yoluyla ortaya çıkar. Bu çalışmada, siRNA endositik yolunun düzenlenmesi açısından çok önemlidir, iki ana protein, Rab5A ve Rab7A, hedef için kullanılmıştır. Efektör TRANSLOKASYONA Rab5A ve Rab7A susturma etkisi C. kullanarak tespit edildi burnetti pBlaM-CBU0077. Bir önceki Coxiella 17 Nokta / ICM salgılama sistemi transloke gösterilmiştir gibi CBU0077 seçildi. SiRNA gen susturulması ve burada açıklanan fluorescencebased translokasyon tahlil hem kullanarak, biz Coxiella tarafından efektör proteinlerin translokasyonu konak faktörlerinin rol kurmaya başlıyor. Bu yaklaşım, benzer secretio sahip hem hücre içi ve hücre dışı bakterilerin geniş bir aralığına uygulanabilmektedirefektör protein translokasyonu sorumlu n sistemleri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Reagents</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Citric acid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0759</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S4641</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Potassium phosphate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60218</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">442611</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5080</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Iron sulfate</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S93248</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9625</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6852</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bacto-neopeptone</td>
			<td style="width:87px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">211681</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1424</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Methyl beta cyclodextrin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4555</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">RPMI + Glutamax</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0378</td>
			<td style="width:211px;">For bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">D-001810-10-05</td>
			<td style="width:211px;">Non-targeting control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-003290-01-005</td>
			<td style="width:211px;">Causes cell death; measure of transfection efficiency</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-004009-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-010388-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">5X siRNA buffer</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:211px;">Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DharmaFECT-1 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">T-2001-01</td>
			<td style="width:211px;">For transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Opti-MEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td style="width:211px;">Reduced-serum medium used for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">DMEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10567-014</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DMSO</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:211px;">For storage of Coxiella strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PBS</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">0.05% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">dH2O</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For dilution of samples and standards for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Quick-gDNA Mini Prep</td>
			<td style="width:87px;">ZYMO Research</td>
			<td style="width:119px;">D3007</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product to extract gDNA</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td>
			<td style="width:87px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-98020</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:343px;">LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K1032</td>
			<td style="width:211px;">For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106469</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71505</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium hydrogen orthophosphate</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106586</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Probenicid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">62251</td>
			<td style="width:211px;">Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:211px;">Fixing solution for HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">25cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430639</td>
			<td style="width:211px;">For growth of bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">75cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430641</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">175cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431080</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Haemocytometer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For quantification of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tear-A-Way 96 Well PCR plates</td>
			<td style="width:87px;">4titude</td>
			<td style="width:119px;">4ti-0750/TA</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">8-Lid chain, flat</td>
			<td style="width:87px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">65.989.002</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top microfuge</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top vortex</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Orbital mixer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:211px;">For pelleting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">Mx3005P QPCR machine</td>
			<td style="width:87px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">401456</td>
			<td style="width:211px;">For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">ClarioSTAR microplate reader</td>
			<td style="width:87px;">BMG LabTech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For measurement of fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing

Coxiella burnetii, Q humması etkeni bir yineleme niş kurmak Tip IV Dot / ICM Salgı Sistemi dayanan bir hücre içi patojen olduğunu. efektör kohort ana işlemleri değiştirmek ve replikasyon için benzersiz bir lizozom türetilmiş vakuol kurulmasına izin vermek için konakçı hücreye Bu sistem sayesinde transloke edilmiştir. özgü gen siRNA kullanarak susturma ve β-laktamaz aktivitesinin dayanan bir FRET tabanlı substrat kullanılarak efektör translokasyon ölçümü: Burada sunulan yöntem, iki köklü teknikleri kombinasyonunu içermektedir. Bu iki yaklaşım uygulamak, bakteriyel salgı sistemi fonksiyonu ve efektör translokasyon ev sahibi faktörlerin rolünü anlamaya başlayabiliriz. Bu çalışmada, Rab5A ve Rab7A hem endositik trafik yolunun düzenlenmesi açısından çok önemlidir rolü incelenmiştir. Bu efektör translocatio bir azalma ya da proteinleri de ekspresyonunu susturma göstermektedirn verimlilik. Bu yöntemler de kolayca salgı sistemlerini kullanan diğer hücre içi ve hücre dışı patojenlerin incelemek için modifiye edilebilir. Bu şekilde, bakteriyel efektör translokasyon katılan ana faktörler hakkında genel bir tablo ortaya çıkarılabilir.

Bu çalışma için, C. CBU0077 önce Coxiella Nokta / ICM salgılama sistemine 17 bir translokasyon efektör olduğu gösterilmiştir gibi burnetti pBlaM-CBU0077 soyu seçildi. Enfeksiyondan önce yedi günlük C. genomları / ml toplam sayısı burnetti pBlaM-CBU0077 kültür qPCR kullanılarak sayilmistir. 4 döngü eşiğinin bir örnek gösterir Şekil (Ct) değerleri qPCR izleyen hem standartlar ve numuneler bekleniyor. 4.3.3 tarif edildiği gibi (Amplifikasyon çizim (Şekil 4B) ve sayısal olarak (Şekil 4C) &#39;de grafik olarak ifade edilir), Ct değerleri, dışa ve analiz edildi. Gösterilen Örnek verilere göre, 10 ml yeniden süspansiyon haline bakteri kültürü (Şekil 4D), 2.31 ​​x 10 8 genomları / ml vardı. Uygun bakteriyel seyreltme oluşturmak için (1.88 × 10 8 genomları / ml in, 2 mi), yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteri 1.63 mi, taze, önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS 370 ul ilave edildi. SiRNA ile transfekte ters Hücreler daha sonra C ile enfekte edildi 24 saat boyunca 300 MOl&#39;de burnetti pBlaM-CBU0077. ters inkübasyondan sonra efektör translokasyon Bam alt-tabaka miktarının ile transfekte enfekte edilmiş hücreler bir floresan plaka okuyucu kullanarak belirlenebilir. 7 de tarif edildiği gibi analiz sonra, enfekte olmamış OTP normalize olan tüm oran değerleri, aynı zamanda, enfekte ATP&#39;ye normalleştirilebilir. konakçı genlerinde susturma sonra efektör translokasyon seviyesi enfekte OTP kontrol ile karşılaştırıldığında sonra üç sonuçlara gruba ayrılabilir: (1) herhangi bir değişiklik; (2) efektör translokasyon artması; (3) efektör translokasyon Azalmış. Daha sonra istatistiksel analiz, örneğin, bir Öğrenci t testi için, gözlenen herhangi bir fark, t önemini belirlemek için kullanılabiliro OTP kontrol bulaşmış. Üç ayrı deneyden elde edilen efektör TRANSLOKASYONA Rab5A ya Rab7A ya susturulması sonucu Şekil 5A&#39;da gösterilmiştir. Blam-CBU0077 translokasyon düzeyinde anlamlı azalma OTP kontrol (p değeri = 0.0088 (Rab5A) ve p değeri = 0.0059 (Rab7A), eşleştirilmiş Student t testi) ile karşılaştırıldığında Rab5A ve Rab7A hem susturma sırasında meydana geldi. hücre canlılığı üzerinde siRNA tedavisinin etkisi de kurulmuştur. Translokasyon tahlilinde sonra hücreler, sabit olduğu bir çekirdek boyası ile boyandı ve daha sonra ölçülebilir. OTP kontrolü (% 12 ve% 31, sırasıyla) ile karşılaştırıldığında, hücre canlılığında bir düşüşe Rab5A ya Rab7A sonuçları ile tedavi, bu azalma PLK1 (% 97), bilinen bir gen gibi ağır olmasa da, Şekil 5C&#39;de gösterildiği gibi, hücre ölümüne sebep (p-değeri = 0,0102 (Rab5A) p-değeri = 0.0081 (Rab7A) p-değeri &lt;0.0001 (PLK1), eşleştirilmiş Student t-testi). ge konağın susturma nasıl Bu sonuçlarsiRNA kullanarak nes olumsuz bakteriyel efektör translokasyonu seviyelerini değiştirebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54210/54210fig1.jpg" /> Şekil 1. Enfeksiyon sırasında Blam Yüzey Etki mekanizması. C. burnetii&#39;nin konakçı hücreler tarafından ve lizozom türevi vakuol Coxiella içeren yeni vakuol olarak adlandırılan oluşturur. 24 saat Enfeksiyondan hücreler β-laktamaz, yani Bam-CBU0077 effektör Resim translokasyon, kumarin uyarma yokluğunda. FRET çifti (A) oluşturan iki florofor sahip membran geçirgen Blam alt-tabaka ile yüklenir yeşil floresan sinyali (520 nm) (B) gözlenen floresan FRET 410 nm ile sonuçlanır. fonksiyonel Nokta / ICM salgılama sistemi durumunda, Bam-CBU0077 füzyon proteini, konakçı hücre içerisine doğru olacak ve Cı olacakİki boya ayrılmasına neden olur ve FRET bozulması ve 410 nm (C) uyarma sonra mavi bir flöresan sinyalinin (450 nm) &#39;de elde edilen, β-laktamaz aktivitesi ile, Bam substratı eave. Hem yeşil ve mavi flüoresan sinyalleri, bir floresan plaka okuyucu kullanarak tespit edildi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54210/54210fig2.jpg" /> . Şekil 2. Ters NAKLİ VE Translokasyon Testi İş Akışı Şematik Bakış 1. Gün: C hazırlayın burnetti pBlaM-CBU0077 kültürü Gün 4: a. 96-kuyu tepsi içinde / oyuk 3.92 x 10 3 hücre nihai yoğunlukta 40 nM siRNA ve tohum HeLa 229 hücreleri kullanılarak Ters transfeksiyonu Gün 5:. Change medya 7. Gün:. C. toplam genomları / ml niceliğini burnetti pBlaM-CBU0077 kültür qPCR kullanarak ve daha sonra 300 Gün 8 bir İçişleri Bakanlığı ile ters transfekte hücreleri enfekte., 6x yükleme boyası ekleyin floresan ölçmek ve hücre sayısını ölçmek <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig2large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54210/54210fig3.jpg" /> Şekil 3. Ters Transfeksiyon ve HeLa 229 Hücrelerinin Seeding kurma için kullanılır 96-kuyu Plaka Düzeni. (Kırmızı ile gösterilen) &quot;boş&quot; kuyu medya sadece içerir ve siRNA veya HeLa 229 hücreler ya eklenmesini gerekmez. o şekilde optimize edilmiştir beri OTP siRNA (bulaşmamış kuyu ve enfekte kuyuları için lacivert için açık mavi gösterilir), olmayan bir hedefleme kontrol olarak kullanılıraz hedef dışı etkileri vardır. kestane ve yeşil kuyular sırasıyla Rab5A ve Rab7A siRNA temsil etmektedir. PLK1 ifade kaybı hücre hatları büyük çoğunluğu pro-apopitotik yollar ve geniş hücre ölümünü teşvik gibi (sarı gösterilir) PLK1 siRNA transfeksiyon verimliliği bir ölçüsü olarak kullanılır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54210/54210fig4.jpg" /> Şekil 4. Temsilcisi qPCR Ct Değerleri C. genomları / ml toplam sayısı ölçmek için kullanılabilecek burnetti pBlaM-CBU0077 Kültürü (A). Coxiella kültürlerinde genomları / ml sayısını saymak qPCR kullanılan çevrim koşulları. Standartlar ve numuneler için Ct değerleri, grafik (B) ve sayısal (C) yer almaktadırbiçimleri. (D) standart Ct değerleri, ortalama grafikle ve logaritmik eğilim çizgisi hesaplanmıştır bulundu. Denklemi ve örnek ortalamaları kullanılarak Ct C. genomları / ml toplam sayısını değerleri burnetti pBlaM-CBU0077 kültür × 10 8 2.31 ​​olarak belirlendi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54210/54210fig5.jpg" /> SiRNA Rab5A ve susturma ve Rab7A. HeLa 229 hücre sırasında Dot / ICM Efektör Blam-CBU0077 Şekil 5. Translokasyon ters Rab5A özgü siRNA (kestane çubuklar), Rab7A (yeşil çubuklar), OTP (mavi bar) ya da PLK1 ile transfekte edildi (sarı çubuklar) ve C ile enfeksiyondan önce 72 saat süreyle inkübe 24 saat boyunca 300 MOl&#39;de burnetti pBlaM-CBU0077 soyu. t sonraO Bam alt-tabakanın eklenmesi, floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçülmüştür (A) Tablo 450 ile birlikte, tek bir deneyden elde edilen ham floresans değerlerini gösterir. boş değerler çıkarıldıktan sonra enfekte olmamış OTP kontrolüne 520 nm oranı görece (ortam sadece hücre yok). Translokasyon (B) ve hücre yaşayabilirliği (C) &#39;nin düzeyi yüzdesi olarak sunulmuştur, üç bağımsız deneyin OTP ters transfekte enfekte hücrelere ± standart sapma oranının ortalaması. * P değeri &lt;0.05; ** P değeri &lt;0.01; **** P-değeri &lt;0.0001 (eşleştirilmiş Student t-testi). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> konsantrasyon </strong&gt; </td></tr><tr><td> sitrik asit </td><td> 13.4 mM </td></tr><tr><td> sodyum sitrat </td><td> 16.1 mM </td></tr><tr><td> potasyum fosfat </td><td> 3.67 mM </td></tr><tr><td> magnezyum klorür </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> kalsiyum klorür </td><td> 0.02 mM </td></tr><tr><td> demir sülfat </td><td> 0.01 mM </td></tr><tr><td> sodyum klorit </td><td> 125.4 mM </td></tr><tr><td> L-sistein </td><td> 1.5 mM </td></tr><tr><td> neopeptone </td><td> 0,1 g / l </td></tr><tr><td> kasamino asitleri </td><td> 2.5 g / L </td></tr><tr><td> metil beta siklodekstrin </td><td> 1 g / L&#39; </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> 125 mL / L </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Bileşenleri Gerekli 1x ACCM-2 yapmak. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td colspan="4"> konsantrasyon, </td></tr><tr><td></td><td> 1 mikrona kadar </td><td> 5 uM </td><td> 10 uM </td><td> 20 uM </td></tr><tr><td> Mole&#39;ları Başlangıç </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 nmol </td><td> 1 mi </td><td> 200 ul </td><td> 100 ul </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> 2 nmol </td><td> 2 mi </td><td> 400 ul </td><td> 200 ul </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> 5 nmol </td><td> 5 mi </td><td> 1 mi </td><td> 500 ul </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> 10 nmol </td><td> 10 mi </td><td> 2 mi </td><td> 1 mi </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> 20 nmol </td><td> 20 mi </td><td> 4 mi </td><td> 2 mi </td><td> 1 mi </td></tr></tbody&gt; </table> Uygun Konsantrasyon Nemlendirici Liyofilize siRNA için gerekli 1x siRNA Tampon Tablo 2. Cilt.

Watch this Scientific Journal Video about Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing at JoVE.com

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

bakteriyel patojenler ve ev sahipleri arasındaki etkileşimleri araştıran biyolojik araştırmaların önemli bir alandır. Burada, Blam substrat kullanılarak siRNA gen susturma sırasında Coxiella burnetii&#39;nin efektör translokasyonu ölçmek için gerekli teknikleri tarif eder.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

applying-fluorescence-resonance-energy-transfer-fret-to-examine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

10.6K Görüntüleme.  University of Melbourne.  bakteriyel patojenler ve ev sahipleri arasındaki etkileşimleri araştıran biyolojik araştırmaların önemli bir alandır. Burada, Blam substrat kullanılarak siRNA gen susturma sırasında Coxiella burnetii'nin efektör translokasyonu ölçmek için gerekli teknikleri tarif eder. 

Video: Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Özgül Hücre Nüfus Arıtma

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

Yüzey Plasmon Rezonans Host Cytosol Toksin Translokasyon Tespiti

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...