Name: use of the teton system to study molecular mechanisms of zebrafish regeneration
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
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Gli autori ringraziano Christa Haase, Doris Weber e Brigitte Korte per l&#39;assistenza tecnica. Il lavoro in laboratorio Weidinger è sostenuto da finanziamenti della Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 e dalla Deutsche Gesellschaft für Kardiologie tramite un Oskar-Lapp-Stipendium e Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il zebrafish adulto ha una straordinaria capacità di rigenerare con successo molti organi interni e appendici. Una conoscenza approfondita dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti richiede un&#39;analisi tessuto-specifica delle funzioni dei geni e vie di segnalazione. Verso questo, il sistema di Teton fornisce un efficace strumento per l&#39;espressione genica controllata spatiotemporally in zebrafish embrionali e adulte. I costrutti sistema Teton e metodologie descritte in questo manoscritto sono stati utilizzati con successo in un recente studio del nostro laboratorio 3. I seguenti problemi supplementari devono essere considerati quando si stabilisce il sistema di Teton: TetActivator Considerazioni sulla progettazione transgene Abbiamo precedentemente dimostrato che un singolo TetActivator-inducibile consistente della variante mutante M2 del dominio repressore inverso Tet fuso con il virus Herpes simplex VP16 transactivation dominio derivato 3F [irtTAM2 (3F), in breve Teta-M2] conferisce induzione efficiente, ma può mostrare bassa, anche se leakiness misurabile, vale sfondo inducendo l&#39;attività in assenza di doxiciclina (DOX) 5. Pertanto, abbiamo descritto doppiamente sistemi inducibili mediante fusioni con un recettore glucocorticoide (teta-GBD) o in un dominio del recettore ecdisone (teta-ECR), che eliminano leakiness 5. Così, se si intende utilizzare il sistema per esprimere proteine ​​tossiche o molto potenti (per esempio, oncogeni) l&#39;uso di una variante doppiamente inducibile dovrebbe essere considerato. In alternativa, durante la creazione di linee TetActivator e TetResponder possibile selezionare una serie di linee di produzione differenti livelli di espressione e induttori più deboli scelti in caso leakiness è un problema con le linee fortemente che inducono. Costrutti TetActivator contenenti la variante Teta-GBD o teta-ECR sono disponibili presso il laboratorio Weidinger su richiesta. Metodi transgenesi per la generazione di linee di zebrafish transgenici <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Generazione di linee di zebrafish transgeniche stabili è compiuta da microiniezione di DNA costruisce in embrione precoce e il successivo inserimento germinale del DNA iniettato. Due metodi sono stati regolarmente utilizzati per realizzare efficiente trasformazione della linea germinale in zebrafish: i) miglioramento dell&#39;efficienza integrazione plasmide usando I-SCEI meganuclease 14, e ii) transgenesi 15 Tol2 trasposoni-mediata. Il primo si basa su co-iniezione di DNA plasmidico insieme con I-SCEI proteine ​​meganuclease, che si traduce in linearizzazione del plasmide e quindi è pensato di aumentare l&#39;efficienza di integrazione plasmide nel genoma dell&#39;ospite 16. Quest&#39;ultimo richiede co-iniezione di tol2 trasposasi RNA insieme con il DNA contenente Tol2 elementi trasponibili per l&#39;integrazione trasposasi-mediata nel genoma. La strategia di transgenesi Tol2-mediata è generalmente pensato per essere più efficiente e può essere utilizzato per integrare grandi costrutti di DNA, &lt;em&gt; ad esempio, cromosomi artificiali batterici (BAC) o cromosomi artificiali P1-derivato (PAC), però spesso si traduce in molteplici inserimenti singola copia in diversi loci genomici, che può rendere istituzione di una linea transgenica stabile che mostra i livelli di espressione uniforme e eredità mendeliana del transgene tempo. Al contrario, la tecnica meganuclease I-SCEI è solitamente meno efficiente e non raccomandato per BAC transgenesi, ma produce singola copia o array tandem integrazione transgene in un unico locus genomico. Abbiamo usato entrambi i metodi transgenesi per creare con successo linee TetActivator o TetResponder funzionali. TetResponder analisi espressione del transgene Per rilevare l&#39;espressione del transgene TetResponder tessuto-specifica in pinne adulti usiamo solitamente per immagini a fluorescenza di criosezioni. Nella nostra esperienza, la fluorescenza di proteine ​​fluorescenti espresse dal transgene è conservato per tutta la fixation e criosezionamento procedura e quindi può essere ripreso direttamente. Metodi aggiuntivi per il rilevamento di espressione TetResponder, che sono stati descritti altrove, sono: i) immunocolorazione su sezioni, preferibilmente contro il tag proteina fluorescente, qui YPet, utilizzando un anticorpo anti-GFP, ii) ISH fluorescenti o cromogenico sulle sezioni, o iii ) tutto il montaggio ISH seguito da sezionamento.

Il pesce zebra è una ben consolidata organismo modello vertebrato per studiare molti aspetti dello sviluppo, fisiologia, patologia, e la rigenerazione. Con la crescente adozione di zebrafish come modello per i processi biologici post-embrionali, strumenti sperimentali per, la manipolazione inducibile tessuto-specifica dell&#39;espressione genica o vie di segnalazione sono diventati sempre più importanti. In particolare, gli studi in organo e rigenerazione appendice in zebrafish adulti hanno sofferto di una mancanza di strumenti per la dissezione dei requisiti spazio-temporali di vie di segnalazione durante questi processi rigenerativi. Attualmente, tre diversi sistemi sono stati utilizzati per realizzare condizionale, espressione tessuto-specifica del gene in rigenerazione organi di zebrafish adulto: il sistema Cre-lox, espressione mosaico di heat-shock transgeni inducibile mediante trasposoni mediata transgenesi somatica, e il sistema di Teton 1 -3. TETON riferisce ad una variante di un tetraciclina-CONTlaminati sistema di attivazione trascrizionale, dove l&#39;espressione viene attivato in presenza di tetraciclina o un suo derivato, ad esempio doxiciclina. Il sistema Cre-lox, come è finora stato utilizzato in pesci adulti, si basa su un ricombinasi Tamoxifen controllato Cre (CreERT2), la cui espressione è spazialmente limitata da elementi regolatori tessuto-specifici. Rimozione Cre-driven di una cassetta di STOP facilita l&#39;espressione del gene di interesse guidata da un promotore che deve essere attiva in tutti i tipi cellulari 1. Creazione Transposon mediata di transgeni somatiche mosaically espresse offre un sistema di espressione del transgene inducibile in linee cellulari individuali. Iniezione di embrioni di zebrafish con trasposone Tol2 che porta un gene di interesse sotto il controllo trascrizionale di un shock termico risultati promotore in individui chimerici tipicamente portano il transgene solo in linee cellulari discreti di un organo rigenerante 2. Mentre entrambi i sistemi permettono condizionale tessuti speespressione genica fica, il sistema Cre-lox non è reversibile, e la strategia di utilizzo di etichettatura clonale basato trasposoni-risente della sua natura stocastica. Così, noi ed altri hanno recentemente adattato sistemi Teton transgenici per l&#39;utilizzo in zebrafish, che facilitano temporalmente e l&#39;espressione genica spazialmente controllata che si aggiunge sintonizzabile e reversibile 3-5. Il sistema di Teton qui utilizzato comprende una linea pilota transgenica (TetActivator), in cui un Doxiciclina (DOX) -inducible attivatore trascrizionale (migliorato transattivatore tetraciclina inverso, irtTA, breve Teta) è sotto il controllo di sequenze regolatorie genomiche tessuto-specifici. In secondo luogo, esso richiede una linea transgenica responder (TetResponder) che ospita un gene di interesse sotto il controllo trascrizionale del gestore tetraciclina (Tet elemento di risposta; tetre) (Figura 1A). Pertanto, l&#39;uso di combinazioni specifiche di linee TetActivator e TetResponder consente condizionale tessuto-specificomanipolazione fic dell&#39;espressione genica. Abbiamo recentemente utilizzato il sistema di Teton a sondare per le funzioni di tessuto-specifici di Wnt segnalazione / beta-catenina nell&#39;adulto rigeneranti coda zebrafish fin 3. Nel protocollo descritto qui si descrive un flusso di lavoro per la messa a punto e l&#39;uso del sistema di Teton in zebrafish, in particolare per gli studi di rigenerazione fin. Questo include le istruzioni dettagliate su come generare linee TetActivator e TetResponder transgeniche stabili e di un protocollo per l&#39;induzione transgene in embrioni e zebrafish adulto. Inoltre, si descrivono tecniche per la verifica dell&#39;espressione genica tessuto-specifica nel rigenerato aletta, compreso un protocollo per la preparazione di criosezioni di pinne zebrafish adulti. Inoltre, si discute considerazioni per la progettazione del transgene TetActivator, la scelta di un metodo di transgenesi e rilevamento di espressione TetResponder. Quindi, l&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di servire da modelloprevista per il montaggio di un sistema téton funzionale zebrafish per ottenere l&#39;espressione genica condizionale tessuto-specifico, che può essere applicato a qualsiasi tessuto di interesse. Abbiamo creato un vettore TetActivator consentendo I-SCEI o generazione Tol2 mediata delle linee TetActivator stabili utilizzando sequenze di regolazione genomica brevi (frammenti enhancer; Weidinger laboratorio banca dati plasmide no 1247;. Figura 1B). Questo costrutto contiene una cassetta TetActivator consistente della variante mutante M2 del dominio repressore Tet inverso fuso con il virus Herpes simplex VP16 transattivazione dominio derivato 3F [irtTAM2 (3F)]. Espressione dei TetActivator (TETA) può essere facilmente monitorato dal momento che è co-espressa con il fluoroforo AmCyan dalla stessa griglia di lettura aperta; un peptide P2A media ribosomiale per saltare, che dovrebbe portare la produzione di Teta e AmCyan proteine ​​separate a un rapporto 1: 1 5,6. Il costrutto contiene anche un poylinker 5 &#39;del Tcassette etActivator per facilitare l&#39;inserimento di genomica sequenze regolatrici di interesse utilizzando metodi di clonazione convenzionali. Inoltre, abbiamo creato un costrutto costituito dal cassetto sopra descritto TetActivator più una cassetta di selezione kanamicina (Weidinger database di plasmide laboratorio no 1180;. Figura 1C), che possono essere ricombinati in un cromosoma artificiale batterico (BAC) contenente una grande regione genomica ( di solito nel codone di inizio di un gene la cui espressione modello deve essere imitata dal transgene). Entrambi i costrutti sono disponibili presso il laboratorio Weidinger su richiesta.

<table><tbody><tr><td>Breeding boxes</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>Compound fluorescent microscope</td><td>e.g., Leica, Zeiss</td><td>varies with the manufacturer</td><td>to image fluorescent tissue sections</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>e.g., Leica, Zeiss</td><td>varies with the manufacturer</td><td>to image fluorescent tissue sections</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>e.g., Leica, Thermo-Scientific</td><td>varies with the manufacturer</td><td>for cryosectioning</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>use 1/5,000 in PBS&lt;br/&gt; for visualization of nuclei</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM)&lt;br/&gt; for TetResponder induction</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5&lt;br/&gt; for fixation</td></tr><tr><td>1x Phosphat-buffer saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>1.7 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5.2 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 150 mM NaCl, pH 7.5</td></tr><tr><td>1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS with 0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>1014356190</td><td>for collection of tissue sections</td></tr><tr><td>Stereo fluorescent microscope</td><td>e.g., Leica, Zeiss</td><td>varies with the manufacturer</td><td>for fluorescence-based genotyping</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>e.g., Biorad, Applied Biosystems</td><td>varies with the manufacturer</td><td>for PCR-based genotyping</td></tr><tr><td>Tissue freezing medium (TFM)</td><td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>for embedding of tissue samples</td></tr><tr><td>Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>for anesthesia&lt;br/&gt; use at 1 mg/ml in E3 embryo medium</td></tr></tbody></table>

use of the teton system to study molecular mechanisms of zebrafish regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Per stabilire un sistema di Teton funzionale per l&#39;espressione del gene inducibile tessuto-specifica, TetActivator transgenici e linee TetResponder bisogno di essere generato (Figura 1A). Questo si ottiene microinjecting TetActivator (Figura 1B - C) o TetResponder (Figura 1E) costruisce in embrioni di zebrafish e la successiva integrazione della linea germinale. Costrutti TetActivator funzionali possono essere generati sia per clonazione di brevi sequenze regolatorie (elementi enhancer) a monte della cassetta TetActivator (Figura 1B), o ricombinando la cassetta TetActivator in un BAC contenente elementi regolatori del gene di interesse (Figura 1C). L&#39;integrazione della linea germinale del costrutto TetActivator può essere valutata mediante incroci individuale iniettato pesce G0 e l&#39;aspetto del AmCyan fluorescenza negli embrioni di F1 nel pattern di espressione prevista (Figura 1D). Linea germinale integrazione e la funzionalità del transgene TetResponder possono essere valutati incrociando individuale G0 pesce iniettato al pesce TetActivator stabilito (qui ubiquitina: teta AmCyan), seguito da un trattamento con DOX e l&#39;aspetto di YFP / YPet fluorescenza (Figura 1F). Pesce mostrando espressione forte e omogeneo YFP / YPet dovrebbe essere preferito a stabilire una linea TetResponder stabile (Figura 1G). Avendo stabilito TetActivator stabile e linee di pesce TetResponder, specifiche combinazioni TetActivator / TetResponder può essere generato da attraversare. Portatori di TetActiator e TetResponder transgeni possono essere identificati durante l&#39;embriogenesi dopo il trattamento DOX fine emergere di YFP / Ypet nella fase dello sviluppo del TetActivator è attivo (Figura 1 H). In alternativa, i pesci transgenici doppie possono essere identificati in seguito a trattamento DOX e induzione transgene TetResponder nella pinna caudale rigenerante (Figura 2A - B). &lt;<html> p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Usiamo abitualmente questo sistema per raggiungere inducibile, l&#39;espressione genica tessuto-specifica nella rigenerazione pinna caudale zebrafish. Verifichiamo tessuto-specifica espressione TetResponder transgene per imaging di fluorescenza di criosezioni di 3 DPA rigenera pinna, dal momento che i vari compartimenti di una rigenerata possono essere chiaramente identificati in tessuto sezioni in questo momento-punto (Figura 2C). Pinna longitudinale o trasversale rigenerare sezioni sono ottenuti criosezionamento dopo cryoprotecting tessuti e l&#39;inclusione fin rigenerare in modo appropriato (Figura 2D). A seguito di sezionamento, l&#39;espressione del transgene TetResponder (Ypet / YFP fluorescenza) può essere ripreso con fluorescenza o microscopia confocale (Figura 2E). Si noti che il TetActivator her4.3 promotore-driven induce TetResponder espressione nel blastema mediale prossimale, mentre il blastema distale (freccia) e l&#39;epidermide (freccia) sono privi di espressione. ove_content &quot;&gt; <img alt="Figura 1A" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1A.jpg" /> <img alt="Figura 1B" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1B.jpg" /> <img alt="Figura 1C" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1C.jpg" /> <img alt="Figura 1D" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1D.jpg" /> <img alt="Figura 1E" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1E.jpg" /> <img alt="Figura 1F" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1F.jpg" /> <img alt="Figura 1G" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1G.jpg" /> <img alt="Figura 1H" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig1H.jpg" /> Figura 1: Generazione di linee TetActivator e TetResponder transgenici. (A) del fumetto che mostra strategia per l&#39;espressione del gene inducibile tessuto-specifica utilizzando il sistema di Teton. (B) transgenico TetActivator costruire (Weidinger database di plasmide laboratorio n. 1247). Un polylinker 5 &#39;della TetActivator irtTAM2 (3F) facilita cLöning di sequenze regolatrici di interesse. La sequenza codificante AmCyan è separato dal TetActivator tramite un P2A peptide &#39;auto-scissione&#39;. La cassetta contiene anche un segnale SV40 poliadenilazione, è affiancata da Tol2 trasposoni invertito ripete e contiene un unico sito di riconoscimento meganuclease I-SCEI. (C) cassette TetActivator per BAC recombineering (Weidinger database di plasmide laboratorio n. 1180). La cassetta include il gene kanamicina per la selezione, che è guidato da un promotore procariotico gb3. Siti FRT che fiancheggiano il gene di resistenza Kanamicina consentono la sua Flp-ricombinasi rimozione mediata seguente riuscita integrazione della BAC. (D) Identificazione di G0 fondatore pesce trasmettere il her4.3: Teta AmCyan costruire attraverso la loro linea germinale. I vettori sono identificati con comparsa di fluorescenza AmCyan in alcuni embrioni F1 (frecce). (E) transgenico TetResponder costruire (Weidinger database di plasmide laboratorio n. 1444).Questo costruisce costituito da un polylinker e YPet CDS sotto il controllo degli elementi di risposta ottimizzati Tet (tetre tenuta, Clontech) e terminato dal segnale SV40 poliadenilazione. E &#39;affiancata da Tol2 trasposoni invertito ripete e contiene un unico sito di riconoscimento meganuclease I-SCEI. (F) Identificazione di G0 fondatore pesce trasmettere un funzionale TetResponder tetre: Axin1-YFP costruire attraverso la loro linea germinale. I vettori sono identificati da incrocio con una linea consolidata TetActivator (qui ubiquitina: Teta AmCyan) e induzione di YFP fluorescenza dopo il trattamento DOX per 6 ore (punte di freccia). (G) Primo piano ofembryos mostrati in (F) dopo un totale di 12 ore di trattamento DOX. Nota di induzione abbastanza onnipresente YFP fluorescenza. (H) Identificazione di doppi embrioni transgenici portatori TetActivator (her4.3: Teta AmCyan) e TetResponder (tetre: Axin1-YFP) transgeni (frecce). Embrioni noire trattati con DOX per 6 ore. (A - H) Scala bar: 500 micron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52756/52756fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2A" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2A.jpg" /> <img alt="Figura 2B" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2B.jpg" /> <img alt="Figura 2C" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2C.jpg" /> <img alt="Figura 2D" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2D.jpg" /> <img alt="Figura 2E" src="/files/ftp_upload/52756/52756fig2E.jpg" /> Figura 2: L&#39;utilizzo del sistema Teton per l&#39;espressione genica tessuto-specifica nella rigenerazione pinna caudale zebrafish. (A) scatole di allevamento utilizzati per il trattamento DOX di zebrafish adulto. (B) Induzione di tetre: Axin1-YFP TetResponder transgene dal her4.3: Teta AmCyan TetActivatornella pinna caudale rigenerante dopo 12 ore di trattamento DOX. Si noti l&#39;assenza di YFP fluorescenza pesci di controllo EtOH-trattata. (C) del fumetto raffigurante alcuni dei compartimenti si trovano all&#39;interno di un rigenerato pinna alle 3 dpa in una vista in sezione longitudinale. (D) Preparazione del campione per criosezionamento. Rigenera Fin sono messi in mezzo tessuto-congelamento (TFM) -filled cryomolds, orientati in modo appropriato per ottenere sezioni o longitudinali o trasversali della rigenerare, e trasferiti in un telaio metallico seduta sulla cima di ghiaccio secco fino a TFM si è solidificato. Piano di sezione è indicato in rosso. Abbreviazioni: dist .: distale, prox .: prossimali, sfogo .: ventrale, dors .: dorsale. (E) Confocal immagine di YFP fluorescenza in una sezione longitudinale di un rigenerato raggio aletta derivato da alette mostrati in (B). Si noti che la her4.3: linea di Teta AmCyan TetActivator spinge induzione YFP in particolare nel blastema prossimale-mediale. YFPfluorescenza non viene rilevata in una varietà di scomparti, compreso l&#39;epidermide ferita (freccia) e distale più a dominio del mesenchima (freccia) (BC) barra Scala: 500 micron; (E) bar Scala:. 100 micron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52756/52756fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Linea TetActivator </td><td> Riferimento </td><td> Elementi normativi utilizzati </td><td> Principalmente espresso in </td></tr><tr><td> 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan </td><td> Wehner &amp; Weidinger, inedito </td><td> 7xTCF-Xla.Siam Wnt giornalista 1 </td><td> Tessuti Wnt-responsive </td></tr><tr><td> myl7: irtTAM2 (3F) -p2a-mCherry </td><td> Haase &amp; Weidinger, inedito </td><td> myl7 (cmlc2) 2 </td><td> cardiomiociti maturi </td></tr><tr><td> her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 </td><td align="right"> 3 </td><td> her4.3 4 </td><td> sistema nervoso centrale </td></tr><tr><td> keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 </td><td align="right"> 3 </td><td> keratin4 5 </td><td> epidermide, nella pinna adulti escludendo strato basale </td></tr><tr><td> keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 </td><td align="right"> 3 </td><td> keratin18 6 </td><td> epidermide, nella pinna adulta esclusivamente nello strato basale </td></tr><tr><td> SP7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 </td><td align="right"> 3 </td><td> SP7 / osx 7 </td><td> (Impegnati) osteoblasti </td></tr><tr><td> ubiquitina: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 </td><td align="right"> 3 </td><td> ubiquitina 8 </td><td> (Abbastanza) onnipresente </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Disponibile linee TetActivator transgeniche Questa tabella elenca TetActiva transgenicoLinee tor di espressione tessuto-specifica del TetActivator sia pesce embrionali e adulte, che sono disponibili presso il laboratorio Weidinger su richiesta.

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Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K Views.  Ulm University. Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Video: Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

Nanoparticelle-mediata siRNA silenziamento genico nel cuore di Zebrafish adulto

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Neuroscienze

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

Modello di lesione da coltellata del tectum ottico adulto utilizzando zebrafish e medaka per l'analisi comparativa della capacità rigenerativa

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

<meta charset="utf8"></head><body>Robusto trapianto di cellule di pesce zebra per la ricerca sulla rigenerazione e lo sviluppo

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Mappatura della connettività cellulare nel sistema nervoso del pesce zebra durante lo sviluppo e la rigenerazione

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

L'utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

Nanoparticelle-mediata siRNA silenziamento genico nel cuore di Zebrafish adulto

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Modello di lesione da coltellata del tectum ottico adulto utilizzando zebrafish e medaka per l'analisi comparativa della capacità rigenerativa

Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale

Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale

Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale