This work was supported by the BLUERPINT EU grant (BLUEPRINT &#8211; A BLUEPRINT of Haematopoietic Epigenomes). We also thank the Walloon Region (DG06) for its financial support.

1. Standart ChIP Deneyler <ol><li> Hücre toplanması ve DNA-protein çapraz bağlama. <ol><li> % 80 -90% bir izdiham HeLa-S3 hücreleri büyütün. , Kültür ortamı çıkarın 1x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 10 ml ile iki kez bulaşık yıkama ve kültür plakasına Tripsin-EDTA (1x) ekleyin. Çanak hücreleri ayırmak için 2 dakika arasında bir süre için inkübe edilir. Hücreler toplanır ve 10 ml PBS ile iki kez yıkanır. Not: uzun inkübasyon süreleri, hücre hasarına yol açar. </li><li> 500 xg&#39;de 5 dakika boyunca hücreler santrifüj ve 20 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Hücreleri saymak için devam edin. </li><li> 500 xg&#39;de 5 dakika santrifüj hücreleri süpernatant atın ve PBS 500 ul ekleyin. katılaştırma basamağında hücrelerin optimum sayısı, 500 ul PBS başına 10000000 hücredir. </li><li> Hücre süspansiyonu 500 ul ve her seferinde taze% 37 formaldehid 13.5 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 8 dakika hücreleri sabitleşmek. </li><li> 1.25 M glisin SOLUT 57 ul ekleiyon tespit durdurmak için. Hafif bir girdaptan ile sabit karıştırma ile oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. Bu noktadan itibaren buz üzerinde çalışın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve hücre pelletini bozmadan süpernatant atılır. </li><li> 1 ml PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Yavaşça Süpernatantı atın ve buz üzerinde hücre pelet tutmak. </li></ol></li><li> Hücre parçalama ve kromatin kesme <ol><li> Hücre pelletine buz gibi soğuk lisiz tamponu il1 10 ml ilave edilir (1.000.000 hücre başına liziz tamponu için 1 mi optimum oran). Pipet ve birkaç kez aşağı ve yumuşak karıştırma ile 4 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. </li><li> 500 xg 5 dakika 4 ° C lizat santrifüj. Süpernatantı atın. </li><li> Lizatların buz soğuk lizis tamponu il2 10 ml ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme hafifçe karıştırın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca lizatları inkübe edin. </li><li> 500 xg&#39;de 5 dakika ve 4 ° C Santrifüj ve supernatant atın. </li><li> PrepaIS1 kesme tampon 200x proteaz inhibitörü kokteyl (PIC) ekleyerek tam kesme tampon yeniden. 5 dakika buz üzerinde tampon tutun ve daha sonra buz üzerinde çalışacak. Pelet her biri 10 milyon hücre tam IS1 kesme tampon 1 ml ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. 10 dk numunenin viskozitesini azaltmak için sonikasyon önce buz üzerinde örneklerin inkübe edin. </li><li> 10 döngü, her biri 2-3 kümeleri için, bir su banyosu sonikatör kullanılarak sonikasyon ile kromatin 300 ul alikotları Kayma. Bir döngü 30 sn &quot;ON&quot; ve yüksek güç ayarı 30 sn &quot;OFF&quot; oluşur. Alternatif olarak, 30 sn &quot;ON&quot;, 30 saniye &quot;OFF&quot; 5 ila 10 döngü kısa bir sonikasyon süresi ile bir pico-sonikasyon cihazı kullanın. Kısaca vorteks çalışır arasındaki tüpleri spin ve. Selenleyici diğer türleri kullanırken, kromatin kesme için üreticinin talimatlarına gelen izleyin. </li><li> 10 dakika ve c 16.000 xg&#39;de makaslanmış kromatin santrifüjIP adımda hemen kullanılmak üzere yüzer ollect. Seçenek olarak ise, ileride kullanılmak üzere en fazla 2 ay boyunca -80 ° C &#39;de kromatin saklayın. </li><li> Önce 1-1.5% TAE agaroz jeller veya bionalyzer kullanarak immunopresipitasyon adım kromatin kesme verimliliğini analiz. Optimal kromatin fragman boyutları 100-600 bp arasında değişmektedir. </li></ol></li></ol> 2. Düşük Cell işlemcisinde Deneyler <ol><li> Hücre toplama ve DNA-protein çapraz <ol><li> % 80 -90% bir izdiham HeLa-S3 hücreleri büyütün. , Kültür ortamı çıkarın 1x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 10 ml ile iki kez bulaşık yıkama ve kültür plakasına 1x Tripsin-EDTA ekleyin. Çanak hücreleri ayırmak için 2 dakika arasında bir süre için inkübe edilir. Not: uzun inkübasyon süreleri, hücre hasarına yol açar. </li><li> 1 ml santrifüj tüpüne serumu içeren 1 ml kültür ortamı eklenerek hücreler toplanır. Hücreleri saymak. </li><li> X g, 500 ° C&#39;de 5 dakika için hücreler santrifüj. Hücre sayısını getirtespiti için kültür ortamının ml&#39;si başına 10,000 hücre için. </li><li> Tespiti için her bir tüp içine% 36.5 taze hazırlanmış formaldehit 27 ul ekle. Tüpü, iki ya da üç kez ters çevirin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li><li> Tüp ters, numune, iki ya da üç kez 1.25 M glisin çözeltisi 115 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. Bu noktadan itibaren buz üzerinde çalışın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Yavaş yavaş Süpernatantı atın. </li><li> PIC (200x, nihai konsantrasyon 1 x) ile, 1 ml buz gibi soğuk HBSS hücreleri yıkayın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücreleri ve santrifüj tekrar süspansiyon tüpü, iki ya da üç kez ters çevirin. Yavaşça Süpernatantı atın ve buz üzerinde hücre pelet tutmak. </li></ol></li><li> Hücre parçalama ve kromatin kesme <ol><li> 10,000 hücre başına tam Liziz Tampon TL1 (Liziz Tampon TL1 + PIC) 25 ul ekleyin ve hücreleri tekrar süspansiyon elle tüpün alt çalkalayın. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> Tam HBSS 75 ul ekleyin (HBSS + PIC) 10.000 hücreleri içeren ve her seferinde içine tampon. </li><li> 5 döngü, her biri 5 kümeleri için sonikasyon ile 10,000 hücre, 100 ul alikotları Kayma. Bir döngü 30 sn &quot;ON&quot; ve yüksek güç ayarı 30 sn &quot;OFF&quot; oluşur. Alternatif olarak, 30 sn &quot;ON&quot;, 30 saniye &quot;OFF&quot; 5 döngü kısa sonikasyon zaman kullanılan bir pico-sonikasyon cihazı kullanın. Optimal kromatin fragman boyutları 100-600 bp arasında değişmektedir. Kromatin hazırlıkları, hücre tipleri ve farklı selenleyici ayrı kesme optimizasyon deneyleri gerektirdiğini unutmayın. </li><li> Santrifüj 10 dakika süpernatant çözünmeyen malzeme atmak ve toplamak için 14.000 xg makaslanmış kromatin IP adımda hemen kullanılır. Seçenek olarak ise, ileride kullanılmak üzere en fazla 2 ay boyunca -80 ° C &#39;de kromatin saklayın. </li><li> 1-1.5% TAE agaroz jelleri kullanarak önce immunopresipitasyon adım kromatin kesme verimliliğini analiz veyabionalyzer. Önceden RNase ile muamele etmek örnekleri kesme görsel değerlendirme geliştirmek için jel analizini agaroz. Optimal kromatin fragman boyutları 100-600 bp arasında değişmektedir. </li></ol></li></ol> 3. Kromatin Immunoprecipitation ve Kütüphane Hazırlık <ol><li> Standart Otomatik ChIP deneyleri için <ol><li> Kromatin makaslanmış 100 ul ChIP Tampon H (ChIP Tampon H + PIC) 120 ul ekleyin. IP 200 ul kullanın ve giriş örnek olarak 20 ul 2 ul tutmak. </li><li> Otomasyon aracı otomatik ChIP 200 ul protokolünü seçin. Protokolün çıktı vadede başına 1 ila 16 örnekleri olduğunu. </li><li> Kromatin 1-2000000 hücreleri anti-H3K79me3 1-2 ug tekabül eden kullanılarak otomatik bir ChIP deney çalıştırın -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 ve H3K9me3 ChIP seq dereceli tavşan poliklonal antikorları elde edilebilir. Optimal antikor miktarları histon modifikasyonu ve afinite ve spec bağlı olarak değişirkarşılık gelen antikorun spesifite. <ol><li> Bir izotip kontrol antikoru olarak bağışıklığı olmayan tavşan IgG eşit miktarda kullanın. Alternatif olarak, kaplanmamış boncuk ya da ChIP kontrolleri gibi spesifik bloke antikor kullanın. Her reaksiyon için protein-kaplanmış bir manyetik boncuk 20 ul ekle. </li></ol></li><li> Anti-H3K79me3 ve -H3K4me2 poliklonal antikorlar ile otomatik ChIP deneyleri gerçekleştirmek için otomatik histon ChIP-seq kiti reaktifleri kullanın. Anti-H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac ile -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 ve -H3K9me3 ChIP deneyleri gerçekleştirmek için ideal bir ChIP-seq kiti reaktifleri kullanın. </li><li> Otomasyon cihazı uygulanan yazılım talimatları takip otomatik ChIP protokolünü seçin. Antikor kaplama aşaması için 4 saat ve immünopresipitasyon aşaması için 15 saat için ChIP deney parametreleri ayarlayın. ters çapraz bağlama kademesi 4 saat süre ile 65 ° C&#39;de otomatik cihaz içinde yer alır. </li><li> Otomatik bir sistem ile ilgili ters çapraz-bağlanmış DNA arındırın. Seç autbir protokol ya da kit manyetik tane bazlı DNA saflaştırılması kullanılarak DNA saflaştırma için omated protokolleri. Su 25 ul DNA Zehir. </li><li> Immunoprecipitated DNA% 10 ayıklanması immunopresipite DNA niceliğini. imüno-DNA ürünü kromatin ve antikor, hücre tipi ve hedef histon modifikasyonu kalitesine bağlıdır. Üreticinin talimatlarına göre bir deney takımı ile DNA miktarı belirlenir. </li><li> En azından pozitif 1 ve 1 negatif kontrol genomik bölgelerde primerler kullanılarak kantitatif PCR ile DNA immunopresipite kalitesini analiz. ChIP zenginleşme değerlendirmek için toplam immunoprecipitated DNA% 10&#39;dan fazla kullanmayın. <ol><li> QPCR reaksiyonları hazırlayın. 2x SyberGreen qPCR ana karışımı 10 ul, primer karışımı 1 ul, çökeltilir veya giriş DNA ve 20 ul nihai reaksiyon hacmi steril su yukarı 1-5 ul ekle. QPCR programı, 95 ° C&#39;de bir ilk denatürasyon adımı içerir5-10 dakika boyunca Taq polimeraz sağlayıcısına bağlı olarak ve tavlama sıcaklıkları seçilen primerler göre ayarlanması gerekir. </li></ol></li><li> Yonga DNA yanı sıra, aynı kromatin hazırlanması kaydedilen giriş DNA her ikisini de kullanarak kitaplıkları oluşturmak için ticari olarak temin edilebilen Illumina ChIP seq kütüphane hazırlanması ayıraçlar ile uyumlu kullanımlar otomatik kütüphane hazırlık protokolleri. Kütüphane hazırlanması için her bir antikordan çökeltilir DNA 10-20 ng kullanın. Vadede başına 16 otomatik kütüphaneler kadar hazırlayın. </li><li> Kütüphaneler sırası ve Illumina üreticinin talimatlarına göre kümeleri oluşturmak. Standart Illumina boru hattı, filtre aşağıdaki birincil biyoinformatik analizi (küme filtreleme, taban arama, vb) gerçekleştirmek ve ELAND hizalayıcısı ile (güncel sürüm GRCh38 olan) son insan genom montaj okur hizalamak. Pik arama için SICER 7 veya 8 MACS kullanın ve w doruklarına mansap analizleri yapmaki Homer 9, BEDTools 10 veya tercih edilen yazılımları. </li></ol></li><li> Düşük hücre sayısı otomatik ChIP deneyleri için <ol><li> Kromatin makaslanmış 100 ul tam ChIP tampon TC1 (ChIP Tampon TC1 + PIC) 120 ul ekleyin. IP 200 ul kullanın ve girdi olarak 20 ul tutmak. </li><li> Otomasyon sisteminde otomatik ChIP 200 ul protokolünü seçin. Protokolün çıktı vadede başına 1 ila 16 örnekleri olduğunu. </li><li> Düşük kromatin miktarları üzerinde çalışmak üzere optimize otomatik ChIP reaktifleri ve ChIP sınıf antikorları kullanarak otomatik ChIP-seq deney çalıştırın. 10,000 hücre ve 100,000 hücre anti-H3K27me3 0.5 ug, 0.25 ug -H3K4me3, 0.1 ug -H3K27ac, 0.25 ug -H3K9me3 tavşan prim ChIP seq dereceli tavşan poliklonal antikorlar, karşılık gelen kromatin kullanın. Optimum antikor miktarları histon modifikasyonu ve karşılık gelen antikor yakınlık ve özgüllük bağlı olarak değişir. <ol><li> Non-immun rab eşit miktarda kullanınbir izotip kontrol antikoru olarak biraz IgG. Alternatif olarak, kaplanmamış boncuk ya da ChIP kontrolleri gibi spesifik bloke antikor kullanın. Her reaksiyon için protein-kaplanmış bir manyetik boncuk 10 ul ekle. </li></ol></li><li> Otomasyon cihazı uygulanan yazılım talimatları takip otomatik ChIP protokolünü seçin. Antikor kaplama aşaması için 4 saat ve immünopresipitasyon aşaması için 15 saat için ChIP deney parametreleri ayarlayın. ters çapraz bağlama kademesi 4 saat süre ile 65 ° C&#39;de otomatik cihaz içinde yer alır. </li><li> Üreticinin talimatlarını takip ederek, su içinde 25 ul 6 ul gelen hacim elüte döndürme kolonları kullanılarak ters çapraz-bağlanmış DNA arındırın. </li><li> Piyasada bulunan değerlendirme kiti kullanılarak DNA miktarı belirlenir. QPCR ChIP kalitesini değerlendirmek için pozitif ve negatif kontrol bölgeleri için primerler kullanarak sonuçları analiz edin. </li><li> Düşük DNA Quan ile kütüphaneleri hazırlamak için optimize kütüphane hazırlık reaktifleriyle bir kütüphane hazırlık seti kullanıntities. 30 pg ve kütüphane hazırlanması için (sırasıyla 10,000 ve 100,000 hücre deneyleri gelen) ChIP DNA 300 syf kullanın. Kütüphane hazırlık reaktif ile uyumlu otomatik protokolünü kullanarak kütüphaneleri hazırlayın. Otomatik kütüphane hazırlık hacmi vadede başına 1 ila 48 kütüphaneler olduğunu. </li><li> Çift sarmallı DNA şablonları sonu onarımı takiben, sıralama astar siteleri içeren bölünebilir kök-döngü adaptörleri Arter. DNA uzatma adımı takiben, kütüphane hazırlık seti protokolde belirtilen yüksek sadakat büyütme yöntemi ile örnek yükseltmek. </li><li> Kütüphane amplifikasyon sonra, ölçmek ve kütüphane hazırlık seti yönergeleri izleyerek kütüphaneleri arındırmak. Arıtma gerekli değildir bundan sonra boyutu seçimini unutmayın. </li><li> Kütüphaneler sırası ve üreticinin talimatlarına göre kümeleri oluşturmak. Stand aşağıdaki birincil biyoinformatik analizi (küme filtreleme, taban arama, vb) gerçekleştirmekard üretici boru hattı, filtre ve ELAND 7 hizalayıcısı ile (güncel sürüm GRCh38 olan) son insan genom montaj okur hizalamak. , BEDTools 10, ya da herhangi bir tercih edilen yazılımları tepe arama için SICER 8 veya 9 MACS kullanın ve Homer ile doruklarına mansap analizleri yapmak. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52150/52150fig1highres.jpg" /> IP-Yıldızlı Compact otomatik ChIP deneyleri kurmak için nasıl gösteren yazılım Şekil 1. Ekran. Yazılım yanı sıra anahtar deney parametreleri (Antikor Kaplama, IP ve yıkar değiştirmek için çalışma başına örneklerin miktarını seçmek için esneklik sağlar ) araştırmacı ihtiyaçlarına göre. Otomatik işlem paralel farklı koşullar (örneğin, farklı ve antikor miktarları, farklı ve hücre miktarda ve hatta farklı t test veriyorYPES ve aynı vadede manyetik boncuk miktarları. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52150/52150fig2highres.jpg" /> Şekil otomasyon sisteminde kütüphane kiti kullanılarak yeni nesil dizileme için otomatik kütüphane hazırlığı kurmak için nasıl gösteren yazılım 2. Ekran. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6, 1656-1668 (2011).</li><li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nature Protocols. 8, 539-554 (2013).</li><li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHT-ChIP-seq:+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation.">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biology. 14, 124 (2013).</li><li>Farias-Hesson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+library+preparation+for+high-throughput+DNA+sequencing+platforms.">Semi-automated library preparation for high-throughput DNA sequencing platforms.</a> Journal of Biomedicin., &amp; Biotechnology. 2010, (2010).</li><li>Callejas, S., Alvarez, R., Benguria, A., Dopazo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AG-NGS:+a+powerful+and+user-friendly+computing+application+for+the+semi-automated+preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+open+liquid+handling+platforms.">AG-NGS: a powerful and user-friendly computing application for the semi-automated preparation of next-generation sequencing libraries using open liquid handling platforms.</a> BioTechniques. 56, 28-35 (2014).</li><li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data.">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25, 1952-1958 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137 (2008).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities.">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38, 576-589 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 26, 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).</li></ol>

The authors of this article, at the time of its writing, are employed by Diagenode S.A. and Diagenode, Inc., the manufacturer of the automated system described.

Dizinlemeyi müteakip, Kromatin immüno-çökeltmesi artık yeni bir standart bir prosedürdür. İşte başlangıç ​​materyali olarak az 10.000 hücreleri ile kromatin epigenetik profillerini oluşturabilir otomatik ChIP-seq protokol sunulmuştur. ChIP ve kütüphane hazırlık deneyleri otomatikleştirme ChIP optimizasyon prosedürü standartlaştırılması ve deneysel değişkenliği azaltarak sağlar. Burada sunulan sıvı taşıma sistemi, zamanında sadece 30 dakika eller azaltılması ChIP ile ilişkili manuel prosedürlerin çoğu ortadan kaldırır örnek kaybını en aza indirir ve kütüphane giriş sadece birkaç pikogram ile doğru ChIP-seq sağlar. Başarılı otomatik ChIP-seq deneyler gerçekleştirmek için, aynı zamanda her bir deney sistemi yüksek kalitede makaslanmış kromatin hazırlıklarını ve ChIP-seq sınıf antikorları kullanmak önemlidir manyetik boncuk tabanlı teknoloji kullanır ve inkübasyon gibi ana deney parametrelerini değiştirme esnekliği sunar Antikor kat için zamanimmunoprecipitation adımlar ya da ChIP-seq optimizasyonu için gerekli tüm deneyler için araştırmacı izin yıkama koşullarının değiştirilmesi ing ve. Otomatik bir sistem, aynı zamanda, her bir hücre hattı ve antikor için deney koşullarının optimizasyonu için paralel olarak birden fazla maddenin karşılaştırılmasına olanak sağlar ve çeşitli türlerde ve kromatin konsantrasyonlarda, farklı antikorlardan ve manyetik hatta farklı türde doğrudan karşılaştırma sağlayan bir &quot;açık&quot; bir platformdur boncuklar. Otomatik bir sistem sınırlamaları biri 5 ul 200 ul aralığı hacimlerde tüm protokolleri otomasyonunu ihtiyacıdır. Ancak, bu otomatik platformda deney minyatürleştirilmesi de reaktif maliyetleri tasarruf sağlar. Bu çalışmada tarif edilen protokollere ek olarak, sistem, uyum sağlayabilir ve aynı zamanda immüno-a gibi diğer manyetik boncuk esaslı çeşitli uygulamalar otomatiknd metilatlı DNA (MeDIP ve MethylCap teknolojileri), hydroxylmethylated DNA (hMEDIP), sıralı kromatin immunoprecipitation (Rechip), RNA immunoprecipitation (RNA-IP), bisülfit dönüşüm immünopresipitasyonu ve DNA saflaştırma deneyleri yakalama.

Yeni Nesil Dizi (NGS) teknolojileri yaygın ve daha erişilebilir hale geldikçe, şimdi transkripsiyon faktörü keşfini sağlayan NGS algılama (ChIP-seq), ardından immunoprecipitation kromatin protein-DNA etkileşimleri genom haritalama için birincil yöntem histon modifikasyonları siteleri veya desenler bağlanma. ChIP seq zenginleştirilmiş DNA fragmanlarının ölçülmesiyle protein-DNA etkileşim niceliksel ve niteliksel analizi için kullanılabilecek tüm genom yüksek verimlilik verilerinin sağlanması için avantajlıdır. Bununla birlikte, bu tür bir sekans kitaplığı oluşturmak için yeterli malzeme elde etmek güçlüğü gibi standart bir çipli seq deneylerde bazı dezavantajları da vardır. ChIP deneyleri, hücre parçalama ve immunokomplekslerin sonikasyon ile kromatin kesme, 3) oluşumunu içerir 2) numune hazırlama 1) çapraz protein DNA bağlayıcı bölgeler de dahil olmak üzere altı temel adımlar ayrılırImmunokomplekslerin 4) yağış, immunokomplekslerin 5) yıkanması ve qPCR ve NGS tarafından zenginleştirilmiş materyal ve analiz 6) elüsyon. kognat antijeni için antikorun iyi kromatin hazırlanması, orjinal numune içinde antijen miktarı ve özgüllük ve afinitesi en: bir çip tahlilinde başarısı üç faktöre bağlıdır. Önemli bir kısıtlaması, bir sıralama kütüphane oluşturmak için yeterli zenginleştirilmiş DNA elde etmek için hücre sayıları başlayan yüksek tutarlar için gerekliliktir. Böyle biyopsi örneklerinde veya hücre alt-popülasyonları gibi sınırlı miktarda numune ile çalışmak bilim adamları için, ChIP-seq deneyler çok zorlu. Hücreler 1 düşük bir miktarda, 2 ile çalışırken son çalışmalar ChIP seq tahliller yapılabilir göstermiştir. Diagenode hücre sınırlı sayıda başlatırken tam ChIP seq deneyler otomatik bir robot sıvı taşıma sistemi geliştirmiştir. Otomasyon sağlarChIP-seq numunelerin manuel hazırlanması üzerinde birçok avantajı insan hata azaldıkça, değişkenliği azaltır, ve deneysel maliyetini düşürür. Kromatin immünopresipitasyon ve kütüphane hazırlanması için yarı-otomatik protokolleri bildirilmiştir ama düşük hücre sayıları, 3, 4, 5, 6 kullanırken bu çalışmaların hiçbiri verileri göstermiştir. Bu yazıda tam otomatik iş akışı manyetik boncuk tabanlı teknoloji kullanır ve bu protokol optimizasyonu birden fazla parametre ele bir robot sıvı-işleme sistemi kromatin immunoprecipitation ve kütüphane hazırlık deneyleri hem açıklanmıştır. Burada, otomatik ChIP-seq deneyler başarıyla basitleştirilmesi standartlaştırılması ve küçük hücre popülasyonlarının epigenetik profillerini incelemek için güvenilir bir çözüm sağlamak amacı ile hücrelerin sınırlı sayıda yapılmıştır. Bu yazıda anlatılan otomatik ChIP protokol belirli histon antikorlar ve reaktifler b kullanarak HeLa hücreleri üzerinde optimize edilmiştirakışını ut deneysel optimizasyonu karşılık gelen başka hücre hatları ve antikorlar için adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="917">
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:333px;">Product Description</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:107px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:367px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Formaldehyde 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">1,25M Glycine Solution</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Shearing Buffer iS1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protease Inhibitors Mix (200x)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14175-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer tL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP Buffer tC1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ideal ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagneode</td>
			<td>C01010051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP-Buffer H</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td>Component of the Auto Histone ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto Histone ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto True Micro ChIP kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K79me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15310068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K27me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me2 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K36me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Rabbit IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protein-A coated paramagnetic beads</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto IPure</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroChIP DiaPure columns</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Universal SyberGreenMaster Mix 1.25ml</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>DMMLD2D100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quant-IT dsDNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroPlex Library Preparation Kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C05010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Library prep Quantification kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">IP-Star Compact&#160; Automated System</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B03000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Pico</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Qubit system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Hiseq systems</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating chip-seq experiments to generate epigenetic profiles on 10,000 hela cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

Sekiz farklı histon belirteçleri için otomatik ChIP-seq deneyler Optimize Başarıyla geliştirmek ve daha önce manuel ChIP-Seq deneyler valide edildi otomatik ChIP protokolleri, ChIP-seq sınıf antikorları doğrulamak için seçildi (veriler gösterilmemiştir). Anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 ve -H3K9me3: Aşağıdaki ChIP seq dereceli antikorlar, bu çalışma için seçilmiştir. Tüm yonga seq dereceli antikorların özelliği, daha önce dot blot peptid dizileri ve Western Blot deneyler ile teyit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Artan antikor miktarlarda Pilot ChIP-qPCR deneyleri antikorların (Şekil 3) hassasiyetini belirlemek için yapılmıştır. en az iki olumlu ve iki negatif kontrol hedefleri ile QPCR analiz edildi ve yüksek negatif hedefin üzerinde pozitif zenginleşme ile profiller beşli sıralama exper için nitelikli daha<html> iments. Bu makaslanmış kromatin yüksek kalite ile ChIP ve ChIP-seq deneyler gerçekleştirmek için önemlidir. Bu yayında yer alan tüm talaş deneyler taze kromatin kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu, -80 ° C&#39;de sabit hücreler dondurma ve farklı bir gün kromatin hazırlama ve kesme işlemine devam etmek de mümkündür. Ancak, kromatin taze hazırlanmış, kromatin ve bu nedenle sonication koşulları her kromatin hazırlanması için optimize edilmesi gerekebilir farklı davranabilir donmuş sabit hücrelerden hazırladı. Farklı hücre tipleri ile çalışırken, farklı deterjan bileşimlerinde (SDS) ile kesme tamponlar da kullanılabilir. Bu süspansiyon içinde yetiştirilmiş birincil hücre çizgileri veya hücre gibi hücre tipleri zor hücreler kesme ve HeLa düşük SDS konsantrasyonu (% 0,1) gerektirir gibi kesme kolay hücre çizgileri, buna karşın yüksek SDS konsantrasyonlarda (% 1) gerektirir olan kesme tamponlar da kullanılabilir. res.jpg &quot;/&gt; Şekil otomasyon sistemi kullanarak çipe dereceli antikorların 3. Doğrulama. ChIP anti H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac ile gerçekleştirildi dan kesilmiş kromatin -H3K36me3 ve -H3K9me3 tavşan poliklonal antikorlar histon modifikasyonları bağlı, 1 milyon HeLa-S3 hücreleri. 200 ul çalışma hacmi ile otomatik ChIP protokolleri antikor titrasyon deneyleri için otomatik alet kullanılmıştır. 1, 2, 5 ve 10 ug antikor miktarları ChIP deney başına test edildi ve 2 ug IgG, her bir deney için, negatif kontrol olarak kullanıldı. Zenginleştirmeler qPCR ile değerlendirildi. Sonuçlar girdi bir (% qPCR analizi sonrasında giriş DNA&#39;ya kıyasla immunoprecipitated DNA nispi miktarı) olarak gösterilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Doğrulama ve optima belirledikten sonra<html> ChIP dereceli antikorların l miktarları otomasyon sistemi içinde kullanılmak üzere, otomatik ChIP seq deneyleri her histon modifikasyonu (Şekil 4) için dizilim profilleri oluşturmak amacıyla yapılmıştır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52150/52150fig4highres.jpg" /> Şekil 4. Histon ChIP-seq profiller otomatik ChIP-seq deneyler tarafından oluşturulan. Şekil H3K4me3, H3K9ac ve H3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3 ve H3K36me3 için farklı genomik bölgelerde ChIP-seq profillerini göstermektedir. 4A tam X boyunca zirve dağılımını gösterir -Kromozom ve 4B, GAPDH geni çevreleyen bir 75 kb bölgesi dağıtım. 4C MYT1 geni çevreleyen bir 500 kb bölgesi içinde H3K27me3, H3K36me3 ve H3K4me3 profillerini gösterir ve 4D 200 kb bölgesi çevresindeki ZNF12 içinde H3K9me3 dağılımını göstermektedir.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. Geni ifadesi ile ortak altı farklı histon değişiklikler için Histon epigenetik profiller (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 ve H3K36me3) oluşturulmuştur. Şekil 4A farklı histon belirteçleri kromozom X boyunca ChIP seq profillerini göstermektedir. 6 farklı histon profilleri arasında gözlemlenen yüksek tepe ilişki doğru ve güvenilir veri oluşturmak için otomatik bir sistem özelliklerini gösterir. Şekil 4B, 4C ve 4D özel genomik bölgelerden farklı histon değişiklikler için tepe dağılımını göstermektedir. 200 hücrelerine kadar Otomatik kromatin immünopresipitasyon deneyleri ChIP deneylerinde kullanılabilir hücrelerin en az miktarda kromatin kalitesine bağlıdır, specificity ve antikor ve çalışılan histon modifikasyonu veya protein bolluğu duyarlılığı. Sınırlı numune miktarları ve optimal reaktifler ve farklı taşıyıcı seçimi ile çalışma, DNA kurtarma verimliliğini artırır ve ChIP deney başarısına katkıda zaman iyi ChIP-seq sınıf antikorları seçilmesi önemlidir. Özellikle kromatin düşük miktarları ile çalışmak için optimize edilmiş talaş reaktifler kullanılarak, IP-Star otomatik sistemi içinde denendi otomatik ChIP protokolü işleyebilir hücreleri, kromatin, antikor ve manyetik boncuk farklı miktarlarının en az miktarını belirlemek için. Protokolde tarif edildiği gibi İlk olarak, 10,000 hücre ile ilgili kromatin sonike edilmiştir. ChIP sonuçları negatif kontrol bölgelerinde H3K4me3 pozitif kontrol bölgeleri antikorun ve ihmal edilebilir bir sinyal ile önemli zenginleşme göstermektedir qPCR (Şekil 5A) ile doğrulanmıştır. Karşılaştırma ve tutarlılık kanıtı, additiona için10000 hücreleri kullanılarak H3K27ac, H3K9me3 elde edilen l verileri ve H3K27me3 antikorlar temin edilmektedir. Otomatik ChIP deneyler aynı H3K4me3 antikoru kullanılarak hücrelerin düşük miktarlarda çalışmak için otomatik sistemin yeteneklerini göstermek için daha sonra yapılmıştır. otomatik ChIP tekrarlanabilir ve manuel ChIP sonuçları (Şekil 5B) ile son derece benzer olan on adet IP bir dizi tepkime ile ortaya iyi bir performans sergiledi. Manuel ve otomatik deneyler yapıldı ve otomatik protokollerin faydaları değişkenlik (Şekil 5C) deneme deney azaltmada görüldü. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52150/52150fig5highres.jpg" /> Şekil 5. Manuel ChIP deneyleri 10.000 hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiştir 10.000 hücreleri üzerinde ChIP ve Auto ChIP deneyleri optimizasyonu ve H3K4me3 0.25 ug, H3K27ac 0.1 ug, H3K9me3 ve 0.2 0.5 ug kullanarakH3K27me3 antikorların 5 ug. Tavşan IgG Aynı miktarlardaki bir kontrol olarak kullanılmıştır. QPCR iki pozitif lokus ve her bir yonga için deney için iki negatif lokusların primerlerle gerçekleştirilmiştir. Şekil 5A, kurtarma, giriş bir yüzdesinde (qPCR analizi sonra giriş DNA ile karşılaştırıldığında çökeltilir DNA nispi miktarı) olarak ifade gösterir. Şekil 5b Şekil 10 ChIP reaksiyonları 0.25 mikrogram H3K4me3 poliklonal antikor ve tavşan IgG 0.25 mikrogram olarak negatif kontrol antikoru kullanarak IP-Yıldızlı Compact çalışır. Daha sonra QPCR analizi pozitif lokus EIF4A2 promoteri ve GAPDH TSS ve negatif lokuslarının miyoglobinin exon2 ve SAT2 için primerler ile gerçekleştirildi. Şekil iyileşme olduğunu gösterir, giriş (qPCR analizi sonra giriş DNA ile karşılaştırıldığında imüno DNA nispi miktarı) yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Şekil 5C, 10 otomatik ChIP deneylere karşılık, 10 kılavuzu ChIP deneyler H3K4me3 çip veri gösterir. Hata çubukları s temsil<html> On çoğaltır her tandard sapmalar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Otomatik ChIP protokolleri duyarlılığını anlamak için, deneyler IP başına 100,000, 200 kadar hücreler arasında değişen hücrelerin miktarı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bir çok yaygın bir histon modifikasyonu olduğu gibi anti-H3K27me3 antikoru kullanılmıştır. Diğer histon ya da olmayan histon antikorların kullanımı epitopunun bolluğu ve antikorun kalitesine bağlı olarak, daha fazla veya daha az hücre gerektirebilir. Deneyler ile nicel PCR ile doğrulanır ve bu boncuklar ve deneyler antikor arka miktarını azaltarak kadar az 200 hücreleri antikor (Şekil 6) ile başarılı bir şekilde ChIP-qPCR sonuçlar sağlayan düşük olduğu gözlenmiştir. iles / ftp_upload / 52.150 / 52150fig6highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 6. 200 hücreleri üzerinde ChIP deneyleri otomatik. Hela-S3 hücreleri ve antikor H3K27me3 karşı. Kromatin, 1 milyon hücreleri ve ChIP reaksiyon başına kullanıldı (100.000 200 hücre eşdeğeri) Bu kromatin seri dilüsyonları kesildi. Protein A-kaplı manyetik boncuklar 1 H3K27me3 ug ve 10 ul H3K27me3 0.5 ug ile 10,000 ve 1000 hücreleri üzerinde boncuklar 10 ul ve H3K27me3, 0.25 ug ila 500 ve 200 ile boncuk 5 ul, 100,000 hücre deneyi kullanıldı Hücreler. 100,000 hücre sırasıyla 1000 hücreleri ile deneyler yaparken 1 ug ve tavşan IgG ug 0.5 negatif kontrol antikoru olarak kullanılmıştır. 6A. Girişi üzerinden% olarak TSH2B ve GAPDH genlerin doluluk göstermektedir 6B negatif GAPDH kontrolü karşı TSH2B göreli doluluk göstermektedir genomik bölge. Üzerindeki ChIP-seq sonuçları Mansap analizi10,000 hücre 10,000 HeLa hücrelerinde ve yonga deneyler H3K4me3 antikorun 0.25 ug fiş seq tahliller yapılmıştır otomatik hücre düşük başlangıç ​​sayıları ile otomatik ChIP seq deneylerin genel kalitesini değerlendirmek için 100,000 HeLa-S3 hücreleri kullanılmıştır ile deney için pozitif kontrol olarak. otomatik kütüphaneleri bir düşük DNA&#39;lı miktarda hazırlanmış kütüphaneler için uyarlanmış MICROPLEX kütüphane hazırlık seti reaktif maddeler kullanılarak elde edildi. Mümkün olsa bile daha az 10.000 hücreleri ile başarılı otomatik ChIP-deneyler gerçekleştirmek için unutmayın, aşağı çekti DNA miktarları kiti reaktifleri kullanılarak kütüphaneleri hazırlamak için yeterli olmayacaktır. Küme oluşturma ve dizileme, imalatçının talimatlarına göre yapılmıştır. biyoinformatik düşük hücre sayısı ChIP örneklerinden sıralama gösterisi olağanüstü sonuçlar sonrası analizleri. 30 mg veri kümesi (başlangıç ​​malzemesinin 10,000 karşılık gelen hücrelerdeki<html> ) Düşük arka plan gürültüsü ve başlangıç ​​malzemesinin 100,000 hücre tekabül eden 300 pg veri kümesi () ve harici bir referans olarak kullanılmıştır KODLAMASI projesi için geniş Enstitüsü tarafından üretilen H3K4me3 veri kümesi de doğrulandı son derece güvenilir zenginleştirme tepe içerir. İki veri setleri en% 40, en az% 80&#39;lik bir örtüşme vardır karşılaştırılması durumunda ChIP seq tekrarlanabilir olarak kabul edildiği KODLAMASI 11 projede kullanılan standart bir yönteme değinmektedir en 40 örtüşme oranı verileri not etmek önemlidir önemi puanı göre sıralanmış piklerin. 300 pg veri kümesi (kendi doruklarına tüm değil, sadece en iyi 40% dikkate alınarak) ve Geniş Enstitüsü verilerine (Tablo 1) hem kıyasla 30 pg veri kümesi bu kriterleri yerine getirmektedir. 300 pg veri kümesi 98% Top 40 örtüşme oranı (Şekil 7) ile Broad Enstitüsü&#39;nden verilerine hemen hemen aynı doruklarına gösterir. ighres.jpg &quot;/&gt; 10.000 hücreleri ChIP-seq deneyler 7. ChIP deneyleri Şekil ve kütüphane nesil H3K4me3 antikoru (/ ul 0.25 mikrogram) ile 10,000 ve 100,000 HeLa-S3 hücreleri üzerinde oluşturulmuştur. 35 bp etiketleri ELAND hizalayıcısı insan genomunun eşleştirilmiş edildi. SICER güvenilir düşük hücre sayıları yanı sıra hücrelerin milyonlarca zenginleşme tespit olabilir çağırarak sonraki zirve sırasında. veri setleri analiz edilmiş ve her bir diğeri ile ve geniş Enstitüsü tarafından oluşturulan bir referans veri ile karşılaştırıldı. düşük hücre numuneleri uygun olan ve çok yüksek bir benzerlik mevcuttur. 30 pg örnek yerine ENCODE kriterleri 11 (dk. Doruklarına üst% 40% 80 üst üste gelmelidir). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/52150/52150table1.jpg" /> Tablo 1. </strong&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells at JoVE.com

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

ChIP-seq Denemeleri otomatikleştirme 10.000 HeLa Hücreleri üzerinde epigenetik Profilleri oluşturmak için

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

automating-chip-seq-experiments-to-generate-epigenetic-profiles-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Görüntüleme.  Diagenode S.A.. Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

Video: Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Biyoloji

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

Özel MicroRNA Mikroarray deneyler gerçekleştirme

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making malaria control an omnipresent problem in tropical countries. The emergence of insecticide resistant populations warrants the exploration of novel drug target pathways and compounds for vector mosquito control. Epigenetic drugs are well established in cancer research, however not much is known about their effects on insects. This study provides a simple protocol for examining the toxicological effects of 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an experimental epigenetic drug for cancer therapy, on the malaria vector, Anopheles gambiae. A concentration-dependent increase in mortality and decrease in size was observed in immature mosquitoes exposed to DZNep, whereas the compound reduced the fecundity of adult mosquitoes relative to control treatments. In addition, there was a drug-dependent decrease in S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase activity in mosquitoes following exposure to DZNep relative to control treatments. These protocols provide the researcher with a simple, step-by-step procedure to assess multiple toxicological endpoints for an experimental drug and, in turn, demonstrate a unique multi-prong approach for exploring the toxicological effects of water-soluble epigenetic drugs or compounds of interest against vector mosquitoes and other insects.

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Sıtma Sivrisinekler Gelişimi, doğurganlık ve Kalma bir Epigenetik İlaç Test Etkileri Toksikolojik Tahliller

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteinler

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...