plusTipTracker MT analiz yazılımı geliştirmek için rehberlik ve bu çalışmalarda kullanılan floresan cDNA yapıları birçok sağlamak için tartışmalar, Michelle Baird ve Mike Davidson Dr. Clare M. Waterman ve Kathryn Applegate ve Gaudenz Danuser özel teşekkürler. Bu eser dan KAM bir hibe ile kısmen desteklenmiştir Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

The authors declare that they have no competing financial interests.

Morfoloji ve Göç Denemelerde HUVECler kullanma. HUVEC içinde EB3 etiketli MT büyüme dinamiklerinin Canlı hücre görüntüleme daha sonra bir ECM sinyal işaret atanabilir şekilde MT büyüme ve HUVEC morfolojisi değişiklikleri ölçmek ve değerlendirmek amacıyla uygun ve tekrarlanabilir hücre kültürü koşulları gerektirir. HUVECler hücre şekli ve hareketliliği incelemek için mükemmel bir model oluşturmaktadır. Onlar hem çözülebilir hem de fiziksel bir sinyal uyaranlara yanıt olarak dramatik morfolojileri sergileyen, floresan etiketli cDNA transfeksiyon son derece uygundurlar ve, uygun hücre kültürü koşullarının 65-70 Resim vasküler tüplere kendilerini düzenleme yeteneğini korur. Böyle HUVEC olarak primer hücre kültürleri, hücreler sağlıklı olmasını sağlamak amacıyla ve deney sırasında normal davranacaktır dikkatli kullanım ve hücre geçiş sayısının izlenmesini gerektirmektedir. Örneğin, cytoskele araştıran deneylerHUVECler, tipik olarak on beş geçiş on yaklaşık eşit olmayan morfolojilerini görüntülemek için başlarken ton ve / veya hücre morfolojisi, HUVECler, onuncu hücre kültür geçişi ötesinde deneyler için kullanılmamalıdır. Hücre yoğunluğu HUVEC sağlık ve çoğalmasının kritik bir düzenleyicisidir. HUVEC dallanma araştırmalar (yukarıdaki protokole 10,1-10,4 bakınız) hücreler ECM ile etkileşim fiziksel alan sağlamak ve dallı uzantıların uzatmak için, nispeten düşük hücre yoğunluğu kültürleri kullanmak. Buna karşılık, yara-kenar göç çalışmalarında, HUVECler önce yaralama bir tek tabaka kültürü (Protokol 10,5-10,8 bakınız). Bu tür, yara-kenar HUVECler nispeten un-dallı morfolojisi görüntüler gibi, kenar çıkıntıları önde gelen genişletmek ve onlar yara içine göç olarak yakın komşuları ile hücre-hücre etkileşimleri sergiler. Uyarılar ve Yaşam HUVEC içinde Takibi MT Dynamics Avantajları. Disk mikroskobu Spinning için mükemmel bir yaklaşımdıryüksek zaman çözünürlüklü konfokal görüntü netliği gerektiren deneysel hipotezleri test. Uygun kamera ve lazer modülü ile, bu mikroskopi yaklaşım düşük emisyonlu floresan duyarlı ve floresan mikroskobu diğer türlerine oranla azalmış photobleaching yardımcı olabilir. Farklı hücre tipleri çok çeşitli, EB3 etiketleme yaklaşımı kullanılarak MT büyüme dinamiği kapsamlı ölçümler oluşturmak için gerekli olduğu gibi da önemlisi, bu yaklaşım aynı zamanda da yüksek zaman çözünürlüklü görüntüleme orta için uygundur. etiketleme EB3 metodolojisi MT artı uçları büyürken floresan etiketleme MTS diğer yöntemlere göre belirgin avantajları vardır, o da benzersiz dezavantajları vardır. Örneğin, aktif sökülmesi MTS nüfus ve stabil olmayan, dinamik MTS 71-74 nüfusu hem de dahil olmak üzere herhangi bir zamanda büyümemesi MT dizisinin bir bölümü vardır. EB3 MTS bu iki popülasyonlarının etiket olmaz veBu nedenle bu iki nüfus katkısı deneysel veri analizi dahil olmaz. Tüm MT diziyi değerlendirmek için alternatif yöntemler floresan etiketli MTS tüm toplumlarda içine birleştirir ve büyüyen küçülen tanımlanması için izin veren tubulin, ve durağan MTS ifadesi üzerine odaklanmıştır. Bununla birlikte, tüm MT dizi etiketleme mikrotübül organizasyon merkezi, (MTOC) hücrenin merkezi ve bitişik Mt tadını nispeten yüksek yoğunluğu hücre civarındaki MT uçlarının görüntü analizi bir dezavantaj yaratmaktadır periferi 75-77. Canlı hücrelerde floresan tubulin ve floresan EB3 ile MTS iki renkli ko-etiketleme kullanarak deneyler tübülin etiketli MTS büyük çoğunluğu da EB3 etiketli 78 olduğunu, niteliksel, ortaya koymuştur. Buna ek olarak, floresan tubulin ile etiketlenmiş MTS otomatik izleme etkili bir yöntem olmamıştır. Bu, araştırmada veri toplama demektiryon ve floresan tubulin ifade eden hücrelerde MT dinamiklerinin ölçümleri, hata eğilimli ve sıkıcı bir süreç bireysel MTS el izleme gerektirir. Bunun bir sonucu olarak, EB3 etiketli MTS otomatik hesaplama analizi, çok sayıda hücre türleri arasında ve deneysel rejimleri 35,79 çeşitli olan MT dinamikleri deney tatbik edilebilir MT dinamiklerini ölçmek için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. HUVEC Morfolojisi ve Göç MT Büyüme Dinamikleri Bağlama. Bir iskelet araştırmacı açısından bakıldığında, plusTipTracker otomatik izleme analiz biri son derece yararlı adaptasyon ölçmek ve MT büyüme dinamikleri hem tam hücre ve bölgesel değişiklikleri değerlendirmek için yeteneğidir. Bir hücre polarize olmak şartı yönlü hücre göçü için önemli bir ön koşuldur. Böyle, polarize sinyal ipuçları uzun yönlü hücre migrasyonu 30,31,51,54,56,80,81 için önemli itici faktörleri olarak bilinmektedir olarak </&gt; Sup. Örneğin, VEGF gibi çözünebilir sinyal molekülleri endotel hücre tipleri 2,82-87 VEGF cue doğru aktin polimerizasyonu MT büyümesini teşvik. Buna ek olarak, (örneğin, uyum ve boyut mechanosensing için) ECM ile fiziksel etkileşim yanıt olarak, HUVECler yerel MAP dallı uzantıların uzatılması olan MT büyümesini teşvik etmek için regüle ederek MT dinamiklerini modüle eden ve bu yönünde, HUVEC göçünün kılavuzlanmasına yarar işaret 5,31,88. Böylece, hücre dışı bir sinyal uyaranlara yanıt olarak polarizasyon iskelet dinamikleri lokalize değişikliklerin deneysel değerlendirilmesi gerekliliğini vurgulamaktadır. (EB3 yaklaşımını kullanarak) MT büyüme dinamikleri ve HUVEC hücre göçü eşzamanlı canlı hücre görüntüleme MTS saniyelik bir zaman ölçeğinde büyümeye çünkü hücre morfolojisi ve yön göç değişiklikler saatlik bir zaman ölçeğinde meydana ederken, gerçekleştirmek son derece zordur. Oysa her iki süreç yakından linke vardırd. Ayrıca, ikinci kez ölçekte floresan etiketli EB3 sürekli, hızlı görüntüleme EB3 sinyalinin photobleaching yol açar. EB3 (1-2 dk edinme serisi) her 30 dakikada başarılı olmuş kısa görüntüleme serisi yaparak bu sorunu aşmak için çalışır, ancak sadece EB3 optimal ifade vardı EC küçük bir sayıda başarılı olabilir ve bu olumsuz görüntüler vermedi tekrarlanan lazer aydınlatma 5 etkileri. MT büyüme dinamikleri hücre morfolojisi ve göç değişikliklere nasıl katkıda yorumlarıyla sağlayan alternatif bir yaklaşım Faiz (ROI) aracı 35 (Protokol 6.6 bakınız) plusTipTracker Bölgesidir. tüm hücre MT büyümesi alt bölünmüş MT büyüme parça daha sonra ayıklanır ve analiz edilebileceği kullanıcı tanımlı bölgeler, içine olmak izler Bu metodoloji sağlar. Örneğin, hücrenin &quot;dallı olmayan&quot; bölgelerde karşı &quot;dallı&quot; karşılaştırmaları MTs daha s büyümek olduğunu ortaya koymuşturaşağı ve daha fazla sürekli kollara ayrılmış bölgelerde dallanmamış hücre kenarına 5 ile karşılaştırıldığında. polarize yara kenarı HUVEC olarak, kenarı ve arka kenarı MT büyüme dinamiği karşılaştırmalar MCAK kaynaklı MT sökme arka kenarı kenarı olan spesifik inhibe değil, ortaya koymuştur. lider ve Rac1 ve / veya MCAK fosforilasyonu mutantlar ifade HUVEC kenar MT büyüme dinamiklerini firar Bölgesel değerlendirme ayrıca Aurora-A kinaz Rac1 kaynaklı aktivasyon özellikle ve yerel HUVEC kutuplaşma ve yön göç sürücü ön kenarında içinde MCAK aktivitesini inhibe ortaya 31. Böylece, MT büyüme dinamikleri ve dallı çıkıntılar ve / veya yara kenar HUVEC ön kenarına içinde MT büyüme dinamikleri bölgesel değerlendirilmesi otomatik izleme kombinasyonu bize HUVEC morfolojisi ve göç MT büyüme dinamiklerini bağlamak için izin verdi. açıklanan protokoller designe vardırd HUVEC kültür ve deneysel araştırma için genellikle basit ve son derece tekrarlanabilir bir metodoloji sağlamaktır. Bununla birlikte, iletişim kuralı detayların bir çok da, deney yöntemi yapma hataları ya da zorluklar olanağı sağlayan, karmaşık ve zaman alıcı bir iştir. protokol boyunca potansiyel sorunları çözmek için teşebbüs ederken, burada daha az yaygın ya da başka yöntem protokolleri içinde notlar olarak kısaltılır potansiyel problemlerin ek, ayrıntılı sorun giderme sağlanır. poliakrilamid yüzeylerde ile kaplama lamelleri (Protokol 2.2), cam lamelleri aktive cam poliakrilamid bağlanması, poliakrilamid aktive ve daha sonra poliakrilamid için ECM bağlanması karmaşık doğası doğar ortak sorunu ile ilgili. Bir özellikle zor ve potansiyel olarak sorunlu bir adım Polya maruz kalmasını takiben fibronektin / poliakrilamid jel üzerine HUVECler kültürleme olduğunu2 mM sülfo-SANPAH için crylamide kaplı lamelleri (yukarıda adım 2.2.2.6). Bu yüzeylerde HUVECler kültürleme başarısı için kritik öneme sahiptir sülfo-SANPAH tamamen ECM birleştikten sonra deneysel sistemden çıkarılmalıdır. Bu en iyi GKD 2 O ile yıkama ve gece boyunca bir karıştırıcıda GKD 2 O lamelleri inkübe edilmesi ile gerçekleştirilebilir. poliakrilamid ECMs kültüre hücreleri hayatta değilse canlılığı, beklenen artış ve fibronektin (adım 2.2.2.9) konjugasyon sonra sülfo-SANPAH yıkanması tekrarlanan küçükse potansiyel bu sorunu hafifletmek veya tavsiye edilir. Protokolün 3 (a lamel cDNA transfeksiyonu ve HUVEC kültür) İlgili, elektroporasyon prosedürün başarısı için büyük bir etkisi hücrelerinin trypsinization sırasında hem HUVEC&#39;lerin ele tamamlanmasının ardından plastik şişeden bunları kaldırmak ve etmektir elektroporasyon (yukarıda, 3.3-3.4 adım). Bakım için kritik öneme sahiptirtripsin ve şişeye (genellikle 1-2 dakika) yüzeyi üzerinde &quot;yuvarlak-up&quot; hücreleri için gereken zamanı aşmayacak şekilde ise, tam HUVECler izler. Tripsin Aşırı zaman hücreleri fibronektin kaplı lamelleri (3.4 adım) üzerine kaplama ve daha sonra yüzeye tutunur başarısız kadar genellikle fark edilmez HUVEC ölüm, önemli bir nedenidir. elektroporasyon tamponunda uzun süre askıya zaman benzer öneme sahip, HUVECler (ve çoğu primer hücre tipleri) iyi ücret yoktur. daha büyük ölçekli deneyler esnasında, kullanıcı elektroporasyon gerektiren beş veya daha fazla koşulu vardır, örneğin, tek-a-zaman, tek tek tüpler içinde pelet hücreleri (transfeksiyon başına 1 tüp) tutmak ve bunları karıştırmak için daha da elektroporasyon hemen önce elektroporasyon tamponu içinde. Bu yaklaşım elektroporasyon tampon ve en üst düzeyde HUVEC hayatta kalma kuluçka süresini en aza indirir. Ayrıca, tam bir kültür ortamında acil kurtarma de cr olduğunuitical Elektroporasyondan. Bir dakika ya da daha fazla, aşağıdaki elektroporasyon kurtarma gecikme tam HUVEC ölüme yakın neden olabilir ve bu nedenle kaçınılmalıdır. İlgili hücre göçü deneyi (Protokol 9), son derece yüksek bir yoğunlukta HUVECler kültür tekniği fibronektin kaplı lamel kurutma gerektirir (protokol 3&#39;te tarif edilmiştir), geleneksel HUVEC hücre kültürü metodolojisi (aşama 9.2&#39;de anlatıldığı gibi) kritik bir değişiklik bağlıdır lamel çok küçük bir alana HUVEC kültürü sağlamak için. lamel tamamen kurutulur edilmemiştir ya da fibronektin ile lamel ön kaplama (adım 2.1 veya 2.2) halinde etkin değildi Çoğu zaman, örtücü kısım üzerine yerleştirilmiştir ortam ihtiva eden hücreler, yüzey gerilimini kaybeder ve genişleyecektir böylece lamel hücrelerin yoğunluğunu azaltarak, lamel kenarları. bu potansiyel sorunu gidermek için bir yöntem lamel ve ardından ortamı aspire etmektir5-10 dakika biyogüvenlik kabini arkasına (hala 35mm çanak) lamel yerleştirin. Bu uyarlama çanak kurutmaya yardımcı olmak için kabin içinde hava akışına izin vermek için yardımcı olabilir. gözle görülür sıvı hava kuruduktan sonra lamel kalırsa, sıvı noktalar aspire ve tekrar biyogüvenlik kabini 5-10 ek dakika kurumaya bırakın. Tamamen bu olası sorunu önlemek için bir yol olduğuna dikkat etmek önemlidir, ancak bu protokolün tekrarlanan uygulama ile bir sorun daha az hale gelir. Aynı zamanda hücre göçü deneyi (ya da genel olarak herhangi bir tahlil,) için lamelleri hazırlarken, ekstra lamelleri hazırlamak ve ekstra HUVECler hazır-to-go yol boyunca sorunları durumunda sahip olduğu bir sorun giderme öneridir. Akılda bu sorun giderme hususlar ile, tartışılan protokoller ve gelecekteki hücre biyolojisi araştırmalarında onların etkileri faydasını vurgulamak için de önemlidir. polyacr uygulanabilirliğiilamid yaklaşım, geniş, ve (yukarıda tarif edilen) hücre-ECM angajman iki boyutlu çalışmalar, aynı zamanda, üç-boyutlu bir inceleme 5 de içerir. Bu uygulama HUVECler fizyolojik ortamlarda hücre şekli ve göçü düzenleyen nasıl anlayışımızı artırarak için kritik öneme sahiptir ve araştırmacılar, hücre iskeleti değişikliklerle koordine nasıl morfolojik değişiklikler temel bir anlayış sağlamalıdır. Burada anlatılan protokoller MT büyüme dinamikleri ölçümleri odaklanmış olsa da, protokollerin çoğunluğu ve hücre-ECM etkileşimleri diğer mikroskobik ölçülebilir yönleriyle herhangi bir sayı ölçmek için adapte edilmelidir olabilir. MT dinamikleri açısından, sunulan protokolleri kullanarak incelenebilir en az 14 kinesinlerin 89 ailelerine, HUVEC kutupluluk ve yönetmenliğini göç katkıda potansiyel rolü olan her ve tüm dahil, çok sayıda haritalar bulunmaktadır. Gelecekteki araştırmalar gereken birLSO hastalıklı devletlerin karşı normal hücre ECM angajman hedeflenmelidir. Burada sunulan HUVEC protokolleri normal vasküler homeostatik süreçlerin soruşturmalara uygulanabilir yanı sıra birkaç isim, kalp hastalığı, retinopati, tümör büyümesi ve metastazı da dahil olmak üzere hastalık durumlarıyla vardır. endotel hücre vasküler anjiyojenez, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe ile izlenebilir şekilde hücre ECM birleştirme çalışmaları için sağlayacak mikroskopik çalışmaları ile müsait uyumu gözle saydam ECM ve poliakrilamid substratlar konjüge. Deneysel yaklaşımlara Bu tür zaten önemli endotel hücre şekli, polarite, göç farklılıkları ve bu süreçleri 5,31,90 düzenleyen proteinlerin etkilerini ortaya çıkarmak için başladı. Gelecek çabalar ECM uyum ve çok boyutluluk mechanosensing kombinasyonu hedef ve iskelet dinamiklerini düzenleyen yerel kontrol proteinlerine hizmet edebilir nasıl tespit hedeflemelidir.

Anjiyogenezis, polarize yönlü özgüllük ile göç ve kan temini gerektiren dokularda yeni damar sistemini oluşturmak için endotel hücreleri (EC) teşvik hücre dışı bir sinyal ipuçları ile tetiklenir. anjiogenezisi sürücü düşünce katkıda bulunan faktörler ekstrasellüler matriks (ECM) gelen sinyaller bulunmaktadır. Fiziksel uyaranlara yanıt olarak, EC damar ağı 1,2 oluşumunda yönlü hareketini yönlendirmek için yönlendirme spesifikliği olan şube uzanır. AK morfolojisi ve dallanma mimari acto-miyozin kasılmasının 3 düzenlenmesi ile koordineli bir şekilde mikrotübül (MT) hücre iskeletinin lokalize yönetmelikle belirlenir. Oluşturmak için AT dalları için, miyozin II yerel bölgesel membran çıkıntılar 4 sonuçlanan aşağı regüle edilmesi gerekmektedir. Aynı zamanda ve hücre içinde aynı yerde, MT büyüme dinamikleri şube Elon teşvik etmek yavaş ve kalıcı MT büyüme ile sonuçlanan değiştirilmiş halinegasyon ve stabilite 5. Bu koordine iskelet düzenleme EC yönlü göç kolaylaştırmak için kendi morfolojisi polarize sağlar. Kutuplaşmış bir hücre morfolojisi gelişimi polarize MT takımını 6 gerektirir. Epitel hücreleri göç olarak, MTS hücrenin 7-9 öncü yavaş ve ısrarla özellikle büyümek; nöronlarda iken, akson veya dendrit başlaması ve uzama MTs sadece mevcut olmasını gerektirir, fakat onlar dinamik montaj ve demontaj 10-15 süreçlerini geçiyor. Bu şekilde, MT büyüme dinamiği lokalize kontrol hücre yapısını tespit eder ve EC bunların ECM gezinirken hücre morfolojisi hızla yeniden sağlar. MT büyüme dinamikleri moleküler motor protein ve non-motor proteinlerin aileleri tarafından düzenlenir, Mikrotubul İlişkili proteinler veya Mikrotubul Etkileşen Proteinler (bundan sonra refe olarak adlandırılan) MAP&#39;ler olarak rred. MAP yerel olarak, tipik olarak, hücre-ECM arayüzü 16,17 başlatılan sinyal basamaklarının ile, aktive edilmiş ya da inaktive edilebilir. MT bağlanarak ve MT montaj ve demontaj kinetik değiştirerek kez aktif MAP fonksiyonu; böylece lokal hücre şekli ve kutupları 18-20 teşvik etmek amacıyla MT dinamiklerini düzenleyen işleyen. Mitotik Sentromer İlişkili kinesin (MCAK) MT uçları ve çiftler MT sökme 21-23 ATP hidroliz bağlanan bir kinesin-13 aile MAP olduğunu. MCAK bu fonksiyonel rolü mitotik iğ 24-28 olan kritik olarak interfaz 29,30 ne olduğu bilinmektedir. interfaz EC içinde MCAK aracılı MT demontaj yara kenardan Rac1 küçük GTPaz indükte aktivasyonunu yanıt olarak MCAK lokalize Aurora-A indüklediği fosforilasyon ile düzenlenir. Bu sinyal akışının sonucu le doğru polarize MT büyümesi ile sonuçlanan, EC ön kenarında MCAK inhibisyonuECS 31 göç firar kenarında kenar ve MCAK kaynaklı MT sökme ading. MT büyüme dinamiği ölçmek için geleneksel yöntemler, tipik olarak floresan etiketli tübülin ya da daha yakın zamanda, floresan etiketli MT sonu bağlayıcı protein 1 ya da 3 (sırasıyla EB1 ve EB3) ya da el izleme kullandık. floresan tubulin yaklaşımı tüm MT dizi etiketleme avantajına sahiptir. Mitotik hücre türlerinin çoğunluğu interfaz 8,32,33 sırasında MTS radyal sırasını korumak için, ancak, sentrozom civarındaki MTS çok yoğundur ve sonuç olarak, flüoresan tubulin MT büyüme ve sökme izleme, genellikle çevre sınırlıdır hücrenin bölgeleri. Bu kısıtlamalar nedeniyle, floresan etiketli EB proteinlerin (EB1 veya EB3) kullanım MT dinamiklerini ölçmek için daha ortak bir yaklaşım olmuştur. EBS sadece MTS büyüyen artı uçları etiket çünkü onlar parlak floresan gelip, (1-3 mikron) küçük görünürts, son derece sınırlı eşiğe 34-37 MT polimerizasyon kolayca ayırt edilebilir işaretleyici sağlar. MT dizinin yalnızca bir alt kümesi EBS etiket EB yaklaşımının önemli bir gücü temsil olması, aynı zamanda önemli bir sınırlama vurgular iken, non-büyüyen MTS EB3 yaklaşımla etiketlenmiş değildir. Bununla birlikte, ölçmek ve zamanla EB3 kuyruklu izlemek ve alt-hücresel bölgelerindeki MT büyüme görselleştirmek için yeteneği MT örgütün bölgesel değerlendirme gerektiren uygulamalar için bu yaklaşım ideal kılar. Ölçüm MT büyüme dinamikleri açısından geleneksel yöntemlerin bir başka kritik sınırlama çok büyük veri setleri ve veri analizi için gereken zaman olmuştur. Bu sınırlama yüksek zaman çözünürlükte EB kuyruklu yüzlerce el izleme ihtiyacından kaynaklanıyor. Ayrıca, bu ölçümler hücrelerin istatistiksel olarak önemli sayıda yapılır ve aynı zamanda kontrol ve experime çeşitli altında gerçekleştirilmesi gerekenntal koşullar. Son zamanlarda, bu kısıtlamalar canlı hücreler 35 time-lapse mikroskopi kullanılarak özellikle izleme EB3 kuyrukluyıldızların yönelik hesaplama analiz teknikleriyle aşılmıştır. Uygun kullanıldığında, bu hesaplama yaklaşım hem MT polimerizasyonu ölçme yüksek verimli bir yöntem sağlamanın yanı sıra el-izleme ile ilişkili insan hatası potansiyelini sınırlamak için hizmet vermektedir. MatLab tabanlı yazılım paketi kullanarak MT dinamiklerinin hesaplama analizleri, plusTipTracker, floresan etiketli EB3 kuyruklu 5,31,35,38 izleme MT büyüme ölçümleri için izin verir. Ayrıca, plusTipTracker yazılım büyüyen MT parça içinde EB3 kuyruklu kayboluşu dayalı MT felaket olaylarının (aka demontaj) hesaplamalarına izin verir, ve ilgi kullanıcı tanımlı bölgeler içinde MT büyüme dinamikleri alt-hücresel (aka bölgesel) analizi için izin verir . Bizim çalışmaları için, MT büyüme dinamikleri içinde karşılaştırıldıdallanmamış bölgelerin karşı veya hücre kenarları arka karşılık gelen olan dallanmış bölgeleri. plusTipTracker yazılım veri çıkışı, aynı zamanda ayrı ayrı hücre ve hücre altı bölgelerde renk kodlu parça bindirmeleri oluşturmak için de kullanılabilir. Burada MT büyüme dinamikleri ve morfolojisi ve yön göç dallanma AT yönetmeliğine bu MT depolimeraz katkısını modüle MCAK rolünü araştırmak için kullanılan metodolojiyi açıklamaktadır. Yaklaşımımız kolaylıkla kültürlenebilir ve plazmid cDNA elektroporasyon ile indüklenen, geçici transfeksiyon oldukça uygundurlar primer insan hücre hattı, insan göbek damarı endotelial hücreleri (HUVECler) kullanılmıştır. Daha sonra yüksek çözünürlüklü kullanılan protein 3 (EB3) ve Mitotik Sentromer İlişkili kinesin (MCAK) &#39;e özgü cDNA Bağlama MT sonu ile transfekte HUVEC zaman atlamalı floresan mikroskopi MT dinamikleri üzerindeki etkileri HUVECler transfekte değerlendirmek oluşturur. EB3 ve PlusTipTracker tabanlı hesaplama görüntü analiz-etiketli MT artı uçları ölçmek ve MT büyüme dinamikleri üzerinde deneysel manipülasyon etkilerini karşılaştırmak için, zaman atlamalı görüntüler MT büyüme hızları ve MT büyüme ömürleri ölçmek oldu. Bu metodoloji MT dinamiklerinin çalışma ve alt-hücresel bölgelerindeki MT dinamiklerinin lokalize düzenleme AK dallanma ve göç anjiyogenik süreçlere nasıl katkıda tanımlanması için izin verir. Bu teknikler floresan canlı hücreler etiketli ve ifade edilebilir herhangi MAP soruşturma için de geçerlidir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aurora A Inhibitor I</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>99462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;mouse IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-1688-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti&#8211;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td>
			<td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td>
			<td>88-7788-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET455/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET525/36m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET605/70m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET605/70m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET700/75m Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>ET700/75m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>RPI Products</td>
			<td>A30075-100.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clara cooled charge-coupled device camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>77026010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyelight 649 goat anti-rat</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112-496-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-MV SingleQuot Supply &#38; Growth Factors (contents shown below)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum 25 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine brain extract 2.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 0.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL)&#160; 10.0 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic shutter</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>77016099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S80026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT Protease inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-78425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-mouse</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-036-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP goat anti-rabbit</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-036-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8006-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TiE</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>ASI Technologies</td>
			<td>MS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>CS70330-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GAPDH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MCAK</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS310000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>Contains the electroporation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>91670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum jelly</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2021854-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plusTipTracker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti&#8211;pT288&#8211;Aurora A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti&#8211;&#945;-tubulin</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA78G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>678-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk&#160;</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Yokagawa CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

canlı hücre mikroskopi için HUVEC kültürü Floresan proteinleri eksprese HUVEC&#39;lerin canlı hücre görüntüleme HUVECler normal hücre büyümesi ve bakımı, hem de normal bir protein ekspresyonu ve işlevi için uygun olan bir ortamda muhafaza gerektirir. 1 protokolünün şematik bir biçimde göstermektedir tamponlanmış hazırlamak için kullanılan göstermektedir ve kapalı sistem canlı hücrelerin zaman atlamalı görüntüleri toplamak için optik özelliklerini optimize koruduğunu. Çift taraflı bant ince şeritler, bir cam slayt (Şekil 1A) üzerine yerleştirilir ve daha sonra kültüre HUVECler içeren lamel hücreleri slayt (Şekil 1B) bakacak şekilde, bandın üzerine ters çevrilir. Bu şekilde, şerit iki cam yüzeyleri arasında küçük bir boşluk içerir ve hücreler, uygun bir hücre kültür ortamı içinde banyo edilebilir bir alan oluşturur (Şekil 1C, yukarıda, Protokolü 4). benkapalı bir sistem oluşturmak için (Şekil 1D 1 karışımı, valap 1: 1): lanolin: parafin na son adım, cam lamel bir vazelin ile cam slayt kapatılır. Bu hücre kültürü yaklaşımı kısa zaman dizisi EB3 kuyruklu yıldızların görüntüleme ve daha uzun dallanma zaman dizisi ve göç deneyleri için her ikisi için de kullanılmıştır. Ayrıca, valap balmumu benzeri tutarlılık sabitleme ve immüno dahil tamamlayıcı yaklaşımlar (Protokol 8) böyle deney, bir görüntüleme sonunda cam slayt ve lamel kolay çıkarılması için izin verir, aynı lamel ve hücre numunesi üzerinde yapılabilir bu canlı hücre görüntüleme yaklaşımı kullanılarak görselleştirildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> Şekil 1:. Canlı hücre mikroskopik görüntüleme için HUVEC kültürünün Metodolojisi (A) 0.65 cm x 2 içine çift taraflı bant 2 adet kesin.50 cm dikdörtgen şeritler ve slayt alt kenarı boyunca bir yatay slayt üst kenarı boyunca çift taraflı bant parçası ve diğer parça, sabitleyin. (D) &#39;de tarif edildiği gibi haznesi sızdırmaz kılınması için bant ve slayt kenarı arasındaki boşluk küçük bir miktar sağlamak için önemlidir. (B) forseps HUVECler içeren lamel kaldırmak ve bant parçaları üstündeki lamel (aşağı hücre tarafı) ters kullanma. Bir mikropipet kullanarak (C), lamel ve cam slayt ile (25 uM HEPES ile desteklenmiş tam endotel bazal ortamı) görüntüleme ortamı 40 ul ekle. lamel ve slayt arasındaki boşluk tamamen görüntüleme ortamı ile dolu olduğundan emin olun ve kabarcıkları önlemek. Gerekirse, aşırı ortamı çıkarmak için lamel kenarı boyunca bir aspiratör kullanın. (D) sıcak valap kullanın (1: 1: 1 vazelin: lanolin: parafin) lamel kenarlarında mühür. görüntüleme medya sızıntı olup olmadığını kontrol edinlamel yavaşça etrafında iterek s. Düzeltmek için ek valap kullanın. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> floresan etiketli EB3 otomatik izleme tüm hücre ve bölgesel MT büyüme dinamiklerinin kapsamlı bir analiz sağlar. EB3 protein açık tat ve son derece zaman ve mekan çözülmüş mikroskopik görüntü toplama hücresi içinde EB3 hareketleri analiz için esastır. floresan etiketli EB3 bir HUVEC sentezleme hücre ve floresan yoğunluğu, tipik olarak saatlik bir süre boyunca, aynı hücre içinde artar hücreye büyük farklılıklar gösterir. Nedenle, düşünün ve MT büyüme dinamikleri üzerinde artan EB ifade potansiyel etkilerini belirlemek amacıyla ifade profilinde bu değişiklikleri takip etmek önemlidir. Bu en iyi değerlendiren gri skala floresan intensit gerçekleştirilirY, her bir görüntülü hücre için profiller ve daha sonra, gri ölçekli ekspresyon profilleri tanımlanmış bir dizi sergileyen diğer hücrelere veri analizi sınırlayan. sentezleme profili veri setlerinin ilk değerlendirme kritiktir ve her hücre için plusTipTracker yazılım tarafından elde edilen MT büyüme dinamiği verileri ile karşılaştırılmalıdır. İfade profilleri için gri ölçekli ifadesi istenen aralığını belirlemek ve potansiyel outliers belirlemek için, MT büyüme hızı ve bir deney grubu içindeki her hücre için MT büyüme ömrü karşı çizilebilir. Bir HUVEC bir fibronektin substrat üzerinde kültüre Şekil 2 vurgular (yukarıda Protokolü 2.1, bakınız) ve MAPPLE etiketli EB3 optimal düzeylerde yakın dile getirdi. Floresan EB3 kuyruklu 12 sn (Şekil 2A) bir süre boyunca bir görüntü zaman atlamalı seri gösterilmiştir. plusTipTracker yazılımını kullanarak EB3 kuyruklu analizi otomatik bir, kare-kare EB3 kuyruklu yıldız DETE içerirction (yeşil ve sarı noktalar, Şekil 2B). Her çerçevesinde tespit edilen kuyruklu yıldızlar daha sonra EB3 parçaları ve görsel EB3 parça bindirme (Şekil 2C-F) üretmek için, çerçeve-kasa gelen pozisyonda kendi değişim bağımlı, bağlantılıdır. Parça bindirmeleri renk kodlu ve renk ayrımları kullanıcı tarafından girilen parametrelere göre belirlenebilir vardır. Genellikle, bu ayrımlar MT büyüme hızı ve MT büyüme ömür boyu 5,31 küresel ortalama kullanabilir ve böylece dört gruba veri split: yavaş ve kısa süreli (kırmızı), yavaş ve uzun ömürlü (sarı), hızlı ve kısa (yeşil) yaşamış, hızlı ve uzun ömürlü MT büyüme (mavi; Şekil 2G). EB3 etiketli MT büyüme dinamiklerinin PlusTipTracker aracılı izleme ayrıca İlgi (ROI) kullanıcı tanımlı Bölgeler sağlar. PlusTipTracker böylece MT büyüme dynam karşılaştırmalar için izin, kullanıcı tanımlı ROI (Şekil 2A, B ve F) içinden MT büyüme iz veri ayıklayanAynı hücrede farklı bölgeleri içinde ics. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> Şekil 2: EB3 kuyruklu algılama, izleme ve plusTipTracker veri çıkışı bir HUVEC ifade MAPPLE EB3 (A) time-lapse film.. Sol paneli hücre sınırları demarking bir bütün hücre görünümü ve tüm hücre maskesi (beyaz çizgi). Kırmızı kutu zaman atlamalı görüntüleri (sağ paneller) &#39;de gösterilen büyütülmüş bölgeyi temsil eder. Sağ paneller ardışık görüntüleme çerçeveleri (- t = 12 sn t = 0 sn) EB3 kuyruklu yıldızların ham gri skala zaman atlamalı görüntüleri göstermek. (A) gösterilen görüntülerden EB3 kuyruklu (B) plusTipTracker algılama. Sol panel tespit kuyruklu (sarı nokta) &#39;in bir tam hücre görünümünü göstermektedir. Kırmızı kutu zaman atlamalı görüntüleri (sağ paneller) &#39;de gösterilen büyütülmüş bölgeyi temsil eder. Sağ paneller beş algılandı EB3 kuyruklu (kırmızı oklar) vurgulamak ve 12 sn görüntüleme süresi boyunca bu beş kuyruklu iz. Yeşil<html> noktalar önceki zaman aralığında yoktu (ya da tespit edilmedi) EB3 kuyruklu tespit temsil eder. (C) (A) gösterilen EB3 kuyruklu 61 kare (2 dk film) maksimum yoğunluk projeksiyonu. (D) (C) gösterilen aynı 61 kare (2 dk film) ve plusTipTracker MT parça kaplaması. Maksimum intensite projeksiyon (E) Zoom (C kırmızı kutu). Maksimum yoğunluk projeksiyon plusTipTracker MT iz bindirme (F) Zoom (D kırmızı kutu). (G) parça (D) &#39;de gösterilen bindirmeleri ve (F) için efsane renk kodlu. Tanım olarak yavaş, hızlı, kısa süreli veya uzun ömürlü on MAPPLE-EB3 ifade HUVEC bir grup ölçülen tüm büyüme parçalar için ortalama değeri dayanmaktadır. kolay görselleştirme için, (D) ve (F) &#39;de parça bindirmeleri (A)&#39; da gösterilen hücre görüntünün ters piksel yoğunlukları kullanılarak oluşturulur. Ölçek çubukları 20 mikron =./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. HUVEC dallanma ve göç yolları ECM gelen sinyalleri fiziksel Mechano duyarlıdır. HUVECler iyi belirli bir sinyal işaret (ler) 36,40-42 uygun bir hücresel yanıt dikte morfolojik değişiklikler geçmesi, bunu yaparken, sinyalizasyon ipuçları çeşitli cevap ve bilinmektedir. HUVECler fibronektin kaplı cam yüzeylerde (Şekil 3A) kültüre, ya da sert 2-boyutlu poliakrilamid ECMs üzerinde (55 kPa), tipik olarak birkaç farklı dallı çıkıntılar (Şekil 3B) ile bir yuvarlak veya uzun morfolojiye sahiptir. Bununla birlikte, kültürlendiğinde çok yumuşak 2 boyutlu poliakrilamit ECMlerin (0.7 kPa) üzerinde HUVECler kaynaklandığı bilinen bir çok dallı morfolojiye sahiptir aşağı uygun kaynaklımiyozin II kontraktilite 4,5,31 (Şekil 3C) düzenlenmesi. Bu nedenle, HUVECler ECM mechanosensing yoluyla hücresel morfoloji düzenler ve bu MT dinamikleri ve akto-miyozin kontraktilite lokalize modülasyonu yoluyla gerçekleştirilir. HUVECler dallanma HUVEC ölçmek amacıyla, morfolojik nitelikleri geniş bir yelpazede görüntüler Çünkü ilk dallı bir çıkıntı ne olduğunu tanımlamak ve sonra bir dallı çıkıntı objektif ölçülecektir nasıl tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Bir teknik, bir hücre sınırı veya &quot;maske&quot; Hücre kenarlarını (Şekil 3D) tanımlamak için bir flüoresan birim işaretleyici ifade eden bir hücrenin bir görüntü kullanılarak hücrenin kenarlarını takip el ile elde edildiği bir dört aşamalı bir yaklaşım kullanılır. Maske nesil sonra, şube kökenleri dallı çıkıntı ve hücre gövdesi arasındaki eğrilik en büyük açı bulmak ile tanımlanır. Bir çizgi dema çekilirrk &quot;şube kökenli&quot; (mor açılı hatları Şekil 3E). Branch numarası tanımlanan şube kökenli (Şekil 3F) dalların sayısının sayılmasıyla basit ölçülür. Dal uzunluğu uzak kolu ucuna (Şekil 3G) şube kökenli mesafe olarak ölçülür. Veri analizi küçük lamellipodial projeksiyonlar dahil önlemek için, ek kriter onlar ( &quot;şube kökenli&quot; at) geniş daha dalları ( &quot;dal uzunluğu&quot;) daha uzun olmalıdır gerektirir ve dalları uzunluğunda 5 en az on mikron olması gerektiğini 31. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . Şekil 3: HUVEC dallara ayırma morfolojisi analizi (A - C) HUVEC DIC görüntü örnekleri fibronektin kaplı cam ECMlerin (A) katı (55 kPa) poliakrilamid ECM&#39;ler (B) ve yumuşak bir kültüre (0.7kPa) poliakrilamid ECM&#39;ler (C). Sert ECMlerin (A, B) ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde 0,7 kPa poliakrilamid ECMlerin (C) kültürlenmiş HUVEC artar dallanma. (D). Bir MAPPLE-C1 cDNA inşa ifade eden bir transfekte HUVEC DIC mikroskobik görüntü (sol resim) (hücre hacmi işaretleyici, sağ resim). (Membran büyük eğrilik gösterir pozisyonda yani, mor renkli çizgiler) (E) eğrilik en büyük açı bularak şube kökeni tanımlayın düz bir çizgi ile açıları bağlamak ardından şube her iki tarafında ve (mavi çizgiler) . (F) belirlenmesi ve (E tanımlanan) &quot;dal kökenli&quot; dan&gt; 10 mikron uzatmak dallı çıkıntıları seçilmesi. elde etmek için dallı çıkıntılar sayısını &quot;şube sayısını.&quot; (G) mo için &quot;şube kökenli&quot; merkezine uzaklığı ölçünelde etmek için NIS Elements Yazılım açıklamalar ve ölçümler uygulamasında satırı aracını kullanarak şube st uzak nokta &quot;şube uzunluğu.&quot; Ölçek çubukları 20 mikron =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> algılama ECM uyulmasının yanı sıra, HUVECler da hissedebilir ve çizik yaralama tarafından uyarılan bitişik hücresel kişileri ortadan kaldırılmasına tepki. göç deneyde, HUVECler bir tek tabaka kültüre bir çizik yaraya maruz ve göç özellikleri (yukarıda, Protokol 9) ölçülür. Tek tabaka kazıyarak yara indüksiyon sonrası, yara-kenar HUVECler yara (Şekil 4A, t = 0 saat) içine uzanan bir çıkıntılı öncü geliştirerek polarize. 10-12 saatlik bir zaman süresi boyunca, polarize yara kenarı HUVECler yara bölgesine göç ve dolguyara, yeni bir konfluent tek tabaka oluşturulması (Şekil 4A, t 11 saat =). HUVEC dallanma olduğu gibi, mevcut delil kutuplaşma ve göç MT koordineli yeniden örgütlenme ve aktin cytoskeletons 43-49 üzerine eleştirel bağımlı olduğunu göstermektedir. Bu, ancak yara kenarı HUVECler 31 arka kenarında, ön kenarda MCAK kaynaklı MT sökme lokalize inhibisyonu yoluyla, kısmen, elde edilir. MT dinamiklerinin hassasiyet, yara ile indüklenen Aurora-A fosforilleyen ve ön kenarında MCAK inhibe kinaz ve MAP inhibe edilmesi veya aktive edebilen diğer kinazlar dahil olmak üzere çok sayıda alt-düzenleyici proteinleri, hedef Rac1 GTPaz tarafından başlatılır polarizasyon yerel MT büyümesini modüle eden ve 18,31,36,48,50-53 büzülme. Kapsamlı deneysel kanıtlar kenar çıkıntısı ön ve arka kenar daralma koordinasyonu Rac1 aktivasyonu döngüleri yoluyla idare olduğu görüşünü desteklemektedirböylece yönlendirilmiş hareketliliği 9,41,51,52,54-58 sürüş firar kenarında acto-miyozin kontraktilite için öncü MT montaj ve RhoA aktivasyonunu teşvik etmek. Bugüne kadar, hücre göçü otomatik izleme gerçekleştirmek için kurulmuş bir yöntem mevcut değildir. Bu hesaplama yara kenar hücreleri polarize ve göç olarak sürekli değişiyor hücre ECM sınırlarını analiz zorluk bir sonucudur. Birçok yazılım programları floresan etiketli hücreler 59-64 izleme yeteneğine sahip olmakla birlikte, yara kenarı taşıma deneylerinde HUVECler floresan etiketli yığın toplamı HUVEC nüfusun yaklaşık% 30-40, ve bu nedenle yara kenarı hücrelerin çoğunluğu gerekir faz-kontrast ya da DIC görüntüleme tarafından görüntülenmiştir. Ayrıca, yara-kenar göç ölçme belirli belirlenmesi için aynı yara içinde floresan ve floresan olmayan hücrelerin değerlendirilmesi zaman önemlidirİfade etkileri deneysel çalışma grupları dahilinde ve deneysel çalışma grupları arasında hem oluşturur. Şu anda, HUVEC göç ölçmek için en iyi yaklaşım, bir yara kenar hücresi ilk olarak tespit edilir ve daha sonra çekirdek ve nükleolus (Şekil 4B) tespit edildiği bir el izleme yaklaşımının kullanılmasıdır. Çekirdekçik nedeniyle yüksek ışık saçılması yoğunluğu ve göreceli olarak küçük bir boyuta hücre takibi için konum belirleyici olarak kullanılır. Çekirdekçiğin Bu iki özellik daha kolay tespit etmek ve kullanıcı bireysel parça pozisyonları yerleştirebilirsiniz hangi bölgeyi sınırlayarak ölçüm hatalarını azaltmak için yapmak. HUVEC göç parça daha sonra art arda time-lapse görüntü çerçevelerinde çekirdekçik tıklayarak oluşturulur. Son olarak, kökeni göç hızı ve göç mesafesi ölçüldü ve deney ve kontrol gruplarının hücre (Şekil 4B) için analiz edilir. <img alt="Şekil 4,"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg&quot; /&gt; Şekil 4: yara-kenar HUVEC ve göç izleme analizi çizik yara kenar HUVEC&#39;lere (aka &quot;Göç Deneyi&quot;) bir 11 saat zaman atlamalı görüntüleme serisinin (A) 20X faz-kontrast görüntüler.. Göç yara ve yönü paneli t = 0 saatte belirtilmiştir. hücrelerin tek bir tabakası oluşuncaya kadar HUVECler yaraya bir yara kenar ve önceden çapraz gösterilmiştir (t = 3.5 saat - T 11 saat =). (B) geçiş deneyi zaman atlamalı görüntüleme analizi, (A &#39;de gösterildiği gibi), ilk hücre yere göre bir izlenebilir yara kenarı HUVEC kimlik (fiziksel yara kenarında, yani hücreleri) ve sentezleme profili (mekanizması doğrultusuyla satmaya gerektirir. deney GFP ifadesini içeriyorsa,) yeşil yara kenar hücreyi seçin. Faz kontrastlı görüntü kullanılarak, çekirdeği ve nükleolusa tanımlar. El, kullanarak ardışık time-lapse görüntüleri nükleolusa izlemekNIS Elements yazılımı gösterimler ve ölçümleri uygulama kökenli göç hızı ve mesafeyi belirlemek için. Ölçek çubukları = 100 mikron (A), 20 mikron (B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells at JoVE.com

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

high-resolution-time-lapse-imaging-automated-analysis-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Görüntüleme.  University of the Sciences in Philadelphia. Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed. 

Video: High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Biyoloji

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Hızlandırılmış Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskomu için Mitokondriyal Nükleoidlerin Özel Etiketlemesi

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...