This work was supported by the BLUERPINT EU grant (BLUEPRINT &#8211; A BLUEPRINT of Haematopoietic Epigenomes). We also thank the Walloon Region (DG06) for its financial support.

<ol>
	<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6, 1656-1668 (2011).</li><li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nature Protocols. 8, 539-554 (2013).</li><li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHT-ChIP-seq:+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation.">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biology. 14, 124 (2013).</li><li>Farias-Hesson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+library+preparation+for+high-throughput+DNA+sequencing+platforms.">Semi-automated library preparation for high-throughput DNA sequencing platforms.</a> Journal of Biomedicin., &amp; Biotechnology. 2010, (2010).</li><li>Callejas, S., Alvarez, R., Benguria, A., Dopazo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AG-NGS:+a+powerful+and+user-friendly+computing+application+for+the+semi-automated+preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+open+liquid+handling+platforms.">AG-NGS: a powerful and user-friendly computing application for the semi-automated preparation of next-generation sequencing libraries using open liquid handling platforms.</a> BioTechniques. 56, 28-35 (2014).</li><li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data.">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25, 1952-1958 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137 (2008).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities.">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38, 576-589 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 26, 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).</li></ol>

The authors of this article, at the time of its writing, are employed by Diagenode S.A. and Diagenode, Inc., the manufacturer of the automated system described.

مناعي لونين تليها التسلسل هو الآن إجراء القياسية. هنا يرد على رقاقة وما يليها بروتوكول الآلية التي يمكن أن تولد ملامح جينية لونين مع عدد قليل من 10،000 خلايا بدءا المادية. أتمتة الشذرة وإعداد المقايسات مكتبة يتيح توحيد الإجراء الشذرة الأمثل والحد من التقلبات التجريبية. نظام معالجة السائل المقدمة هنا يلغي العديد من الإجراءات اليدوية المرتبطة الشذرة الحد يد في الوقت المناسب لدقيقة فقط 30، ويقلل من فقدان العينة، وتمكن دقيق رقاقة وما يليها مع عدد قليل من بيكوغرام من المدخلات المكتبة. من أجل تحقيق نجاح التجارب رقاقة وما يليها الآلي، بل هو أيضا حاسما لاستخدام ذات جودة عالية التحضيرات لونين المنفصمة والأجسام المضادة الصف رقاقة وما يليها في كل تجربة نظام يستخدم التكنولوجيا القائمة على حبة المغناطيسي، ويوفر المرونة اللازمة لتغيير المعلمات التجريبية الرئيسية مثل حضانة الوقت للمعطف الأجسام المضادةخطوات مناعي أو تعديل الشروط غسل السماح للباحث لإجراء جميع التجارب اللازمة لرقاقة وما يليها الأمثل جي و. النظام الآلي هو منصة &quot;فتح&quot; التي تسمح أيضا مقارنة الكواشف متعددة في نفس الوقت لتعظيم الاستفادة من الظروف التجريبية لكل خط الخلية الفردية والأجسام المضادة وتمكن المقارنة المباشرة من مختلف الأنواع وتركيزات الكروماتين، والأجسام المضادة المختلفة وأنواع مختلفة من حتى المغناطيسي الخرز. واحد من أوجه القصور في النظام الآلي هو الحاجة للأتمتة كافة البروتوكولات في وحدات التخزين التي تتراوح بين 5 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر. ومع ذلك، فإن التصغير من التجارب في هذا المنبر الآلي يمكن أيضا توفير التكاليف في الكواشف. وبالإضافة إلى البروتوكولات المذكورة في هذه الدراسة، فإن هذا النظام قابل للتكيف وبأتمتة مجموعة متنوعة من التطبيقات الأخرى المستندة حبة المغناطيسية مثل مناعي وأيضاالثانية القبض على الحمض النووي ميثليته (تقنيات MeDIP وMethylCap)، مناعي من الحمض النووي hydroxylmethylated (hMEDIP)، متتابعة مناعي لونين (ReChIP)، مناعي RNA (RNA-IP)، وتحويل بيسلفيت، والمقايسات تنقية DNA.

كما أصبحت الجيل التالي من التسلسل (NGS) التقنيات على نطاق واسع وأيسر منالا، والطريقة الأساسية لرسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات-DNA البروتين لونين الآن مناعي تليها الكشف NGS (رقاقة وما يليها)، والتي تمكن من اكتشاف عامل النسخ مواقع أو أنماط من التعديلات هيستون ملزمة. رقاقة وما يليها هو مفيد في توفير بيانات عالية الإنتاجية من الجينوم بأكمله والتي يمكن استخدامها للتحليل الكمي والنوعي للتفاعلات-DNA البروتين عن طريق قياس شظايا الحمض النووي المخصب. ومع ذلك، هناك بعض العيوب في التجارب رقاقة وما يليها القياسية مثل صعوبة في الحصول على ما يكفي من المواد لإنشاء مكتبة التسلسل. وتنقسم التجارب الشذرة إلى ستة الخطوات الأساسية بما في ذلك المناطق ملزمة 1) يشابك البروتين DNA 2) إعداد العينات التي تضم تحلل الخلايا والقص لونين من قبل صوتنة، 3) تشكيل immunocomplexes،4) هطول الأمطار من immunocomplexes، 5) غسل immunocomplexes، و6) شطف من اليورانيوم المخصب وتحليلها من قبل QPCR وNGS. نجاح مقايسة الشذرة يعتمد على ثلاثة عوامل رئيسية هي: التحضير الجيد لونين، وكمية المستضد في العينة الأصلية، وخصوصية وتقارب من الأجسام المضادة للمستضد لها وما شابه ذلك. وجود قيود الرئيسي هو شرط لكميات عالية من بدء أعداد الخلايا من أجل الحصول على ما يكفي من الحمض النووي المخصب لإنشاء مكتبة التسلسل. للعلماء الذين يعملون مع كميات عينة محدودة، مثل عينات الخزعة أو خلية السكان الفرعية، والتجارب رقاقة وما يليها هي صعبة للغاية. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن المقايسات رقاقة وما يليها يمكن أن يؤديها عند العمل مع كمية قليلة من الخلايا 1 و 2. وقد وضعت Diagenode نظام الروبوتية معالجة السائل الذي يمكن أتمتة تماما التجارب رقاقة وما يليها عند البدء مع عدد محدود من الخلايا. يوفر أتمتةمزايا عديدة أكثر من إعداد دليل للعينات رقاقة وما يليها كما أنه يقلل الأخطاء البشرية، ويقلل من التباين، ويقلل من تكلفة التجريبية. تم الإبلاغ عن بروتوكولات الآلي نصف لمناعي الكروماتين وإعداد مكتبة ولكن أيا من هذه الدراسات أظهرت البيانات عند استخدام أرقام الهواتف المحمولة منخفضة 3، 4، 5، 6. في هذه الورقة يتم وصف سير العمل الآلي الكامل لكل من لونين مناعي وإعداد المقايسات مكتبة في نظام مناولة السائل الروبوتية التي تستخدم التكنولوجيا القائمة على حبة المغناطيسية والتي يمكن أن تعالج معلمات متعددة في تحسين البروتوكول. هنا، وأجريت التجارب رقاقة وما يليها الآلي بنجاح على عدد محدود من الخلايا مع هدف تبسيط وتوحيد، وتوفير حل موثوق بها لدراسة ملامح جينية في السكان الخلية الصغيرة. وقد تم تحسين بروتوكول الشذرة الآلي وصفها في هذه الورقة على خلايا هيلا باستخدام الأجسام المضادة هيستون محددة والكواشف بالتحرير سير العمل يمكن تكييفها لخطوط الخلايا الأخرى، والأجسام المضادة مع المقابلة الأمثل التجريبية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="917">
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:333px;">Product Description</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:107px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:367px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Formaldehyde 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">1,25M Glycine Solution</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Shearing Buffer iS1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protease Inhibitors Mix (200x)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14175-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer tL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP Buffer tC1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ideal ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagneode</td>
			<td>C01010051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP-Buffer H</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td>Component of the Auto Histone ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto Histone ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto True Micro ChIP kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K79me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15310068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K27me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me2 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K36me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Rabbit IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protein-A coated paramagnetic beads</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto IPure</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroChIP DiaPure columns</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Universal SyberGreenMaster Mix 1.25ml</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>DMMLD2D100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quant-IT dsDNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroPlex Library Preparation Kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C05010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Library prep Quantification kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">IP-Star Compact&#160; Automated System</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B03000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Pico</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Qubit system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Hiseq systems</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating chip-seq experiments to generate epigenetic profiles on 10,000 hela cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

تحسين تجارب رقاقة وما يليها الآلي لمدة ثماني علامات هيستون مختلفة من أجل تطوير بنجاح والتحقق من صحة البروتوكولات الشذرة الآلي، والأجسام المضادة الصف رقاقة وما يليها التي تم التحقق من صحتها من قبل في تجارب اليدوية رقاقة تسلسل (لا تظهر البيانات) وقد تم اختيار. وقد تم اختيار الأجسام المضادة الصف رقاقة وما يليها التالية لهذه الدراسة: مكافحة H3K79me3، -H3K27me3، -H3K4me3، -H3K4me2، -H3K9ac، -H3K9 / 14ac، -H3K36me3 و-H3K9me3. وأكد على خصوصية كل الأجسام المضادة الصف رقاقة وما يليها من قبل لطخة نقطة، صفائف الببتيد والتجارب البقعة الغربية (لا تظهر البيانات). وأجريت التجارب الرائدة الشذرة-QPCR مع زيادة كميات الأجسام المضادة لتحديد حساسية الأجسام المضادة (الشكل 3). QPCR مع اثنين على الأقل إيجابية وهدفين سيطرة سلبية وقد تم تحليل وملامح مع التخصيب الإيجابية على الهدف السلبي أعلى من خمسة أضعاف مؤهلون لتسلسل والخبير<html> iments. من المهم لأداء رقاقة ورقاقة وما يليها التجارب مع جودة عالية من لونين المنفصمة. أجريت جميع التجارب الشذرة هو مبين في هذا المنشور باستخدام لونين الطازجة. ومن الممكن أيضا لتجميد الخلايا الثابتة في -80 ° C والمضي قدما في التحضير لونين والقص في يوم مختلف. ومع ذلك، لونين أعد من خلايا ثابتة المجمدة قد تتصرف بشكل مختلف من لونين الطازجة، وبالتالي قد يحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل إعداد لونين الظروف صوتنة. عند العمل مع أنواع مختلفة من الخلايا، ومخازن القص مع تركيبة المنظفات المختلفة (SDS) يمكن استخدامها. أنواع الخلايا مثل خطوط الخلايا الأولية أو خلية تزرع في تعليق هي خلايا صعبة للقص وسوف تتطلب تركيزات عالية SDS (1٪) في حين خطوط الخلايا التي يسهل القص مثل هيلا سيتطلب تركيزات منخفضة SDS (0.1٪) في مخازن القص. res.jpg &quot;/&gt; الشكل 3. التحقق من الأجسام المضادة الشذرة الصف باستخدام نظام الأتمتة. تم تنفيذ الشذرة مع anti-H3K79me3، -H3K27me3، -H3K4me3، -H3K4me2، -H3K9ac، H3K9 / 14ac، -H3K36me3 و-H3K9me3 الأجسام المضادة الأرنب بولكلونل على لونين المنفصمة من 1 مليون دولار خلايا هيلا-S3 اعتمادا على التعديلات هيستون. واستخدمت بروتوكولات الشذرة الآلي مع وحدات التخزين العمل 200 ميكرولتر في الصك الآلي للتجارب الأجسام المضادة المعايرة. تم اختبار الأجسام المضادة كميات من 1، 2، 5 و 10 ميكروغرام في التجربة الشذرة واستخدمت 2 ميكروغرام مفتش كما سيطرة سلبية في كل تجربة. تم تقييم التخصيب التي كتبها QPCR. وتظهر نتائج كنسبة مئوية من المدخلات (المبلغ النسبي من الحمض النووي DNA immunoprecipitated مقارنة المدخلات بعد تحليل QPCR). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> بعد التأكد من صحتها وتحديد أوبتيما<html> كميات لتر من الأجسام المضادة الشذرة الصف لاستخدامها في نظام التشغيل الآلي، وأجريت التجارب رقاقة وما يليها الآلي من أجل إنشاء ملفات تعريف التسلسل لكل التعديل هيستون (الشكل 4). <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig4highres.jpg" /> الشكل 4. هيستون رقاقة وما يليها محات المتولدة عن تجارب رقاقة وما يليها الآلي. ويوضح الشكل لمحات رقاقة وما يليها في المناطق الجينومية مختلفة لH3K4me3، H3K9ac وH3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3، وH3K36me3. يظهر 4A توزيع الذروة على طول X الكامل -chromosome و4B التوزيع في منطقة 75 كيلو بايت المحيطة الجينات GAPDH. يظهر 4C لمحات من H3K27me3، H3K36me3 وH3K4me3 في منطقة 500 كيلو بايت المحيطة الجين MYT1 و4D يظهر توزيع H3K9me3 في ZNF12 المحيطة 200 كيلوبايت المنطقة.large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. تم إنشاء هيستون ملامح جينية لمدة ستة التعديلات هيستون مختلفة تترافق مع التعبير الجيني (H3K4me3، H3K9ac، H3K9 / 14ac، H3K4me2، H3K79me3 وH3K36me3). ويبين الشكل 4A ملامح رقاقة وما يليها على طول الكروموسوم X لعلامات هيستون مختلفة. العلاقة ذروة عالية لوحظ بين 6 محات هيستون المختلفة يدل على قدرات نظام آلي لتوليد بيانات دقيقة وموثوق بها. الشكل 4B، 4C و 4D تظهر توزيع قمم للتعديلات هيستون مختلفة في المناطق الجينومية محددة. الآلي التجارب الكروماتين مناعي وصولا الى 200 خلية الحد الأدنى من الخلايا التي يمكن استخدامها في التجارب الشذرة يعتمد على نوعية من لونين، وspecificitذ وحساسية الأجسام المضادة وفرة من التعديل هيستون أو البروتين دراستها. اختيار الأجسام المضادة جيدة رقاقة وما يليها الصف المهم عند العمل مع كميات محدودة من العينة واختيار الكواشف الأمثل وشركات مختلفة يحسن كفاءة الانتعاش DNA والمساهمة في نجاح التجربة الشذرة. لتحديد الحد الأدنى من الخلايا التي بروتوكول الشذرة الآلي يمكن معالجة كميات مختلفة من لونين، الأجسام المضادة، وحبات مغناطيسية تم اختبارها في النظام الآلي IP-ستار باستخدام الكواشف الشذرة على وجه التحديد الأمثل للعمل مع كميات منخفضة من لونين. أولا، كان sonicated لونين من 10،000 الخلايا كما هو موضح في البروتوكول. تم تأكيد النتائج الشذرة التي كتبها QPCR (الشكل 5A) مما يدل على التخصيب كبيرة مع H3K4me3 الأجسام المضادة في مناطق السيطرة الإيجابية وإشارة تذكر في مناطق سيطرة سلبية. وعلى سبيل المقارنة وإثبات الاتساق، additionaوتقدم البيانات التي تم الحصول عليها لتر مع H3K27ac، H3K9me3، والأجسام المضادة H3K27me3، وذلك باستخدام 10،000 الخلايا. وأجريت التجارب الشذرة الآلي ثم لإثبات قدرات النظام الآلي للعمل مع كميات منخفضة من الخلايا باستخدام نفس H3K4me3 الأجسام المضادة. رقاقة الآلي أداء جيدا، ويتجلى ذلك سلسلة من عشرة ردود الفعل IP التي كانت استنساخه وقابلة للمقارنة إلى حد كبير مع اليدوية النتائج الشذرة (الشكل 5B). وأجريت التجارب اليدوية والآلية وشوهدت فوائد البروتوكولات الآلي في الحد من تجربة إلى تجربة تقلب (الشكل 5C). <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig5highres.jpg" /> الشكل 5. الأمثل من رقاقة والسيارات رقاقة تجارب على خلايا 10،000 أجريت التجارب الشذرة دليل على 10،000 الخلايا وباستخدام 0.25 ميكروغرام من H3K4me3، 0.1 ميكروغرام من H3K27ac، و 0.5 ميكروغرام من H3K9me3 و 0.25 ميكروغرام من الأجسام المضادة H3K27me3. واستخدمت كميات مماثلة من أرنب مفتش كمجموعة تحكم. تم إجراء QPCR مع الاشعال لمدة مواضع إيجابي واثنين من مواضع السلبي لكل مقايسة الشذرة. ويبين الشكل 5A الانتعاش، كنسبة مئوية من المدخلات (المبلغ النسبي من الحمض النووي DNA immunoprecipitated مقارنة المدخلات بعد تحليل QPCR). الشكل 5B العروض 10 ردود الفعل رقاقة تعمل على النجوم IP المدمجة باستخدام 0.25 ميكروغرام H3K4me3 الأجسام المضادة بولكلونل و 0.25 ميكروغرام من أرنب مفتش سيطرة سلبية لأنه الأجسام المضادة. ثم تم إجراء تحليل QPCR مع الاشعال للالإيجابي المروج مواضع EIF4A2 وGAPDH TSS والسلبية مواضع الميوجلوبين exon2 وSAT2. ويوضح الشكل الانتعاش، معبرا عنه كنسبة مئوية من المدخلات (مبلغ النسبي من الحمض النووي DNA immunoprecipitated مقارنة المدخلات بعد تحليل QPCR). ويبين الشكل 5C البيانات H3K4me3 الشذرة من 10 تجارب الشذرة اليدوية بالمقارنة مع 10 رقاقة التجارب الآلي. أشرطة الخطأ تمثل الصورة<html> الانحرافات tandard كل من مكررات عشرة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> من أجل فهم حساسية البروتوكولات الشذرة الآلي، وأجريت التجارب باستخدام مبلغ من الخلايا التي تراوحت بين 100،000 الى 200 خلية لكل IP. تم استخدام الأجسام المضادة لمكافحة H3K27me3 كما هو تعديل هيستون شائع جدا. استخدام أخرى هيستون أو عدم هيستون الأجسام المضادة قد تتطلب خلايا أكثر أو أقل، اعتمادا على وفرة حاتمة ونوعية الأجسام المضادة. تم التحقق من صحة التجارب التي كتبها الكمي PCR ولوحظ أن من خلال تقليل كميات من الخرز والخلفية الأجسام المضادة في التجارب يتم تخفيض السماح نتائج ناجحة الشذرة-QPCR مع اقل من 200 خلية الأجسام المضادة (الشكل 6). ديزيل / ftp_upload / 52150 / 52150fig6highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 6. الآلي المقايسات رقاقة على 200 خلية. خلايا هيلا-S3 والأجسام المضادة الموجهة ضد H3K27me3. تم المنفصمة لونين من 1 مليون خلية والتخفيفات المسلسل من هذه الكروماتين (من 100،000 إلى 200 أي ما يعادل الخلية) استخدمت في رد الفعل الشذرة. واستخدمت 1 ميكروغرام من H3K27me3 و 10 ميكرولتر من البروتين المغلفة وحبات مغناطيسية على التجربة 100،000 الخلايا، 0.5 ميكروغرام من H3K27me3 و 10 ميكرولتر من الخرز على 10،000 و 1،000 خلايا، و 0.25 ميكروغرام من H3K27me3 و 5 ميكرولتر من الخرز مع 500 و 200 الخلايا. استخدمت 1 ميكروغرام و 0.5 ميكروغرام من أرنب مفتش كما سلبي تحكم الأجسام المضادة عند إجراء التجارب مع 100،000 الخلايا وخلايا 1،000 على التوالي. ويظهر 6A إشغال TSH2B وGAPDH الجينات في المائة خلال الإدخال. يظهر 6B الإشغال النسبي للTSH2B مقابل السيطرة GAPDH السلبية المنطقة الجينومية. تحليل المصب من النتائج الشذرة وما يليها على10،000 خلايا من أجل تقييم الجودة العالمية من التجارب الآلي رقاقة وما يليها مع أرقام انطلاق منخفضة من الخلايا، وأجريت فحوصات الآلي رقاقة وما يليها مع 0.25 ميكروغرام من الأجسام المضادة H3K4me3 على 10،000 خلايا هيلا والتجارب رقاقة على واستخدمت 100،000 خلايا هيلا-S3 كما السيطرة الإيجابية للتجربة. تم إعداد المكتبات الآلي باستخدام مكتبة MicroPlex الكواشف إعداد عدة تتكيف مع المكتبات مستعدة مع كميات DNA منخفضة. لاحظ أنه على الرغم من أنه من الممكن أن تؤدي ناجحة الآلي الشذرة-التجارب مع أقل من 10،000 الخلايا، فإن كميات من الحمض النووي انزلوا لا تكون كافية لإعداد المكتبات باستخدام الكواشف عدة. وأجريت الجيل العنقودية والتسلسل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. يحلل المعلوماتية الحيوية بعد العرض التسلسل نتائج باهرة من العينات منخفضة الشذرة عدد الخلايا. مجموعة البيانات 30 خريج (الموافق 10،000 الخلايا من المواد ابتداء من<html> ) يحتوي على انخفاض الضوضاء في الخلفية وقمم تخصيب موثوق بها للغاية والتي أكدت من قبل كل من مجموعة البيانات 300 خريج (الموافق 100،000 الخلايا من المواد ابتداء) ومجموعة البيانات H3K4me3 الناتجة عن المعهد واسعة للمشروع ترميز والذي تم استخدامه بمثابة مرجع خارجي. ومن المهم أن نلاحظ أعلى 40 التداخل نسبة البيانات، والتي تشير إلى الطريقة القياسية المستخدمة في المشروع ENCODE 11 التي تعتبر رقاقة وما يليها استنساخه إذا بمقارنة مجموعتين من البيانات هناك ما لا يقل عن التداخل 80٪ من أفضل 40٪ من القمم التي كتبها درجة الأهمية في المرتبة. مجموعة البيانات 30 خريج يحقق هذه المعايير بالمقارنة مع كل من مجموعة البيانات 300 خريج (النظر في جميع مستويات الذروة التي بلغتها، وليس فقط أفضل 40٪) وبيانات معهد برود (الجدول 1). ويوضح بيانات 300 خريج قمم مماثلة تقريبا لبيانات معهد برود مع 98٪ أعلى 40 نسبة التداخل (الشكل 7). ighres.jpg &quot;/&gt; تم إنشاء الشكل 7. المقايسات رقاقة وتوليد المكتبة على 10،000 خلايا التجارب رقاقة وما يليها على 10،000 و 100،000 خلايا هيلا-S3 باستخدام H3K4me3 الأجسام المضادة (0.25 ميكروغرام / ميكرولتر). تم تعيين علامات غليان 35 إلى الجينوم البشري مع اليجنر إلاند. خلال ذروة اللاحقة يدعو SICER يمكن تحديد موثوق التخصيب من أعداد الخلايا منخفضة وكذلك من ملايين الخلايا. تم تحليل مجموعات البيانات ومقارنتها مع بعضها البعض، وإلى البيانات المرجعية التي تولدها معهد برود. عينات الخلايا منخفضة تتفق ولها تشابه عالية جدا. تلبي العينة 30 خريج معايير ترميز 11 (دقيقة. 80٪ من أعلى 40٪ من القمم يجب أن تتداخل). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/52150/52150table1.jpg" /> الجدول 1. </stroنانوغرام&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells at JoVE.com

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

أتمتة التجارب رقاقة وما يليها لتوليد الملامح جينية على خلايا هيلا 10،000

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

automating-chip-seq-experiments-to-generate-epigenetic-profiles-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Views.  Diagenode S.A.. Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

Video: Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

تحليل وظيفة GTPases الصغيرة التي Microinjection من البلازميدات إلى الخلايا الظهارية المستقطب

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

تجارب أداء مخصص ميكروأري MicroRNA

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

جيل من جودة عالية لونين القالب الحمض النووي مناعي لتسلسل عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

جيل من Myospheres من hESCs بواسطة إعادة برمجة جينية

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making malaria control an omnipresent problem in tropical countries. The emergence of insecticide resistant populations warrants the exploration of novel drug target pathways and compounds for vector mosquito control. Epigenetic drugs are well established in cancer research, however not much is known about their effects on insects. This study provides a simple protocol for examining the toxicological effects of 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an experimental epigenetic drug for cancer therapy, on the malaria vector, Anopheles gambiae. A concentration-dependent increase in mortality and decrease in size was observed in immature mosquitoes exposed to DZNep, whereas the compound reduced the fecundity of adult mosquitoes relative to control treatments. In addition, there was a drug-dependent decrease in S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase activity in mosquitoes following exposure to DZNep relative to control treatments. These protocols provide the researcher with a simple, step-by-step procedure to assess multiple toxicological endpoints for an experimental drug and, in turn, demonstrate a unique multi-prong approach for exploring the toxicological effects of water-soluble epigenetic drugs or compounds of interest against vector mosquitoes and other insects.

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

فحوصات السمية للاختبار تأثيرات جينية من المخدرات للتنمية، الخصوبة والوراثة من الملاريا البعوض

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

نظم هيلا خلية استنادا حرية التعبير للتعبير عن<em&gt; المتصورة</em&gt; المقيرع البروتينات

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

قياس وتحليل حمض خارج الخلية الإنتاج لتحديد معدل حال السكر

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...