Los autores agradecen a Christa Haase, Doris Weber y Brigitte Korte para la asistencia técnica. El trabajo en el laboratorio Weidinger el apoyo de subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 y por la Deutsche Gesellschaft für Kardiologie través de un Oskar-Lapp-Stipendium y Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

<ol>
	<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+kit+ligand+a+functional+expression+reveals+lineage-specific+competence+to+promote+melanocyte+rescue+in+the+mutant+regenerating+caudal+fin.">Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin.</a> PloS one. 9 (7), e102317 (2014).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+defines+organizing+centers+that+orchestrate+growth+and+differentiation+of+the+regenerating+zebrafish+caudal+fin.">Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin.</a> Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).</li><li>Huang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines.">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li><li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos.">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li><li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish.">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li><li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish.">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines,+zebrafish+and+mice.">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556 (2011).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin.">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues.">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system.">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li><li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka.">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, (2007).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El pez cebra adulto tiene una asombrosa capacidad para regenerar con éxito a muchos órganos y apéndices internos. Un conocimiento profundo de los mecanismos moleculares y celulares implicados requiere un análisis específico de tejido de las funciones de genes y vías de señalización. Hacia esto, el sistema de Teton ofrece una herramienta eficaz para la expresión génica espaciotemporalmente controlada en el pez cebra embrionarias y adultas. Las construcciones del sistema de Teton y la metodología descritos en este manuscrito se han utilizado con éxito en un estudio reciente de nuestro laboratorio 3. Las siguientes cuestiones adicionales deben ser considerados cuando se establece el sistema de Teton: TetActivator consideraciones de diseño transgén Hemos demostrado previamente que un TetActivator de un solo inducible que consiste en la variante mutante M2 del dominio inverso represor Tet fusionado con el virus Herpes simplex VP16 transactivación-dominio derivado 3F [irtTAM2 (3F), in corto TETA-M2] confiere inducción eficiente, pero puede mostrar bajo, aunque leakiness medible, es decir fondo inducir la actividad en ausencia de doxiciclina (DOX) 5. Por lo tanto, hemos descrito dualmente sistemas inducibles utilizando fusiones con un receptor de glucocorticoides (TETA-GBD) o un dominio del receptor de ecdisona (EcR-TETA), que eliminan leakiness 5. Por lo tanto, si el sistema se utiliza para expresar proteínas tóxicas o muy potentes (por ejemplo, oncogenes) el uso de una variante doblemente inducible debe ser considerado. Alternativamente, durante el establecimiento de TetActivator y TetResponder líneas de una gama de líneas de producción diferentes niveles de expresión se puede seleccionar y inductores más débiles elegidos en caso de falta de estanqueidad es un problema con las líneas que inducen fuertemente. Construcciones TetActivator que contienen la variante Teta-GBD o Teta-EcR están disponibles en el laboratorio Weidinger bajo petición. Métodos de transgénesis para la generación de líneas transgénicas de pez cebra <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Generación de líneas de pez cebra transgénicos estables se logra mediante la microinyección de construcciones de ADN en el embrión temprano y la inserción de la línea germinal subsiguiente del ADN inyectado. Dos métodos se han utilizado de forma rutinaria para lograr la transformación de la línea germinal eficiente en el pez cebra: i) la mejora de la eficiencia de la integración del plásmido utilizando I-SCE meganucleasa 14, y ii) la transgénesis 15 Tol2 transposón mediada. El primero se basa en la co-inyección de ADN plásmido junto con la proteína de meganucleasa I-SceI, lo que resulta en la linealización del plásmido y por lo tanto se cree que aumenta la eficiencia de la integración del plásmido en el genoma huésped 16. Este último requiere co-inyección de Tol2 transposasa ARN junto con ADN que contiene elementos transponibles Tol2 para la integración mediada por transposasa en el genoma. La estrategia de la transgénesis mediada por Tol2 se piensa generalmente para ser más eficiente y se puede utilizar para integrar grandes construcciones de ADN, &lt;em&gt; por ejemplo, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) o cromosomas artificiales derivados de P1 (PACs), sin embargo con frecuencia se traduce en múltiples inserciones de una sola copia en varios loci del genoma, que puede hacer que el establecimiento de una línea transgénica estable que muestra los niveles de expresión de uniformes y la herencia mendeliana del transgén requiere mucho tiempo. Por el contrario, la técnica de meganucleasa I-SCE suele ser menos eficiente y no se recomienda para la transgénesis BAC, pero produce una sola copia o la integración del transgén disposición en tándem en un solo locus genómico. Hemos utilizado dos métodos de transgénesis para crear con éxito TetActivator o TetResponder líneas funcionales. Análisis de la expresión del transgen TetResponder Para detectar la expresión del transgen TetResponder específica de tejido en aletas adultos solemos utilizar imágenes fluorescentes de cryosections. En nuestra experiencia, la fluorescencia de las proteínas fluorescentes expresadas por el transgén se conserva en todo el FIXATIOn y cryosectioning procedimiento y por lo tanto se pueden obtener imágenes directamente. Los métodos adicionales para la detección de la expresión TetResponder, que se han descrito en otra parte, son: i) la inmunotinción de las secciones, preferiblemente en contra de la etiqueta de la proteína fluorescente, aquí YPet, utilizando un anticuerpo anti-GFP, ii) fluorescente o cromogénico ISH en secciones, o iii ) todo el montaje ISH seguido por el corte.

El pez cebra es un organismo vertebrado modelo bien establecido para estudiar muchos aspectos del desarrollo, fisiología, la enfermedad, y la regeneración. Con la creciente adopción de pez cebra como modelo para los procesos biológicos post-embrionarias, herramientas experimentales para la manipulación inducible, específico de tejido de la expresión génica o vías de señalización se han convertido cada vez más importante. En particular, los estudios sobre la regeneración de órganos y apéndice en el pez cebra adultos han sufrido de una falta de herramientas para la disección de los requisitos de espacio-temporales de las vías de señalización durante estos procesos regenerativos. Actualmente, tres sistemas diferentes se han utilizado para lograr condicional, expresión específica de tejido del gen en la regeneración de órganos del pez cebra adultos: el sistema Cre-lox, la expresión mosaico de choque térmico transgenes inducibles utilizando transgénesis somática mediada por transposón, y el sistema de téton 1 -3. Téton refiere a una variante de una tetraciclina-contsistema de activación transcripcional laminado, donde se activa la expresión en presencia del antibiótico tetraciclina o un derivado, por ejemplo, doxiciclina. El sistema Cre-lox, ya que hasta ahora se ha utilizado en peces adultos, se basa en una recombinasa Cre controlada por tamoxifeno (CreERT2), cuya expresión está restringida espacialmente por elementos reguladores específicos de tejido. Eliminación impulsado por Cre de un casete de STOP facilita la expresión del gen de interés dirigido por un promotor que debe ser activo en todos los tipos celulares 1. Creación transposón mediada de transgenes somáticas mosaically expresadas proporciona un sistema para la expresión del transgén inducible en linajes de células individuales. La inyección de embriones de pez cebra con un transposón Tol2 que lleva un gen de interés bajo el control transcripcional de un promotor de choque térmico resultados en individuos quiméricos típicamente llevan el transgén sólo en linajes de células discretas de un órgano de regeneración 2. Mientras que ambos sistemas permiten condicional tejido-spela expresión génica especí-, el sistema Cre-lox no es reversible, y la estrategia de etiquetado usando clonal basado en transposón sufre de su naturaleza estocástica. Por lo tanto, nosotros y otros han adaptado recientemente sistemas Teton transgénicas para su uso en el pez cebra, que facilitan temporal y la expresión génica controlada espacialmente que está en sintonizable Además y reversible 3-5. El sistema de Teton utilizado aquí comprende una línea piloto transgénico (TetActivator) en el que un doxiciclina (DOX) activador transcripcional inducible (mejoró transactivador de tetraciclina inversa, irtTA, corta TETA) está bajo el control de secuencias reguladoras genómicas específicas de tejido. En segundo lugar, se requiere una línea transgénica respondedor (TetResponder) que alberga un gen de interés bajo el control transcripcional del operador de tetraciclina (Tet elemento de respuesta; Tetre) (Figura 1A). Por lo tanto, el uso de combinaciones específicas de TetActivator y TetResponder líneas permite condicional tejido-específicaFIC manipulación de la expresión génica. Hemos utilizado recientemente el sistema téton para sondar para las funciones específicas de tejido de señalización Wnt / beta-catenina en el adulto regeneración de cola de pez cebra de la aleta 3. En el protocolo descrito aquí se describe un flujo de trabajo para la puesta a punto y la utilización del sistema de Teton en el pez cebra, en particular, para el estudio de la regeneración de la aleta. Esto incluye instrucciones detalladas sobre cómo generar líneas TetActivator y TetResponder transgénicas estables y un protocolo para la inducción del transgen en embriones de pez cebra y adulto. Además, se describen técnicas para la verificación de la expresión génica específica de tejido en los regenerados aleta, incluyendo un protocolo para la preparación de criosecciones de aletas de pez cebra adultos. Adicionalmente, se discuten consideraciones para el diseño del transgén TetActivator, la elección de un método de transgénesis, y detección de la expresión TetResponder. Por lo tanto, el objetivo general de este protocolo es la de servir como modelopara el establecimiento de un sistema de seguimiento téton funcional en el pez cebra para lograr la expresión de genes condicional específica de tejido, que se puede aplicar a cualquier tejido de interés. Hemos creado un vector TetActivator permitiendo I-SCE o la generación mediada Tol2 de líneas TetActivator estables utilizando secuencias reguladoras genómicas cortas (fragmentos potenciador; Weidinger base de datos plásmido laboratorio no 1247;. Figura 1B). Este constructo contiene un casete TetActivator que consiste en la variante mutante M2 del dominio inverso represor Tet fusionado con el virus Herpes simplex VP16 transactivación-dominio derivado 3F [irtTAM2 (3F)]. Expresión de la TetActivator (TETA) se puede monitorizar fácilmente ya que es co-expresada con la AmCyan fluoróforo desde el mismo marco de lectura abierto; un péptido p2a media saltar ribosomal, que debería dar lugar a la producción de la Teta y AmCyan como proteínas separadas en una relación 1: 5,6 1. El constructo también contiene un poylinker 5 &#39;de la TetActivator casete para facilitar la inserción de secuencias reguladoras genómicas de interés usando métodos de clonación convencionales. Además, hemos creado un constructo que consiste en el casete descrito anteriormente TetActivator además de un casete de selección de kanamicina (Weidinger base de datos plásmido laboratorio no 1180;. Figura 1C), que puede ser recombinado en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que contiene una gran región genómica ( por lo general en el codón de inicio de un gen cuya expresión patrón es para ser imitado por el transgén). Ambas construcciones están disponibles en el laboratorio de Weidinger bajo petición.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breeding boxes</td>
			<td>Aqua Schwarz</td>
			<td>AquaBox 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound fluorescent microscope</td>
			<td>e.g. Leica, Zeiss</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>to image fluorescent tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>e.g. Leica, Zeiss</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>to image fluorescent tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>e.g. Leica, Thermo-Scientific</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>for cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use 1/5000 in PBS 
			for visualization of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) 
			for TetResponder induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2&#903; 2 H2O, 0.33 mM MgSO4&#903;7 H2O, 0.2 &#8240; (w/v) methylene blue, pH 6.5 
			for embryo/larvae husbandry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4 % (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 
			for fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphat-buffer saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x PBS with 0.1 % Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>1014356190</td>
			<td>for collection of tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo fluorescent microscope</td>
			<td>e.g. Leica, Zeiss</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>for fluorescence-based genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>e.g. Biorad, Applied Biosystems</td>
			<td>varies with the manufacturer</td>
			<td>for PCR-based genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue freezing medium (TFM)</td>
			<td>Triangel Biomedical Sciences</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td>for embedding of tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>for anesthesia 
			use at 1 mg/ml in E3 embryo medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the teton system to study molecular mechanisms of zebrafish regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Establecer un sistema de Teton funcional para la expresión génica inducible específico de tejido, TetActivator transgénicos y líneas TetResponder necesitar ser generado (Figura 1A). Esto se logra mediante la microinyección de TetActivator (Figura 1B - C) o TetResponder (Figura 1E) constructos en embriones de pez cebra temprana y posterior integración de la línea germinal. Construcciones TetActivator funcionales pueden ser generados ya sea por clonación de secuencias reguladoras cortos (elementos potenciadores) aguas arriba de la casete de TetActivator (Figura 1B), o por recombinación de la casete TetActivator en un BAC que contiene elementos reguladores del gen de interés (Figura 1C). La integración de la línea germinal del constructo TetActivator puede ser evaluada por cruzamiento individuo inyecta pescado G0 y la apariencia de AmCyan fluorescencia en embriones F1 en el patrón de expresión esperado (Figura 1D). Integ línea germinalración y la funcionalidad del transgén TetResponder pueden ser evaluados por el cruce de G0 peces individuales inyectado para los peces TetActivator establecido (aquí ubiquitina: TETA AmCyan), seguido de tratamiento con DOX y la apariencia de YFP / YPet de fluorescencia (Figura 1F). Se debe preferir pescado mostrando fuerte y homogénea expresión YFP / YPet para establecer una línea TetResponder estable (Figura 1G). Tener TetActivator estable establecido y líneas de pescado TetResponder, combinaciones específicas TetActivator / TetResponder puede ser generado por el cruce. Los portadores de TetActiator y TetResponder transgenes pueden ser identificados durante la embriogénesis después de finalizado el tratamiento DOX surgimiento de YFP / Ypet en la etapa de desarrollo del TetActivator está activo (Figura 1H). Alternativamente, los peces transgénicos dobles pueden ser identificados después del tratamiento DOX y TetResponder inducción transgén en la aleta caudal regeneración (Figura 2 A - B). &lt;<html> p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Utilizamos rutinariamente este sistema para lograr inducible, la expresión de genes específicos de tejido en la regeneración de aleta de la cola de pez cebra. Verificamos los tejidos específicos de expresión del transgen TetResponder por imágenes de fluorescencia de cryosections de 3 dpa regenera aletas, ya que los diferentes compartimentos de tejido de un regenerado pueden identificarse claramente en secciones de tejido en este punto de tiempo (Figura 2C). Aleta longitudinal o transversal regenerar secciones se obtienen por cryosectioning después de crioprotector tejido y la incrustación de aleta regenerar adecuadamente (Figura 2D). Después de seccionamiento, la expresión del transgen TetResponder (Ypet / YFP fluorescencia) se pueden obtener imágenes mediante fluorescencia o microscopía confocal (Figura 2E). Tenga en cuenta que la TetActivator promotor impulsado her4.3 induce la expresión TetResponder en el blastema proximal medial, mientras que el blastema distal (punta de flecha) y la epidermis (flecha) están desprovistos de expresión. ove_content &quot;&gt; <img alt="Figura 1A" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1A.jpg" /> <img alt="Figura 1B" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1B.jpg" /> <img alt="Figura 1C" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1C.jpg" /> <img alt="Figura 1D" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1D.jpg" /> <img alt="Figura 1E" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1E.jpg" /> <img alt="Figura 1F" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1F.jpg" /> <img alt="Figura 1G" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1G.jpg" /> <img alt="Figura 1H" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1H.jpg" /> Figura 1: Generación de líneas TetActivator y TetResponder transgénicos. (A) de dibujos animados que muestra la estrategia para la expresión génica inducible específico de tejido utilizando el sistema de Teton. (B) Transgénicos TetActivator construir (Weidinger base de datos plásmido laboratorio no. 1247). Un polienlazador 5 &#39;del TetActivator irtTAM2 (3F) facilita cLoning de secuencias reguladoras de interés. La secuencia codificante de AmCyan se separa de la TetActivator través de un péptido p2a &#39;auto-escisión&#39;. El cassette también contiene una señal de poliadenilación de SV40, está flanqueada por Tol2 transposón invertida repite y contiene un único sitio de reconocimiento de meganucleasa I-SCE. (C) casete TetActivator para recombinería BAC (Weidinger base de datos plásmido laboratorio no. 1180). El casete incluye el gen de la kanamicina para la selección, que es impulsado por un promotor procariota gb3. Sitios FRT que flanquean el gen de resistencia a kanamicina permiten su eliminación mediada Flp recombinasa siguiente integración exitosa en la CAPV. (D) Identificación de G0 fundador peces transmitir la her4.3: Teta AmCyan construir a través de su línea germinal. Carriers se identifican a través de aparición de fluorescencia AmCyan en algunos embriones F1 (puntas de flecha). (E) Transgénicos TetResponder construir (Weidinger base de datos plásmido laboratorio no. 1444).Esto construye consta de un polienlazador y YPet CDS bajo el control de los elementos de respuesta Tet optimizados (Tetre estanco, Clontech) y terminado por la señal de poliadenilación de SV40. Está flanqueada por Tol2 transposón invertida repite y contiene un único sitio de reconocimiento de meganucleasa I-SCE. (F) La identificación de G0 peces fundador transmitir un funcional TetResponder Tetre: Axin1-YFP construir a través de su línea germinal. Los transportistas se identifican mediante el cruce con una línea establecida TetActivator (aquí ubiquitina: Teta AmCyan) y la inducción de YFP fluorescencia después del tratamiento DOX durante 6 horas (puntas de flecha). (G) Cierre de ofembryos mostrados en (F) después de un total de 12 horas de tratamiento DOX. Nota inducción bastante ubicua de YFP fluorescencia. (H) La identificación de embriones transgénicos dobles que llevan TetActivator (her4.3: Teta AmCyan) y TetResponder (Tetre: Axin1-YFP) transgenes (puntas de flecha). Los embriones nosotrosestás tratados con DOX durante 6 horas. (A - H) Barra de escala: 500 m <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52756/52756fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2A" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2A.jpg" /> <img alt="Figura 2B" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2B.jpg" /> <img alt="Figura 2C" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2C.jpg" /> <img alt="Figura 2D" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2D.jpg" /> <img alt="Figura 2E" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2E.jpg" /> Figura 2: El uso del sistema téton para la expresión génica específica de tejido en la regeneración de aleta de cola de pez cebra. (A) cajas de cría utilizados para el tratamiento DOX de adultos de pez cebra. (B) La inducción de Tetre: Axin1-YFP TetResponder transgén por el her4.3: Teta AmCyan TetActivatoren la aleta caudal regeneración tras 12 horas de tratamiento DOX. Nótese la ausencia de YFP fluorescencia en los peces de control tratados con EtOH. (C) la historieta que representa algunos de los compartimentos de tejido que se encuentra dentro de un regenerado aleta en 3 dpa en una vista en sección longitudinal. (D) Preparación de muestras para cryosectioning. Regenera Fin se colocan en un medio de congelación de tejido (TFM), repleto criomoldes, orientados adecuadamente para obtener secciones ya sea longitudinal o transversal de los regenerados, y se transfieren a un estante de metal se sienta encima de hielo seco hasta TFM ha solidificado. Plano de sección se indica en rojo. Abreviaturas: dist .: distal, prox .: proximales, ventilación .: ventral, Dors .: dorsal. (E) Confocal imagen de YFP fluorescencia en una sección longitudinal de un regenerado ray aleta derivado de aletas mostradas en (B). Tenga en cuenta que la her4.3: Línea Teta AmCyan TetActivator impulsa YFP inducción específicamente en el blastema proximal medial. YFPfluorescencia no se detecta en una variedad de compartimientos, incluyendo la epidermis herida (flecha), y el más distal de dominio del mesénquima (punta de flecha) (BC) Barra de escala: 500 micras; (E) Barra de escala:. 100 m <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52756/52756fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Línea TetActivator </td><td> Referencia </td><td> Los elementos reguladores utilizados </td><td> Principalmente expresado en </td></tr><tr><td> 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan </td><td> Wehner y Weidinger, inédito </td><td> 7xTCF-Xla.Siam Wnt reportero 1 </td><td> Wnt-tejidos sensibles </td></tr><tr><td> myl7: irtTAM2 (3F) -p2a-mCherry </td><td> Haase y Weidinger, inédito </td><td> myl7 (cmlc2) 2 </td><td> cardiomiocitos maduros </td></tr><tr><td> her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 </td><td align="right"> 3 </td><td> her4.3 4 </td><td> sistema nervioso central </td></tr><tr><td> keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 </td><td align="right"> 3 </td><td> keratin4 5 </td><td> epidermis, en la aleta de adultos con exclusión de la capa basal </td></tr><tr><td> keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 </td><td align="right"> 3 </td><td> keratin18 6 </td><td> epidermis, en la aleta adulto exclusivamente en la capa basal </td></tr><tr><td> sp7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 </td><td align="right"> 3 </td><td> sp7 / OSX 7 </td><td> (Comprometido) osteoblastos </td></tr><tr><td> ubiquitina: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 </td><td align="right"> 3 </td><td> ubiquitina 8 </td><td> (Bastante) ubicua </td></tr></tbody></table> Tabla 1:. TetActivator líneas transgénicas disponibles Esta tabla muestra TetActiva transgénicolíneas tor para la expresión específica de tejido de la TetActivator tanto en peces embrionarias y adultas, que están disponibles desde el laboratorio Weidinger bajo petición.

Watch this Scientific Journal Video about Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration at JoVE.com

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

El uso del Sistema de Teton para estudiar los mecanismos moleculares de la regeneración de pez cebra

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

use-teton-system-to-study-molecular-mechanisms-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K vistas.  Ulm University. Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Video: Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Desarrollo de un Modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el Estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Química la amputación y la regeneración de la faringe en el Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Métodos para el estudio de la regeneración en Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The continuously growing mouse incisor provides an excellent model to study tissue-specific stem cells. The epithelial tissue-specific stem cells of the incisor are located at the proximal end of the tooth in a niche called the cervical loop. They provide a continuous influx of cells to counterbalance the constant abrasion of the self-sharpening tip of the tooth. Presented here is a detailed protocol for the isolation and culture of the proximal end of the mouse incisor that houses stem cells and their niche. This is a modified Trowell-type organ culture protocol that enables in vitro culture of tissue pieces (explants), as well as the thick tissue slices at the liquid/air interface on a filter supported by a metal grid. The organ culture protocol described here enables tissue manipulations not feasible in vivo, and when combined with the use of a fluorescent reporter(s), it provides a platform for the identification and tracking of discrete cell populations in live tissues over time, including stem cells. Various regulatory molecules and pharmacological compounds can be tested in this system for their effect on stem cells and their niches. This ultimately provides a valuable tool to study stem cell regulation and maintenance.

The Trowell-type organ culture method has been used to unravel complex signaling networks that govern tooth development and, more recently, for studying regulation involved in stem cells of the continuously growing mouse incisor. Fluorescent-reporter animal models and live-imaging methods facilitate in-depth analyses of dental stem cells and their specific niche microenvironment.

Uso del cultivo de órganos tipo Trowell para estudiar la regulación de las células madre dentales

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control over gene expression timing, location, and amplitude using light as the inducing agent. In this protocol, an optogenetic expression system is used to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos. This system relies on an engineered transcription factor called TAEL based on a naturally occurring light-activated transcription factor from the bacterium E. litoralis. When illuminated with blue light, TAEL dimerizes, binds to its cognate regulatory element called C120, and activates transcription. This protocol uses transgenic zebrafish embryos that express the TAEL transcription factor under the control of the ubiquitous ubb promoter. At the same time, the C120 regulatory element drives the expression of a fluorescent reporter gene (GFP). Using a simple LED panel to deliver activating blue light, induction of GFP expression can first be detected after 30 min of illumination and reaches a peak of more than 130-fold induction after 3 h of light treatment. Expression induction can be assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and by fluorescence microscopy. This method is a versatile and easy-to-use approach for optogenetic gene expression.

Optogenetics is a powerful tool with wide-ranging applications. This protocol demonstrates how to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos using the blue light-responsive TAEL/C120 system.

Expresión de GFP inducida por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...