This work was supported by the BLUERPINT EU grant (BLUEPRINT &#8211; A BLUEPRINT of Haematopoietic Epigenomes). We also thank the Walloon Region (DG06) for its financial support.

1. Gli esperimenti ChIP standard <ol><li> Raccolta delle cellule e DNA-proteine ​​reticolazione. <ol><li> Crescere cellule HeLa-S3 ad una confluenza del 80% -90%. Rimuovere terreno di coltura, lavare il piatto due volte con 10 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS), e aggiungere tripsina-EDTA (1x) alla piastra di coltura. Incubare per un massimo di 2 min per staccare le cellule dal piatto. Raccogliere le cellule e lavare due volte con 10 ml di PBS. NOTA: più lunghi tempi di incubazione porterà a danni cellulari. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 minuti a 500 xg e risospendere le cellule in 20 ml di PBS. Procedere per contare le cellule. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 minuti a 500 xg, scartare il surnatante e aggiungere 500 ml di PBS. Il numero ottimale di cellule per la fase di fissaggio è di 10 milioni di cellule per 500 ml di PBS. </li><li> Aggiungere 13,5 ml di fresco 37% di formaldeide in ciascuna aliquota di 500 microlitri di sospensione cellulare. Fissare le cellule per 8 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 57 ml di 1,25 M glicina solution per fermare la fissazione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente con miscelazione costante delicatamente vortice. Lavorare sul ghiaccio da questo punto in poi. </li><li> Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il supernatante senza disturbare il pellet di cellule. </li><li> Lavare le cellule due volte con 1 ml di PBS. Eliminare delicatamente il surnatante e mantenere il pellet di cellule in ghiaccio. </li></ol></li><li> Lisi cellulare e cromatina taglio <ol><li> Aggiungere 10 ml di ghiaccio di lisi freddo IL1 tampone al pellet (1 ml di tampone di lisi per 1 milione di cellule è il rapporto ottimale). Pipetta su e giù diverse volte e incubare per 10 min a 4 ° C con miscelazione delicata. </li><li> Centrifugare il lisato per 5 minuti a 500 xg e 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 10 ml di tampone di lisi freddo ghiaccio IL2 ai lisati e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Incubare i lisati per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 500 xg e 4 ° C e scartare il surnatante. </li><li> Prepare il buffer tranciatura completa aggiungendo il 200x cocktail inibitore di proteasi (PIC) al buffer taglio IS1. Mantenere il buffer in ghiaccio per 5 min e lavorare in ghiaccio dopo. Aggiungere 1 ml di completo buffer di taglio IS1 a ogni 10 milioni di cellule pellet e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Prima sonicazione incubare i campioni in ghiaccio per 10 min per ridurre la viscosità del campione. </li><li> Al taglio di 300 aliquote microlitri di cromatina mediante ultrasuoni utilizzando un bagno di acqua sonicatore per 2 o 3 serie da 10 cicli ciascuno. Un ciclo consiste di 30 sec &quot;ON&quot; e 30 sec &quot;OFF&quot; in un ambiente ad alta potenza. In alternativa, utilizzare un dispositivo pico-sonicazione con un tempo più breve sonicazione 5 a 10 cicli di 30 sec &quot;ON&quot;, 30 sec &quot;OFF&quot;. Brevemente vortex e girare i tubi tra le piste. Quando si utilizzano altri tipi di sonicatori, seguire le corrispondenti istruzioni del produttore per la cromatina taglio. </li><li> Centrifugare la cromatina tranciati a 16.000 xg per 10 min e collect il surnatante da utilizzare immediatamente nella fase IP. In alternativa, conservare la cromatina a -80 ° C per un massimo di 2 mesi per un uso futuro. </li><li> Analizzare l&#39;efficienza di taglio cromatina prima immunoprecipitazione passo con 1-1,5% gel TAE agarosio o bionalyzer. Ottime dimensioni frammento cromatina vanno da 100-600 bp. </li></ol></li></ol> 2. Basso Esperimenti chip Cell <ol><li> Raccolta delle cellule e DNA-proteine ​​reticolazione <ol><li> Crescere cellule HeLa-S3 ad una confluenza del 80% -90%. Rimuovere terreno di coltura, lavare il piatto due volte con 10 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS), e aggiungere 1x Tripsina-EDTA alla piastra di coltura. Incubare per un massimo di 2 min per staccare le cellule dal piatto. NOTA: più lunghi tempi di incubazione porterà a danni cellulari. </li><li> Raccogliere cellule aggiungendo 1 ml di mezzo di coltura contenente siero in una provetta centrifugazione 1 ml. Contare le cellule. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g. Portare il numero di cellularea 10.000 cellule per ml di terreno di coltura per la fissazione. </li><li> Aggiungere 27 ml di 36,5% di formaldeide fresco preparato in ciascuna provetta per il fissaggio. Capovolgere il tubo due o tre volte e incubare 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 115 ml di soluzione 1,25 M glicina al campione, invertire il tubo due o tre volte e incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Lavorare sul ghiaccio da questo punto in poi. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante lentamente. </li><li> Lavare le cellule con 1 ml di ghiaccio freddo HBSS con PIC (200x, concentrazione finale 1x). Capovolgere il tubo due o tre volte per risospendere le cellule e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare delicatamente il surnatante e mantenere il pellet di cellule in ghiaccio. </li></ol></li><li> Lisi cellulare e cromatina taglio <ol><li> Aggiungere 25 ml di tampone di lisi completa tL1 (Lysis Buffer tL1 + PIC) per 10.000 cellule e agitare manualmente il fondo della provetta per risospendere le cellule. Incubare in ghiaccio per 5 min. </li><li> Aggiungere 75 ml di completo HBSS (HBSS + PIC) tampone in ciascuna aliquota contenente 10.000 cellule. </li><li> Taglio aliquote di 100 microlitri di 10.000 cellule per ultrasuoni per 5 set di 5 cicli ciascuno. Un ciclo si compone di 30 sec &quot;ON&quot; e 30 sec &quot;OFF&quot; l&#39;impostazione ad alta potenza. In alternativa, utilizzare un dispositivo pico-sonicazione utilizzato con un tempo di sonicazione più breve di 5 cicli di 30 sec &quot;ON&quot;, 30 sec &quot;OFF&quot;. Ottime dimensioni frammento cromatina vanno da 100-600 bp. Si noti che i preparativi cromatina, tipi di cellule e diversi sonicatori richiedono esperimenti di ottimizzazione taglio separati. </li><li> Centrifuga la cromatina tranciati a 14000 g per 10 minuti a scartare il materiale insolubile e raccogliere il surnatante da utilizzare immediatamente nella fase IP. In alternativa, conservare la cromatina a -80 ° C per un massimo di 2 mesi per un uso futuro. </li><li> Analizzare l&#39;efficienza di taglio cromatina prima fase immunoprecipitazione utilizzando 1-1,5% TAE gel di agarosio oil bionalyzer. Campioni Trattare con RNase prima agarosio analisi gel al fine di migliorare la valutazione visiva di taglio. Ottime dimensioni frammento cromatina vanno da 100-600 bp. </li></ol></li></ol> 3. Immunoprecipitazione della cromatina e Biblioteca Prep <ol><li> Per standard, automatizzato esperimenti ChIP <ol><li> Aggiungere 120 ml di chip di buffer H (ChIP Buffer H + PIC) a 100 microlitri tranciate cromatina. Utilizzare 200 ml per la IP e mantenere 2 ml a 20 ml, come campione di ingresso. </li><li> Selezionare il chip 200 microlitri protocollo automatizzato nello strumento di automazione. La velocità del protocollo è da 1 a 16 campioni per corsa. </li><li> Eseguire un esperimento ChIP automatico utilizzando, cromatina pari a 1-2 milioni di cellule, 1-2 mg di anti-H3K79me3, grado -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 e H3K9me3 ChIP-seq coniglio anticorpi policlonali. Quantità ottimali di anticorpo variano a seconda della modifica degli istoni e l&#39;affinità e specificity dell&#39;anticorpo corrispondente. <ol><li> Usare la stessa quantità di IgG di coniglio non immune da un anticorpo controllo isotipico. In alternativa, utilizzare perle non rivestiti o specifici anticorpi bloccato come controlli chip. Aggiungere 20 ml di proteina A sfere magnetiche rivestite per ogni reazione. </li></ol></li><li> Utilizzare i istoni automatizzato reagenti ChIP-seq per effettuare esperimenti di ChIP automatizzate con anti-H3K79me3 e policlonali -H3K4me2. Utilizzare i reagenti del kit chip ss ideali per eseguire esperimenti chip anti-H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 e -H3K9me3. </li><li> Selezionare il protocollo ChIP automatico seguendo le istruzioni del software implementate nel dispositivo di automazione. Impostare i parametri sperimentali chip per 4 ore per la fase di rivestimento di anticorpi e 15 ore per il passo immunoprecipitazione. La fase di reticolazione inverso avviene nello strumento automatizzato a 65 ° C per 4 ore. </li><li> Purificare il DNA inverso reticolato sul sistema automatizzato. Seleziona autprotocolli omated per la purificazione del DNA con un protocollo o un kit con magnetico purificazione del DNA basato tallone. Eluire il DNA in 25 ml di acqua. </li><li> Quantificare il DNA immunoprecipitato estraendo 10% del DNA immunoprecipitato. La resa DNA immunoprecipitato dipende dalla qualità della cromatina e anticorpi, tipo di cellula e la modifica di destinazione istoni. Quantificare il DNA utilizzando un kit di test secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Analizzare la qualità del DNA immunoprecipitato mediante PCR quantitativa utilizzando primer per almeno 1 positivo e 1 controllo negativo regioni genomiche. Non utilizzare più del 10% del DNA immunoprecipitato totale per valutare arricchimenti chip. <ol><li> Preparare le reazioni qPCR. Aggiungere 10 ml di una master mix 2x SyberGreen qPCR, 1 ml di miscela di primer, 1-5 ml di DNA immunoprecipitato o ingresso e acqua sterile fino a 20 ml di volume di reazione finale. Il programma qPCR prevede una fase iniziale di denaturazione a 95 ° Cper 5-10 minuti a seconda del fornitore della Taq polimerasi e le temperature di ricottura deve essere impostato secondo i primer selezionati. </li></ol></li><li> Utilizzare automatizzato protocolli biblioteca preparazione compatibili con i Illumina ChIP-seq reagenti preparazione biblioteca disponibili in commercio per costruire le librerie utilizzando sia ChIP DNA e il DNA di ingresso salvato dalla stessa preparazione cromatina. Utilizzare 10-20 ng di DNA immunoprecipitato da ciascun anticorpo per la preparazione libreria. Preparare fino a 16 librerie automatizzate per ciclo. </li><li> Sequenza le librerie e generare cluster in base alle istruzioni del produttore Illumina. Eseguire bioinformatica primaria analisi (filtraggio cluster, chiamata di base, etc.) seguendo la Illumina conduttura, filtro standard e allineare la legge per l&#39;ultimo gruppo di genoma umano (la versione corrente è GRCh38) con l&#39;assetto ELAND. Utilizzare SICER 7 o MACS 8 per il picco di chiamata ed effettuare le analisi a valle di cime wesimo Homer 9, BEDTools 10 o software preferito. </li></ol></li><li> Per numero automatizzato basso cellulari esperimenti ChIP <ol><li> Aggiungere 120 ml di tampone ChIP completa tC1 (ChIP Buffer tC1 + PIC) a 100 microlitri tranciate cromatina. Utilizzare 200 ml per la IP e mantenere 20 microlitri come input. </li><li> Selezionare automatizzato protocollo microlitri ChIP 200 nel sistema di automazione. La velocità del protocollo è da 1 a 16 campioni per corsa. </li><li> Eseguire un esperimento ChIP-seq automatizzato utilizzando reagenti ChIP automatizzati e anticorpi ChIP qualità ottimizzati per lavorare sulle quantità cromatina bassi. Utilizzare cromatina corrispondente a 10.000 cellule e 100.000 cellule, 0,5 mg di anti-H3K27me3, 0,25 mg -H3K4me3, 0.1 mg -H3K27ac, 0,25 mg -H3K9me3 grado anticorpi policlonali di coniglio ChIP-Seq Premium coniglio. Quantità ottimali di anticorpo variano a seconda modifica istoni e l&#39;affinità e specificità dell&#39;anticorpo corrispondente. <ol><li> Usare la stessa quantità di rab non immuneIgG bit come un anticorpo controllo isotipico. In alternativa, utilizzare perle non rivestiti o specifici anticorpi bloccato come controlli chip. Aggiungere 10 ml di proteina A sfere magnetiche rivestite per ogni reazione. </li></ol></li><li> Selezionare il protocollo ChIP automatico seguendo le istruzioni del software implementate nel dispositivo di automazione. Impostare i parametri sperimentali chip per 4 ore per la fase di rivestimento di anticorpi e 15 ore per il passo immunoprecipitazione. La fase di reticolazione inverso avviene nello strumento automatizzato a 65 ° C per 4 ore. </li><li> Purificare DNA reticolato inversa utilizzando le colonne di spin seguendo le istruzioni del produttore ed eluire in volumi da 6 ml a 25 ml di acqua. </li><li> Quantificare il DNA utilizzando un kit test commerciale. Analizzare i risultati per qPCR utilizzando primer per le regioni di controllo positivi e negativi per valutare la qualità chip. </li><li> Utilizzare un kit di preparazione biblioteca con reagenti preparazione di libreria ottimizzata per preparare librerie a basso quan DNAquan-. Utilizzare 30 pg e 300 pg di DNA chip (corrispondenti rispettivamente a 10.000 e 100.000 cellule esperimenti) per la preparazione biblioteca. Preparare le librerie che utilizzano il protocollo automatizzata compatibile con i reagenti di preparazione biblioteca. La libreria prep velocità automatizzata è 1 a 48 librerie per ciclo. </li><li> Dopo la riparazione fine dei modelli a doppia elica del DNA, legare gli adattatori stem-loop scindibili contenenti i siti di primer di sequenziamento. Dopo l&#39;estensione DNA passo, amplificare il campione con il metodo di amplificazione alta fedeltà descritto nel protocollo kit di preparazione biblioteca. </li><li> Dopo l&#39;amplificazione biblioteca, quantificare e purificare le librerie seguendo le indicazioni del kit di preparazione biblioteca. Si noti che la selezione del formato dopo purificazione non è necessaria. </li><li> Sequenza le librerie e generare cluster in base alle istruzioni del produttore. Eseguire bioinformatica primaria analisi (filtraggio cluster, chiamata di base, etc.) seguendo lo standard gasdotto produttore, il filtro, e allineare la legge per l&#39;ultimo gruppo di genoma umano (la versione corrente è GRCh38) con la ELAND 7 mascherina. Utilizzare SICER 8 o MACS 9 per il picco di chiamata ed effettuare le analisi a valle dei picchi con Homer, BEDTools 10, o qualsiasi software preferito. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig1highres.jpg" /> Figura 1. Screenshots del software che mostra come impostare esperimenti ChIP automatizzata nel PI-Star Compact. Il software offre la flessibilità di selezionare la quantità di campioni per periodo e per modificare i parametri sperimentali chiave (Anticorpo Coating, IP e lavaggi ) secondo le esigenze ricercatore. La procedura automatizzata consente testare diverse condizioni in parallelo (vale a dire, diversi tipi e le quantità di anticorpi, diversi tipi e le quantità di cellule e persino diversi tipi e quantità di sfere magnetiche nello stesso periodo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig2highres.jpg" /> Figura 2. Schermate del software che mostra come impostare la preparazione automatizzata libreria per sequenziamento di nuova generazione utilizzando il kit biblioteca nel sistema di automazione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<ol>
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The authors of this article, at the time of its writing, are employed by Diagenode S.A. and Diagenode, Inc., the manufacturer of the automated system described.

Immunoprecipitazione della cromatina seguita dal sequenziamento è ormai una procedura standard. Qui un protocollo ChIP-seq automatizzata in grado di generare profili epigenetici cromatina con solo 10.000 cellule del materiale di partenza è presentato. Automatizzare Chip e preparazione biblioteca test consente la standardizzazione della procedura di ottimizzazione di chip e ridurre la variabilità sperimentale. Il sistema di gestione dei liquidi presentato qui elimina molte delle procedure manuali associati ChIP riducendo le mani in tempo per appena 30 minuti, riduce al minimo la perdita di campione, e consente accurate ChIP-seq con pochi picogrammi di ingresso biblioteca. Al fine di raggiungere gli esperimenti riusciti ChIP-seq automatizzati, è anche fondamentale utilizzare di alta qualità preparati cromatina tranciati e anticorpi grado ChIP-seq in ogni esperimento Il sistema utilizza la tecnologia basata bead-magnetico e offre flessibilità per modificare i principali parametri sperimentali come incubazione tempo per il cappotto anticorpiing e passaggi di immunoprecipitazione o modifica delle condizioni di lavaggio che consentono al ricercatore di condurre tutti gli esperimenti necessari per l&#39;ottimizzazione ChIP-seq. Il sistema automatizzato è una piattaforma &quot;aperta&quot; che permette anche il confronto di più reagenti in parallelo per l&#39;ottimizzazione delle condizioni sperimentali per ciascuna linea cellulare individuale e anticorpi e consente un confronto diretto dei vari tipi e concentrazioni di cromatina, anticorpi diversi e anche diversi tipi di magnetica perline. Uno dei limiti del sistema automatizzato è la necessità di automatizzare tutti i protocolli in volumi che vanno da 5 microlitri di 200 microlitri. Tuttavia, la miniaturizzazione degli esperimenti in questa piattaforma automatizzata consente inoltre di risparmiare sui costi di reagenti. Oltre ai protocolli descritti in questo studio, il sistema è adattabile e anche automatizza una varietà di altre applicazioni basate branello magnetico come un immunoprecipitazionend cattura di DNA metilato (tecnologie MeDIP e MethylCap), immunoprecipitazione di DNA hydroxylmethylated (hMEDIP), immunoprecipitazione della cromatina sequenziale (ReChIP), RNA immunoprecipitazione (RNA-IP), la conversione bisolfito, e saggi di purificazione del DNA.

Come Next-Generation Sequencing (NGS) le tecnologie si sono diffuse e più accessibile, il metodo principale per la mappatura a livello di genoma di interazioni proteina-DNA è ora cromatina seguito da NGS rilevamento (ChIP-seq), che permette la scoperta del fattore di trascrizione siti o modelli di modificazioni degli istoni vincolanti. ChIP-seq è vantaggiosa nel fornire dati ad alta throughput dell&#39;intero genoma che può essere utilizzato per l&#39;analisi quantitativa e qualitativa delle interazioni proteina-DNA mediante la misura dei frammenti di DNA arricchito. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi in esperimenti ChIP-seq standard come la difficoltà di ottenere abbastanza materiale per creare una libreria sequenziamento. Esperimenti ChIP sono divisi in sei fasi fondamentali, tra cui le regioni di legame 1) reticolazione proteina-DNA 2) la preparazione del campione, che include la lisi cellulare e taglio della cromatina mediante ultrasuoni, 3) la formazione degli immunocomplessi,4) precipitazione dei immunocomplessi, 5) lavaggio delle immunocomplessi, e 6) eluizione del materiale arricchito e analisi qPCR e NGS. Il successo di un saggio ChIP dipende da tre fattori principali: una buona preparazione cromatina, la quantità di antigene nel campione originale, e la specificità e affinità dell&#39;anticorpo per il suo antigene affine. Una limitazione importante è il requisito di elevate quantità di partire numero di cellule per ottenere abbastanza DNA arricchito per creare una libreria sequenziamento. Per gli scienziati che lavorano con quantità di campione limitati, quali biopsie o di cellule sotto-popolazioni, esperimenti di ChIP-seq sono molto impegnativo. Recenti studi hanno dimostrato che saggi ChIP-seq possono essere eseguite quando si lavora con una bassa quantità di celle 1, 2. Diagenode ha sviluppato un sistema di manipolazione robotizzato liquido che può automatizzare completamente esperimenti ChIP-seq quando iniziano con un numero limitato di cellule. Automation forniscemolti vantaggi rispetto preparazione manuale dei campioni di chip-ss quanto diminuisce errore umano, riduce la variabilità, e riduce il costo sperimentale. Sono stati riportati i protocolli semi-automatico per cromatina e la preparazione biblioteca, ma nessuno di questi studi ha mostrato dati quando si utilizza il numero di cellule bassi 3, 4, 5, 6. In questo documento un flusso di lavoro completo automatizzato è descritto sia per immunoprecipitazione e preparazione biblioteca saggi cromatina in un sistema di trattamento del liquido robot che utilizza la tecnologia basata bead-magnetico e che può risolvere diversi parametri di ottimizzazione del protocollo. Qui, esperimenti ChIP-seq automatizzati sono stati eseguiti con successo su un numero limitato di cellule con l&#39;obiettivo di semplificare, standardizzare, e fornendo una soluzione affidabile per studiare profili epigenetici in popolazioni piccole cellule. Il protocollo ChIP automatizzato descritto in questo documento è stato ottimizzato su cellule HeLa utilizzando specifici anticorpi istoni e reagenti but il flusso di lavoro può essere adattato ad altre linee cellulari e anticorpi con corrispondenti ottimizzazione sperimentale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="917">
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:333px;">Product Description</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:107px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:367px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Formaldehyde 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">1,25M Glycine Solution</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Shearing Buffer iS1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protease Inhibitors Mix (200x)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14175-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer tL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP Buffer tC1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ideal ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagneode</td>
			<td>C01010051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP-Buffer H</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td>Component of the Auto Histone ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto Histone ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto True Micro ChIP kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K79me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15310068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K27me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me2 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K36me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Rabbit IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protein-A coated paramagnetic beads</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto IPure</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroChIP DiaPure columns</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Universal SyberGreenMaster Mix 1.25ml</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>DMMLD2D100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quant-IT dsDNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroPlex Library Preparation Kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C05010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Library prep Quantification kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">IP-Star Compact&#160; Automated System</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B03000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Pico</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Qubit system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Hiseq systems</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating chip-seq experiments to generate epigenetic profiles on 10,000 hela cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

Ottimizzazione esperimenti ChIP-seq automatizzati per otto diversi marcatori degli istoni Al fine di sviluppare con successo e validare i protocolli ChIP automatizzati, anticorpi grado ChIP-Seq precedentemente convalidati in esperimenti di ChIP-Seq manuali (dati non riportati) sono stati selezionati. I seguenti anticorpi grado ChIP-seq sono stati scelti per questo studio: anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 e -H3K9me3. La specificità di tutti gli anticorpi grado ChIP-seq è stato già confermato dalla macchia puntino, array di peptidi e gli esperimenti Western Blot (dati non riportati). Esperimenti pilota ChIP-qPCR con quantità crescenti di anticorpi sono stati eseguiti per determinare la sensibilità degli anticorpi (Figura 3). qPCR con almeno due positive e due obiettivi di controllo negativi sono stati analizzati e profili con arricchimenti di positivo oltre bersaglio negative superiori a cinque volte sono qualificati per il sequenziamento exper<html> iments. E &#39;importante eseguire esperimenti Chip e ChIP-Seq con un&#39;alta qualità della cromatina tranciati. Tutti gli esperimenti ChIP riportati in questa pubblicazione sono stati eseguiti utilizzando cromatina fresco. È anche possibile congelare le cellule fissate a -80 ° C e procede all&#39;elaborazione cromatina e tranciatura in un giorno diverso. Tuttavia, cromatina preparato da cellule fissate congelate possono comportarsi in modo diverso da cromatina preparati al momento e quindi le condizioni di sonicazione può avere bisogno di essere ottimizzato per ogni preparazione cromatina. Quando si lavora con diversi tipi cellulari, possono essere utilizzati i buffer di tranciatura con differenti composizioni detergenti (SDS). Tipi cellulari, quali linee cellulari primarie o cellule coltivate in sospensione sono cellule difficili da taglio e richiederanno di alte concentrazioni di SDS (1%), mentre le linee cellulari che sono facili da taglio come HeLa richiederà basse concentrazioni SDS (0,1%) nel buffer di taglio. res.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Validazione di anticorpi ChIP qualità utilizzando il sistema di automazione. ChIP è stata eseguita con l&#39;anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, -H3K36me3 e -H3K9me3 anticorpi policlonali di coniglio su cromatina tosata da 1 milione di cellule HeLa-S3 seconda delle modificazioni degli istoni. Protocolli ChIP automatizzati con volumi di lavoro 200 microlitri sono stati utilizzati nello strumento di automazione per gli esperimenti di titolazione degli anticorpi. Anticorpo quantità di 1, 2, 5 e 10 mg sono state testate per esperimento ChIP e 2 mg di IgG sono stati usati come controllo negativo in ogni esperimento. Arricchimenti sono stati valutati mediante qPCR. I risultati sono mostrati in% di ingresso (la quantità relativa di DNA immunoprecipitato rispetto all&#39;ingresso del DNA dopo l&#39;analisi qPCR). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Dopo la convalida e la determinazione optima<html> l quantità di anticorpi ChIP qualità da utilizzare nel sistema di automazione, esperimenti ChIP-seq automatizzati sono stati eseguiti per generare profili di sequenziamento per ciascuna modifica istoni (Figura 4). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig4highres.jpg" /> Figura 4. istone profili ChIP-seq generati da esperimenti di ChIP-seq automatizzati. La figura mostra i profili ChIP-seq in diverse regioni genomiche per H3K4me3, H3K9ac e H3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3 e H3K36me3. 4A mostra la distribuzione picco lungo l&#39;intero X -chromosome e 4B la distribuzione in una regione di 75 kb circostante il gene GAPDH. 4C mostra i profili di H3K27me3, H3K36me3 e H3K4me3 in una regione 500 kb circostante il gene MYT1 e 4D mostra la distribuzione di H3K9me3 in un ZNF12 circostante 200 kb regione.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Istoni profili epigenetici per sei diverse modificazioni degli istoni associati con l&#39;espressione genica sono stati generati (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 e H3K36me3). La figura 4A mostra profili ChIP-seq lungo il cromosoma X per i diversi marcatori degli istoni. La correlazione altamente picco osservato tra i 6 differenti profili istoni indica le capacità del sistema automatizzato per generare dati precisi e affidabili. Figura 4B, 4C e 4D mostrano la distribuzione dei picchi di diverse modificazioni degli istoni in specifiche regioni genomiche. Automatizzati esperimenti cromatina immunoprecipitazione giù a 200 cellule La quantità minima di cellule che possono essere utilizzati in esperimenti di ChIP dipende dalla qualità della cromatina, la specificity e la sensibilità degli anticorpi e l&#39;abbondanza della modifica degli istoni o proteine ​​studiate. Selezione buone anticorpi grado ChIP-seq è importante quando si lavora con quantità limitate di campione e la selezione dei reagenti ottimali e diversi vettori migliora l&#39;efficienza del recupero di DNA e contribuire al successo dell&#39;esperimento chip. Per determinare l&#39;importo minimo di cellule che il protocollo ChIP automatizzato in grado di elaborare, diverse quantità di cromatina, anticorpi, e sfere magnetiche sono stati testati nel sistema automatizzato IP-Star utilizzando reagenti ChIP specificamente ottimizzati per funzionare con basse quantità di cromatina. Innanzitutto, cromatina da 10.000 cellule è stato sonicato come descritto nel protocollo. I risultati sono stati confermati da ChIP qPCR (Figura 5A) che mostra arricchimenti significativi con H3K4me3 anticorpi nelle regioni di controllo positivo e il segnale trascurabile nelle regioni di controllo negativo. Per il confronto e la prova di coerenza, additionadati ottenuti con l H3K27ac, H3K9me3, e anticorpi H3K27me3, con 10.000 cellule è fornito. Esperimenti ChIP automatizzati sono stati eseguiti poi per dimostrare le capacità del sistema automatizzato per lavorare con basse quantità di celle utilizzando lo stesso anticorpo H3K4me3. Il chip automatizzato eseguito bene, dimostrata da una serie di dieci reazioni IP che erano riproducibili e altamente paragonabili ai risultati ChIP manuali (Figura 5B). Esperimenti manuali e automatizzati sono stati eseguiti e benefici dei protocolli automatici sono stati visti nel ridurre esperimento per sperimentare la variabilità (Figura 5C). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig5highres.jpg" /> Figura 5. Ottimizzazione del chip e Auto ChIP esperimenti su 10.000 cellule sono stati eseguiti esperimenti di ChIP manuali su 10.000 cellule e con 0,25 mg di H3K4me3, 0,1 mg di H3K27ac, 0,5 mg di H3K9me3 e 0,25 mg di anticorpi H3K27me3. Quantitativi identici di IgG di coniglio sono stati usati come controllo. La qPCR è stata eseguita con primer per due loci positive e due loci negativo per ogni saggio ChIP. La Figura 5A mostra il recupero, espressa come percentuale di input (la quantità relativa di DNA immunoprecipitato rispetto all&#39;ingresso del DNA dopo analisi qPCR). Figura 5b mostra 10 reazioni ChIP eseguiti sul IP-Star Compact con 0,25 mg H3K4me3 policlonale e 0,25 mg di IgG di coniglio anticorpo di controllo come negativo. Poi è stata effettuata l&#39;analisi qPCR con primer per il positivo promoter loci EIF4A2 e GAPDH TSS e il negativo exon2 loci mioglobina e Sat2. La figura mostra il recupero, espressa come percentuale di ingresso (quantità relativa di DNA immunoprecipitato rispetto all&#39;ingresso del DNA dopo analisi qPCR). La Figura 5C illustra dati H3K4me3 piastrina di 10 esperimenti ChIP manuali in confronto al 10 esperimenti ChIP automatizzati. Barre di errore rappresentano s<html> deviazioni tandard di ciascuna delle dieci repliche. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per comprendere la sensibilità dei protocolli ChIP automatizzati, gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando una quantità di cellule che variava da 100.000 fino a 200 cellule per IP. L&#39;anticorpo anti-H3K27me3 stato usato in quanto è una modifica molto comune istoni. L&#39;uso di altri anticorpi istone o non-istoni può richiedere cellule più o meno, a seconda l&#39;abbondanza dell&#39;epitopo e la qualità dell&#39;anticorpo. Gli esperimenti sono stati convalidati mediante PCR quantitativa e si è osservato che, riducendo quantità di perline e sfondo anticorpi negli esperimenti è ridotto permettendo successo risultati ChIP-qPCR con soli 200 cellule anticorpo (Figura 6). iles / ftp_upload / 52150 / 52150fig6highres.jpg &quot;/&gt; Figura 6. automatizzato test chip su 200 cellule. Cellule Hela-S3 e anticorpi diretti contro H3K27me3. La cromatina è stata tosata da 1 milione di cellule e diluizioni seriali di questo cromatina (da 100.000 a 200 equivalenti cellule) sono stati utilizzati per reazione chip. 1 mg di H3K27me3 e 10 ml di proteine ​​sfere magnetiche A rivestite sono stati utilizzati in esperimenti 100.000 cellule, 0,5 mg di H3K27me3 e 10 ml di perline su 10.000 e 1.000 celle, e 0,25 mg di H3K27me3 e 5 ml di perline con 500 e 200 cellule. 1 mg e 0,5 mg di IgG di coniglio sono stati utilizzati come anticorpo di controllo negativo durante l&#39;esecuzione di esperimenti con 100.000 celle e 1.000 cellule rispettivamente. 6A mostra l&#39;occupazione di TSH2B e GAPDH geni in% su ingresso. 6B mostra occupazione relativa del TSH2B rispetto ai controlli GAPDH negativo regione genomica. Analisi valle dei risultati ChIP-seq su10.000 cellule Al fine di valutare la qualità globale degli esperimenti ChIP-seq automatizzato con i numeri di partenza bassi di cellule, automatizzati sono stati eseguiti saggi ChIP-seq con 0,25 mg dell&#39;anticorpo H3K4me3 su 10.000 cellule HeLa ed esperimenti Chip On sono stati utilizzati 100.000 cellule HeLa-S3 come controllo positivo per l&#39;esperimento. Le librerie automatizzate sono state utilizzate le biblioteche Microplex kit di preparazione reagenti adeguati alle biblioteche preparati con basse quantità di DNA. Si noti che, anche se è possibile eseguire con successo chip esperimenti automatizzati con meno di 10.000 cellule, gli importi dei tirato giù DNA non saranno sufficienti per preparare librerie utilizzando i reagenti del kit. Generazione Cluster e sequenziamento sono stati eseguiti secondo le istruzioni del produttore. La bioinformatica analizza dopo i sequenziamento mostrano ottimi risultati a partire dal numero di cellule campioni a bassa chip. Il set di dati 30 pg (corrispondenti a 10.000 cellule del materiale di partenza<html> ) Contengono basso rumore di fondo e picchi di arricchimento altamente affidabili confermati sia dal 300 pg dataset (corrispondenti a 100.000 cellule del materiale di partenza) e il set di dati H3K4me3 generato dal Broad Institute del progetto ENCODE che è stato utilizzato come riferimento esterno. È importante notare i dati Top rapporto di sovrapposizione 40, che si riferisce ad un metodo standard utilizzato nel progetto ENCODE 11, in cui il chip-seq è considerata riproducibile se si confrontano i due insiemi di dati esiste almeno una sovrapposizione 80% dei migliori 40% dei picchi ordinati per punteggio significato. Il set di dati di 30 pg soddisfa questi criteri rispetto sia al 300 pg dataset (considerando tutte le sue vette, non solo il migliore del 40%) ei dati Broad Institute (Tabella 1). Il set di dati di 300 pg mostra picchi quasi identici ai dati Broad Institute con Top rapporto di sovrapposizione 40 98% (Figura 7). ighres.jpg &quot;/&gt; Figura 7. saggi Chip e generazione biblioteca 10.000 cellule esperimenti ChIP-seq sono stati generati su 10.000 e 100.000 cellule HeLa-S3 utilizzando H3K4me3 anticorpi (0,25 mg / mL). Le 35 etichette bp sono stati mappati al genoma umano con la mascherina ELAND. Durante la successiva picco chiamando SICER potrebbe attendibilmente identificare i arricchimenti dal numero di cellule bassi così come da milioni di cellule. I set di dati sono stati analizzati e confrontati tra loro e ai dati di riferimento generati dal Broad Institute. I campioni di cellule bassi sono coerenti e abbia una grande somiglianza. Il campione 30 pg soddisfa il criterio ENCODE 11 (min. 80% della top 40% dei picchi deve sovrapporsi). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52150/52150fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/52150/52150table1.jpg" /> Tabella 1. </strong&gt;

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Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

Automatizzare esperimenti ChIP-seq per generare profili epigenetici su 10.000 cellule HeLa

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

automating-chip-seq-experiments-to-generate-epigenetic-profiles-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Views.  Diagenode S.A.. Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

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Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Ricerca

Biologia

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

Esecuzione personalizzati Esperimenti di Microarray MicroRNA

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell&#39;epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making malaria control an omnipresent problem in tropical countries. The emergence of insecticide resistant populations warrants the exploration of novel drug target pathways and compounds for vector mosquito control. Epigenetic drugs are well established in cancer research, however not much is known about their effects on insects. This study provides a simple protocol for examining the toxicological effects of 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an experimental epigenetic drug for cancer therapy, on the malaria vector, Anopheles gambiae. A concentration-dependent increase in mortality and decrease in size was observed in immature mosquitoes exposed to DZNep, whereas the compound reduced the fecundity of adult mosquitoes relative to control treatments. In addition, there was a drug-dependent decrease in S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase activity in mosquitoes following exposure to DZNep relative to control treatments. These protocols provide the researcher with a simple, step-by-step procedure to assess multiple toxicological endpoints for an experimental drug and, in turn, demonstrate a unique multi-prong approach for exploring the toxicological effects of water-soluble epigenetic drugs or compounds of interest against vector mosquitoes and other insects.

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, Fecondità e Sopravvivenza di malaria zanzare

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Sistemi HeLa cellule base libera espressione a manifestare<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Misura e Analisi di extracellulare Acido prodotte per determinare glicolitica Tasso

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...