Yazarlar teknik yardım için Christa Haase, Doris Weber ve Brigitte Korte teşekkür ederiz. Weidinger laboratuarında çalışmak Deutsche Forschungsgemeinschaft BİZ 4223 / 3-1 hibe tarafından desteklenen, 4223 / 4-1 ve Deutsche Gesellschaft für Kardiologie bir Oskar-Lapp-Stipendium aracılığıyla ve Klaus-Georg-und-Sigrid- tarafından BİZ Hengstberger-Forschungsstipendium.

<ol>
	<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+kit+ligand+a+functional+expression+reveals+lineage-specific+competence+to+promote+melanocyte+rescue+in+the+mutant+regenerating+caudal+fin.">Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin.</a> PloS one. 9 (7), e102317 (2014).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+defines+organizing+centers+that+orchestrate+growth+and+differentiation+of+the+regenerating+zebrafish+caudal+fin.">Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin.</a> Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).</li><li>Huang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines.">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li><li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos.">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li><li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish.">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li><li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish.">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines,+zebrafish+and+mice.">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556 (2011).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin.">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues.">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system.">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li><li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka.">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

yetişkin zebrabalıkları başarıyla birçok iç organları ve ekleri yenilemek için inanılmaz bir kapasiteye sahiptir. Katılan moleküler ve hücresel mekanizmaların bir anlayışa gen fonksiyonları ve sinyal yollarının doku spesifik analiz gerektirir. Bu doğru, Teton sistemi embriyonik ve yetişkin zebrafish spatiotemporally kontrollü gen ifadesi için etkin bir araç sağlar. Bu yazıda anlatılan Teton sistem yapıları ve metodoloji başarıyla laboratuvar 3 son bir çalışmada kullanılmıştır. teton sistemini kurarken aşağıdaki ek hususlar dikkate alınmalıdır: TetActivator transgen tasarım konuları Daha önce göstermiştir ki, herpes simpleks virüsü VP16 transaktivasyon ile kaynaşmış ters Tet bastırıcı etki M2 mutant varyantı aşağıdakilerden oluşan tek bir indüklenebilir TetActivator alanı türev 3F [irtTAM2 (3F), in kısa Tet-M2] verimli indüksiyon bahşeder, ancak düşük gösterebilir, ölçülebilir leakiness olsa, o Doksisiklin (DOX) yokluğunda aktivitesini uyaran arka 5&#39;tir. Bu nedenle, bir sızıntının 5 ortadan kaldırmak, bir glukokortikoid reseptörüne (Tet-KHY) ya da ekdison reseptörü (Tet-ECR) içindeki bir etki ile füzyonları kullanılarak uyarılabilir sistemler ikili olarak tanımlamışlardır. Sistem, bir ikili olarak uyanlabilir varyantının kullanımı, toksik ya da çok güçlü bir protein (örneğin, onkogenler) ifade etmek için kullanılır Böylece, dikkate alınmalıdır. Alternatif olarak, TetActivator ve TetResponder hatlarının kurulması sırasında farklı ifade seviyelerini üretim hatları bir dizi seçilebilir ve vaka leakiness seçilen zayıf indükleyicilerinin şiddetle uyaran hatları ile bir konudur. Tet-GBD veya Tet-ECR varyantını içeren TetActivator yapıları istek üzerine Weidinger laboratuarında temin edebilirsiniz. Transgenik zebrafish hatları üretimi için Transgenesis yöntemleri <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; DNA&#39;nın mikroenjeksiyon gerçekleştirilir istikrarlı transgenik zebrafish hatları Üretimi enjekte DNA&#39;nın erken embriyo ve sonraki germ-line ekleme içine oluşturur. Iki yöntem rutin zebrabalıkları etkin germ-line dönüşüm elde etmek için kullanılmıştır: I-SceI meganuclease 14 kullanılarak plazmid entegrasyon verimliliği i) arttırılması ve ii) Tol2 transgenesis 15 transpozon aracılı. ilk olarak plasmid doğrusallaştırılması ile sonuçlanır ve böylece konak genomu 16 plazmid entegrasyon etkinliğini arttırdığı düşünülür I-SceI meganuclease proteini ile birlikte plazmid DNA ko-enjeksiyon dayanır. ikinci genomuna transposaz aracılı entegrasyon için Tol2 transpoze edilebilir elemanları ihtiva eden bir DNA ile birlikte tol2 transposaz RNA eş enjekte edilmesini gerektirir. Tol2 aracılı transgenezi stratejisi, genel olarak &lt;, daha etkili olduğu ve büyük DNA yapıları entegre etmek için kullanılabilir düşünülmektedirem&gt; örneğin, bakteriyel suni kromozomların (BAC&#39;ler) ya da P1 türevli suni kromozomları (PAC), ancak genellikle üniform sentezleme seviyeleri ve Mendel devralma gösteren stabil bir transgenik çizgiden kurulmasını yapabileceği çok sayıda genomik lokusları birden fazla tek kopya sokma sonuçlanır transgenin zaman alıcıdır. Buna karşılık, I-SceI meganuclease tekniği genellikle daha az verimli ve önerilmez BAC transgenesis için, ama bir tek genomik lokusta tek kopya veya tandem dizi transgen entegrasyonunu verir. Biz başarıyla fonksiyonel TetActivator veya TetResponder hatları oluşturmak için hem transgenesis yöntemlerini kullanmıştır. TetResponder transgen ifade analizi Yetişkin kanatçıklarda dokuya özel TetResponder transgen ekspresyonunu tespit etmek için genellikle cryosections floresan görüntüleme kullanımı. Bizim tecrübelerimize göre, transgen tarafından ifade floresan proteinleri floresan fixatio boyunca korunurn ve böylece prosedürü cryosectioning ve doğrudan görüntülenebilir. Başka bir yerde tarif edilmiştir TetResponder ekspresyonu, tespiti için ilave yöntemler şunlardır: bölümlerinde, ii), flüoresan veya kromojenik ISH bir anti-GFP antikor kullanılarak, tercihen burada floresan protein etiketi YPet karşı bölümleri üzerinde immün I) veya iii ) tüm montaj ISH kesit izledi.

Zebra balığı geliştirme, fizyoloji, hastalık ve yenilenme birçok yönlerini incelemek için iyi kurulmuş bir omurgalı model organizmadır. Gen ekspresyonu ya da sinyalleme yollarının indüklenebilir, dokuya özgü manipülasyon için post-embriyonik biyolojik süreçler, deney aletleri için bir model olarak zebrabalıkları artan kabulü ile giderek daha önemli hale gelmektedir. Özellikle yetişkin Zebra balığı organ ve apendiks rejenerasyon içine çalışmalar bu rejeneratif sürecinde sinyal yolları uzay-zamansal gereksinimleri diseksiyon için bir araç eksikliğinden muzdarip. Şu anda, üç farklı sistem koşullu, dokuya özgü, yetişkin zebrabalıkları organlarını rejenere içinde gen ekspresyonunu elde etmek için kullanılmıştır: Cre-lox sistemi, transpozon-aracılı somatik transgenesis kullanılarak ısı-şoku uyarılabilir transgenlerin mozaik ifadesi ve teton sistemi 1 -3. Teton bir tetrasiklin-CONT bir türevi anlamına gelirsentezleme antibiyotik tetrasiklin veya bunun bir türevini, örneğin doksisiklin mevcudiyetinde aktive haddelenmiş transkripsiyonel aktivasyon sistemi. Şimdiye kadar yetişkin balıklarda kullanıldıktan Cre-lox sistemi, ekspresyonu uzamsal dokuya özel düzenleyici elementler tarafından kısıtlanan bir Tamoksifen kontrollü Cre rekombinazın (CreERT2) dayanır. DUR kasetinin Cre güdümlü çıkarılması tüm hücre tipleri 1 aktif olması gereken bir promoter tarafından tahrik edilen ilgili gen ekspresyonunu kolaylaştırır. Mosaically ifade somatik transgenlerin transpozon aracılı oluşturma tek tek hücre soyları indüklenebilir transgen ifadesi için bir sistem sağlamaktadır. Tipik olarak sadece bir yenileyici organın 2 ayrı hücre soyları içinde transgeni taşıyan kimerik bireyde bir ısı şoku promotör sonuçları transkripsiyonel kontrolü altında ilgi konusu bir geni taşıyan bir Tol2 transpozonu sahip zebra balığı embriyoların enjeksiyonu. Her iki sistem şartlı doku SPE için izin ikenreli gen ifadesi, Cre-lox sistemi geri dönüşümlü değildir ve transpozon tabanlı klonal etiketleme kullanarak stratejisi stokastik doğası muzdarip. Böylece, ve diğerleri en son zamansal ve ilave ayarlanabilir ve geri 3-5 olan uzamsal olarak kontrollü gen ekspresyonu kolaylaştırmak zebrabalıkları kullanım için transgenik teton sistemleri, adapte edilmiştir. Burada kullanılan teton sistemi Doksisiklin (DOX) -inducible transkripsiyonel aktivatör (ters tetrasiklin transaktivatör, irtTA kısa Tet geliştirilmiş) dokuya-özgü genom düzenleyici dizilerin kontrolü altında olduğu bir transgenik sürücü hattı (TetActivator) içerir. (; TetRE Tet yanıt elemanı) (Şekil 1A) İkinci olarak, bir transgenik cevap hattı tetrasiklin operatör transkripsiyonel kontrolü altında ilgi konusu bir geni barındıran (TetResponder) gerektirir. Bu nedenle, TetActivator ve TetResponder hatları özel kombinasyonlarının kullanımı koşullu doku speci sağlargen ifadesinin fic manipülasyon. Biz son zamanlarda Zebra balığı kuyruk yüzgeci 3 yenileyici yetişkin Wnt / beta-katenin sinyalizasyon doku-spesifik fonksiyonlar için prob teton sistemini kullanmışlardır. Burada özetlenen protokolde yüzgeç yenilenme çalışmaları için özellikle zebrafish Teton sisteminin set-up ve kullanım için bir iş akışı açıklanmaktadır. Bu detaylı istikrarlı transgenik TetActivator ve TetResponder hatlarını oluşturmak için nasıl talimatlar ve embriyo ve yetişkin zebrabalıkları transgen indüksiyon için bir protokol içerir. Ayrıca, yetişkin zebrabalıkları kanatların cryosections hazırlanması için bir protokol içeren kanatçık yenilenme bölgesindeki dokuya özel gen ekspresyonunun doğrulanması için teknikler tarif eder. Ayrıca, TetResponder ifade TetActivator transgen tasarımı, bir transgenesis yönteminin seçimi ve tespiti için tartışılacaktır. Bu nedenle, bu protokolün genel amacı, bir plan olarak hizmet etmektirkurulma fonksiyonel teton sistemi zebrabalıkları daki herhangi bir dokuya uygulanabilir koşullu dokuya-özgü gen ekspresyonunu elde etmek için. Biz I-SceI veya kısa genomik düzenleyici diziler kullanılarak stabil TetActivator hatlarının Tol2 aracılı üretimi için izin veren bir TetActivator vektör oluşturduk (güçlendirici fragmanları; Weidinger laboratuar plazmid veritabanı henüz 1247;. Şekil 1B). Bu yapı, Herpes simpleks virüsü VP16 transaktivasyon alanı türev 3F [irtTAM2 (3F)] ile kaynaşmış ters Tet bastırıcı etki M2 mutant varyantı aşağıdakilerden oluşan bir TetActivator kaseti içerir. Bu ko-eksprese aynı açık okuma çerçevesi arasında fluorofor AmCyan sahip olduğu TetActivator (TETA) sentezlenmesi, kolayca izlenebilir; 1 oranında 5,6: a P2A peptit 1 ayrı proteinler olarak teta ve AmCyan üretimi ile sonuçlanmalıdır ribozomal atlama, aracılık eder. Bu yapı, T &#39;, bir poylinker 5 içeriretActivator kaseti, klasik klonlama yöntemleri kullanılarak ilgili genomik düzenleyici diziler sokulmasını kolaylaştırmak için. (Büyük bir genomik bölgeyi ihtiva eden bir bakteriyel yapay kromozom içine yeniden birleştirilebilir, (BAC), Buna ek olarak, yukarıda tarif edilen TetActivator kaset ve bir kanamisin seçme kaseti (Şekil 1C. Weidinger laboratuar plazmid veri tabanında bir 1180) &#39;den oluşan bir yapı oluşturduk Genellikle ekspresyon paterni olan transgen tarafından taklit edilecek) bir genin başlangıç ​​kodonunun halinde. Her iki yapılar istek üzerine Weidinger laboratuarında temin edebilirsiniz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breeding boxes</td>
			<td>Aqua Schwarz</td>
			<td>AquaBox 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound fluorescent microscope</td>
			<td>e.g. Leica, Zeiss</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>to image fluorescent tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>e.g. Leica, Zeiss</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>to image fluorescent tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>e.g. Leica, Thermo-Scientific</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use 1/5000 in PBS 
			for visualization of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) 
			for TetResponder induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2&#903; 2 H2O, 0.33 mM MgSO4&#903;7 H2O, 0.2 &#8240; (w/v) methylene blue, pH 6.5 
			for embryo/larvae husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4 % (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 
			for fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphat-buffer saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x PBS with 0.1 % Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>1014356190</td>
			<td>for collection of tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescent microscope</td>
			<td>e.g. Leica, Zeiss</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>for fluorescence-based genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>e.g. Biorad, Applied Biosystems</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>for PCR-based genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium (TFM)</td>
			<td>Triangel Biomedical Sciences</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td>for embedding of tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>for anesthesia 
			use at 1 mg/ml in E3 embryo medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the teton system to study molecular mechanisms of zebrafish regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Dokuya özel olarak uyanlabilir bir gen ekspresyonu, transgenik TetActivator ve TetResponder hatları için işlevsel teton sistemi kurmak için, üretilen (Şekil 1A) olması gerekir. Erken zebra balığı embriyolar ve daha sonra mikrop hattı entegrasyon inşa ya TetResponder (Şekil 1E) - Bu TetActivator (Cı Şekil 1B) microinjecting ile gerçekleştirilir. Fonksiyonel TetActivator konstruktları, ya ilgili gen (Şekil 1C) düzenleyici elemanları ihtiva eden bir BAC içerisine TetActivator kaseti tekrar birleştirilmesi ile TetActivator kaseti (Şekil 1B) yukarı akış yönünde, kısa düzenleyici diziler (güçlendirici elemanlar) arasında klonlama ile elde edilebilir. TetActivator yapısının Germlin birleşmesi münferit Tahmini ifade düzenine (Şekil 1D) G0 balık ve F1 embriyolarda AmCyan floresan görünümünü enjekte döllenmedir ile değerlendirilebilir. Germline INTEG, DOX ve YFP / YPet floresan (Şekil 1F) ortaya çıkması ile muamele edilir: rasyon ve TetResponder transgenin işlevselliği (Tet AmCyan ubikitin Burada) kurulan TetActivator balık bireysel G0 enjekte balık geçiş ile değerlendirilebilir. Güçlü ve homojen YFP / YPet ifadesini gösteren Balık istikrarlı TetResponder hattı (Şekil 1G) kurmak için tercih edilmelidir. Kurulan stabil TetActivator ve TetResponder balık hatları özel TetActivator / TetResponder kombinasyonlarına sahip çaprazlanmasıyla yaratılabilir. TetActiator ve TetResponder transjenlerin Taşıyıcılar TetActivator aktif gelişim aşamasında (Şekil 1H) de YFP / Ypet of DOX tedavi sonu çıkması aşağıdaki embriyogenez sırasında tespit edilebilir. Alternatif olarak, çift transgenik balık DOX tedavi ve yenileyici kuyruk yüzgecinin içinde TetResponder transgen indüksiyon (- B Şekil 2A) Aşağıdaki tespit edilebilir. &lt;<html> p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Biz rutin yenileyici Zebra balığı kuyruk yüzgecinin indüklenebilir, doku spesifik gen ifadesi elde etmek için bu sistemi kullanabilirsiniz. Bir yenilenme etkinliğini farklı doku bölmeleri açıkça bu zaman noktası (Şekil 2C) doku-kesitlerinde tespit edilebilir beri, 3 dpa fin yeniden üretilen cryosections floresans görüntüleme dokuya özgü TetResponder transgen ekspresyonunu kontrol edin. Boyuna ve enine yüzgeç yeniden bölümleri doku soğukta koruyucu ve yüzgeç uygun (Şekil 2D) yeniden yerleştirme sonrası cryosectioning ile elde edilir. Kesit ardından TetResponder transgen ifadesi (Ypet / YFP floresan) floresan veya konfokal mikroskobu (Şekil 2E) kullanılarak görüntülenebilir. Distal blastema (ok başı) ve epidermisin (ok) ifade yoksun ise her4.3 promotör-tahrikli TetActivator, proksimal medyal blastem içinde TetResponder ekspresyonunu indükler unutmayın. &gt; &quot;ove_content <img alt="Şekil 1A" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1A.jpg" /> <img alt="Şekil 1B" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1B.jpg" /> <img alt="Şekil 1C" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1C.jpg" /> <img alt="Şekil 1D" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1D.jpg" /> <img alt="Şekil 1E" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1E.jpg" /> <img alt="Şekil 1F" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1F.jpg" /> <img alt="Şekil 1G" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1G.jpg" /> <img alt="Şekil 1H" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1H.jpg" /> Şekil 1: Transgenik TetActivator ve TetResponder hatlarının üretimi. (A) Çizgi teton sistemi kullanılarak dokuya özel olarak uyanlabilir bir gen ifadesi için stratejiyi gösteren. (B) transgenik TetActivator (Weidinger laboratuvar plazmid veritabanı hayır. 1247) yaparız. 5 &#39;TetActivator irtTAM2 (3F) ihtiva eden bir poli-C kolaylaştırırilgi düzenleyici sekansların Cloning. AmCyan kodlama sekansı, bir P2A öz-yarma &#39;peptid ile TetActivator ayrılır. kaseti, Tol2 transpozon ters çevrilmiş tekrarlar ile çevrili bir SV40 poliadenilasyon sinyali içerir ve tek bir I-SceI meganuclease tanıma sitesini içermektedir. BAC recombineering için (C) TetActivator kaset (Weidinger laboratuvar plazmid veritabanı hayır. 1180). Kaset, GB 3 prokaryotik promotör ile tahrik edilir seçimi için Kanamisin genini içerir. Kanamisin&#39;e direnç geni komşu FRT siteleri BAC içine başarılı bir şekilde entegre Aşağıdaki ifade Flp rekombinaz aracılı çıkarılması için izin verir. (D) her4.3 verici G0 kurucu balık Kimlik: Tet AmCyan onların germ-line üzerinden yaparız. Taşıyıcılar bazı F1 embriyoların (ok başları) AmCyan floresan çıkması yoluyla tespit edilir. (E) transgenik TetResponder (Weidinger laboratuvar plazmid veritabanı hayır. 1444) yaparız.Bu inşa optimize Tet tepki elemanlarının kontrolü altında, bir poli-ve YPet CDS oluşur (TetRE geçirmez Clontech) ve SV40 poliadenilasyon sinyali ile sona erdirildi. Bu Tol2 transpozon ters tekrarlar tarafından çevrili ve tek bir I-SceI meganuclease tanıma sitesini içerir. Fonksiyonel TetResponder TetRE ileten G0 kurucu balık (F) Kimlik: Axin1-YFP kendi germline ile yaparız. 6 saat (ok başları) için DOX tedavisi sonrasında YFP floresans ve indüksiyonu: Taşıyıcı kurulu bir TetActivator (Tet AmCyan burada ubikuitin) çizgi ile melezlenerek tanımlanır. (G) DOX tedavi 12 saatlik bir toplam sonra (F) &#39;de gösterilen ofembryos kadar kapatın. YFP floresans oldukça yerde indüksiyon edin. Ve TetResponder (TetRE: Axin1-YFP) transgenleri (ok başları): TetActivator (Tet AmCyan her4.3) taşıyan iki transgenik embriyo (lH) tanımlanması. Biz Embriyolar6 saat DOX ile muamele yeniden. (A - H) Ölçek çubuğu: 500 mikron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52756/52756fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2A," src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2A.jpg" /> <img alt="Şekil 2B" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2B.jpg" /> <img alt="Şekil 2C" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2C.jpg" /> <img alt="Şekil 2D" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2D.jpg" /> <img alt="Şekil 2E" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2E.jpg" /> Şekil 2: rejenere zebra balığı kuyruk fin dokuya özel gen ekspresyonu için teton sisteminin kullanımı. Yetişkin zebrafish DOX tedavisinde kullanılan (A) Damızlık kutuları. TetRE (B) indüksiyonu: her4.3 göre Axin1-YFP TetResponder transgen: Tet AmCyan TetActivatoryenileyici kuyruk yüzgecinin içinde DOX tedavisinin 12 saat takip. EtOH ile muamele edilmiş kontrol balık YFP floresans olmadığına dikkat edin. (C) Çizgi, uzunlamasına bir kesit görünümü 3 dpa bir kanatçık yenilenme içinde bulunan doku bölmelerin bir görünümüdür. Cryosectioning (D) örnek hazırlama. Fin yeniler doku dondurma ortamı (TFM) yerleştirilmiştir, yenilenen uzunlamasına veya enine ya da bölümleri elde etmek için uygun bir şekilde yönlendirilmiş cryomolds, dolgulu ve TFM katılaşana kadar kuru buz üstünde oturan bir metal raf aktarılır. Kesit düzlemi kırmızı belirtilir. Kısaltmalar: dist .: uzak, prox .: proksimal, havalandırma .: ventral, .: dorsal Dors&#39;a. (B) &#39;de gösterilen kanatlar türetilmiş bir kanatçık ışını yenilenme bir uzunlamasına kesitini YFP floresans (E) Konfokal görüntüsü. Tet AmCyan TetActivator hat proksimal-medial blastem özel olarak YFP indüksiyon sürücüler: her4.3 unutmayın. YFPfloresan yara epidermis (ok) ve mezenşimin (ok başı) (BC) Ölçek çubuğu distal-en etki de dahil olmak üzere, bölmelerin çeşitli tespit edilmediğinde: 500 mikron; (E) Ölçek çubuğu:. 100 mikron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52756/52756fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> TetActivator hattı </td><td> Referans </td><td> Düzenleyici elemanlar kullanılan </td><td> Öncelikle ifade </td></tr><tr><td> 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan </td><td> Yayınlanmamış Wehner &amp; Weidinger, </td><td> 7xTCF-Xla.Siam Wnt muhabiri 1 </td><td> Wnt-duyarlı dokularda </td></tr><tr><td> myl7: irtTAM2 (3F) -p2a mCherry </td><td> Yayınlanmamış Haase &amp; Weidinger, </td><td> myl7 (cmlc2) 2 </td><td> olgun Kardiyomiyositlerde </td></tr><tr><td> her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 </td><td align="right"> 3 </td><td> her4.3 4 </td><td> Merkezi sinir sistemi </td></tr><tr><td> keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 </td><td align="right"> 3 </td><td> keratin4 5 </td><td> epidermis, yetişkin fin bazal tabaka hariç </td></tr><tr><td> keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 </td><td align="right"> 3 </td><td> keratin18 6 </td><td> epidermis bazal tabakasında sadece yetişkin fin </td></tr><tr><td> SP7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 </td><td align="right"> 3 </td><td> SP7 / osx 7 </td><td> (Taahhüt) osteoblastlar </td></tr><tr><td> ubikitin: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 </td><td align="right"> 3 </td><td> übikitin 8 </td><td> (Oldukça) her yerde </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Mevcut transgenik TetActivator hatları Bu tablo transgenik TetActiva listeleristeğe bağlı olarak Weidinger laboratuar edin Hem embriyonik ve yetişkin balık TetActivator dokuya özel ekspresyon için tor hatları.

Watch this Scientific Journal Video about Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration at JoVE.com

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

use-teton-system-to-study-molecular-mechanisms-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K Görüntüleme.  Ulm University. Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Video: Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Gelişim Biyolojisi

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Zebra balığı embriyo, dinamik, kararlı ve doğmakta olan mikrotübüller analiz etmek için Immunolabeling kullanımı

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Rejenerasyon Stentor içinde çalışma yöntemleri

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The continuously growing mouse incisor provides an excellent model to study tissue-specific stem cells. The epithelial tissue-specific stem cells of the incisor are located at the proximal end of the tooth in a niche called the cervical loop. They provide a continuous influx of cells to counterbalance the constant abrasion of the self-sharpening tip of the tooth. Presented here is a detailed protocol for the isolation and culture of the proximal end of the mouse incisor that houses stem cells and their niche. This is a modified Trowell-type organ culture protocol that enables in vitro culture of tissue pieces (explants), as well as the thick tissue slices at the liquid/air interface on a filter supported by a metal grid. The organ culture protocol described here enables tissue manipulations not feasible in vivo, and when combined with the use of a fluorescent reporter(s), it provides a platform for the identification and tracking of discrete cell populations in live tissues over time, including stem cells. Various regulatory molecules and pharmacological compounds can be tested in this system for their effect on stem cells and their niches. This ultimately provides a valuable tool to study stem cell regulation and maintenance.

The Trowell-type organ culture method has been used to unravel complex signaling networks that govern tooth development and, more recently, for studying regulation involved in stem cells of the continuously growing mouse incisor. Fluorescent-reporter animal models and live-imaging methods facilitate in-depth analyses of dental stem cells and their specific niche microenvironment.

Trowell Tipi Organ Kültürünün Diş Kök Hücrelerinin Düzenlenmesini Incelemek İçin Kullanılması

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control over gene expression timing, location, and amplitude using light as the inducing agent. In this protocol, an optogenetic expression system is used to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos. This system relies on an engineered transcription factor called TAEL based on a naturally occurring light-activated transcription factor from the bacterium E. litoralis. When illuminated with blue light, TAEL dimerizes, binds to its cognate regulatory element called C120, and activates transcription. This protocol uses transgenic zebrafish embryos that express the TAEL transcription factor under the control of the ubiquitous ubb promoter. At the same time, the C120 regulatory element drives the expression of a fluorescent reporter gene (GFP). Using a simple LED panel to deliver activating blue light, induction of GFP expression can first be detected after 30 min of illumination and reaches a peak of more than 130-fold induction after 3 h of light treatment. Expression induction can be assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and by fluorescence microscopy. This method is a versatile and easy-to-use approach for optogenetic gene expression.

Optogenetics is a powerful tool with wide-ranging applications. This protocol demonstrates how to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos using the blue light-responsive TAEL/C120 system.

Optogenetik TAEL/C120 Sistemini Kullanan Zebra Balığı Embriyolarında Işık Kaynaklı GFP İfadesi

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...