אנו מכירים את התמיכה של מענקי NIH R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, קרן Oak והמעבדה Hagey לילדי רפואת רגנרטיבית.

הערה: הצהרה אתית: כל המחקר מעורב בעלי חיים בעלי חוליות בוצע בפרוטוקולים בהתאם אושרו על ידי אוניברסיטת סטנפורד המנהלית הלוח במעבדת טיפול בבעלי חיים (APLAC). 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלו 10 מיליליטר של תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות זמינה מסחרי (המכילה diatrizoate polysucrose ונתרן, מותאם לצפיפות של 1.077 גר &#39;/ מיליליטר) לבוא לRT בצינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן cytometry זרימה (FACS) חיץ עם פוספט 1x סליין (PBS) ו- 2% עוברי עגל בסרום (FCS). קח aliquot 50 מ&quot;ל ולשמור aliquot זה ב RT לשימוש במהלך שלב תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לי דלי הקרח מוכן כדי לשמור על רקמה מבודדת ותאים בבמהלך הליך הבידוד. </li></ol> 2. הכן תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת בסיסית: ממ (בינוני חיוני מינימאלי), ללא פנול אדום (500 מיליליטר), גלוטמט (1x), FCS (10x), 10,000 יחידות / מיליליטר penicillin (1x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן תקשורת בסיסית עם מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת האינדוקציה מקרופאג מח עצם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 50 מיליליטר של התקשורת הבסיסית מוכנה בשלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פרוסטגלנדין E2 (PGE2, ז מר 352.465 / mol) בשעה 10 -7 ריכוז סופי M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מקרופאג-מושבה מגרה פקטור (M-CSF) בשעה 10 ng / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תסנן את הפתרון הסופי של מקרופאג מח עצם גירוי תקשורת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת אינדוקציה האוסטאוקלסטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 50 מיליליטר של התקשורת הבסיסית מוכנה בשלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פרוסטגלנדין E2 (PGE2, ז מר 352.465 / mol) בשעה 10 -7 ריכוז סופי M </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מקרופאג-מושבה מגרה פקטור (M-CSF) בשעה 10 ng / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף RANKL ב 10 ng / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תסנן את הפתרון הסופי של תקשורת אינדוקציה האוסטאוקלסטים. </li></ol></li></ol> בידוד 3. מח העצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים C57BL עכבר אחד / 6בשיטת שאיפת פחמן דו חמצני, ואחריו נקע בצוואר הרחם. הערה: מכרסמים חייבים להיות מורדמים על ידי צוות מיומן תוך שימוש בטכניקה, ציוד וסוכנים מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדה ולאבטח את העכבר על לוח לנתיחה ולרסס עם אלכוהול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את עצמות הירך, tibiae, humeri ועמוד השדרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתחיל עם העכבר במצב שכיבה. עושה חתך אנכי לאורך הגפה התחתונה ולהתחיל לנתח לאורכו של עצם הירך ועצם השוק על ידי חלוקת קבצים מצורפים רקמות רכות. לבסוף, לנקוע עצמות ממפרק הברך והירך לשחרר עצמות באופן מלא מהשלד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לעשות חתך לאורכו של האיבר העליון לבודד את הזרוע. לנקוע הקרסול במפרקי כתף ומרפק ידי לנתח קובץ מצורף קופסית רקמה רכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להפוך את העכבר מעל, כך שהעכבר שכובה פרקדן. לעשות חתך בעור לאורכו של עמוד השדרה, בקו האמצע. שים לב הרך ליד חוליות עמוד שדרהרקמה בכל צד של עמוד השדרה ולַחתוֹך לאורך הקצה הגרמי של עמוד השדרה, לנתח באמצעות מסת הרקמה הרכה ליד חוליות עמוד השדרה. בעזרת מספריים, לעשות חתך אופקי על פני עמוד השדרה בבסיס הצוואר, ובסופו של עמוד השדרה, רק הפרוקסימלי להחדרת הזנב, לשחרר את עמוד השדרה מקובץ מצורף רקמות רכות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהעצמות נקצרים, לשמור אותם במאגר FACS על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנייר טישו כדי לנקות שרירים ורקמות רכות מהעצמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העצמות ניקו למכתש ועלי עם 3 מיליליטר של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסק את העצמות בעדינות במכתש ועלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזל מוכתם בדם ולהעביר לתוך צינור 50 מיליליטר חרוטי על ידי העברת הפתרון דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר FACS חיץ עד לשד העצמות המרוסקים ולמחוץ נוסף. שוב, להסיר את הנוזל בעזרת פיפטה ולהעביר לצינור חרוטי 50 מיליליטר דרך מסננת 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל לרסק את השפה טווית עצמותce עד שלוש פעמים במאגר FACS טרי, בעזרת מכתש ועלי, בכל פעם מוסיפה 5 מיליליטר נוסף של חיץ FACS הטרי, עד שהנוזל לא כתם אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה פתרון מח העצם ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להניב תא גלולה. </li></ol> 4. הפרדת צבע של תאי מח העצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant וגלול ב 10 מיליליטר של חיץ FACS (שמרו על RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של תקשורת זמינה מסחרי הפרדת תא שיפוע צפיפות (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת פתרון מח עצם על תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות. לעשות זאת באמצעות פיפטה חשמלית לאט. זווית קצה פיפטה כנגד המשטח הפנימי בחלקו העליון של צינור חרוטי ולהטות את צינור חרוטי לכ -30 מעלות. שימוש בהגדרת מהירות איטית בפיפטה, בעדינות לגרש את פתרון מח עצם כדי שלא להפריע לתקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות. הערה: בסופו של יהיולהיות הגדרה ברורה בין שני הפתרונות (פתרון סלולארי ופתרון תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות צנטריפוגות RT, צנטריפוגות תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות ופתרון תא בצנטריפוגה מאוזנת ב XG 200 במשך 15 דקות. בנוסף, להסיר את האצה ההאטה בצנטריפוגות כדי להבטיח הפרדה פאזות נאותה באמצעות שיפוע תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב את השכבה האמצעית מעונן המכילה את תאי מח עצם של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התאים האלה לתוך צינור חרוטי חדש. להוסיף 20 מיליליטר של חיץ נוסף FACS (שמר על קרח) כדי לשטוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להניב תא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה תא הסופי ב1ml של מקרופאג גירוי תקשורת, כדי לאפשר ספירת תאים באמצעות hemocytometer. </li></ol> ספירת 5. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μl של פתרון התא ומערבביםעם 10 μl של trypan כחול. טען 10 μl של תמהיל התוצאה על hemocytometer ולהשיג את ספירת תאים לכל מיליליטר של תמיסה. </li></ol> Culturing 6. הנייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 מיליליטר של תקשורת מקרופאג גירוי לבאר כל צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 200,000 תאים היטב כל אחד. הערה: מניסיוננו, צפיפות תאי ציפוי היא אחת הדרישות החשובות ביותר עבור נאות בתרבית במבחנה של osteoclasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להתסיס את הצלחת ומניחים בחממה רגילה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא לשנות את התקשורת במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 ימים בתקשורת מקרופאג גירוי, לשנות את התקשורת לתקשורת האוסטאוקלסטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאן והלאה, לשנות את התקשורת מדי יום במשך 5-7 ימים, ובשלב זה, osteoclasts הגדול, multinucleated צריך להיות גלוי על צלחת התרבות. </li></ol> 7. צביעה עם Tartrate עמיד החומצה phosphatase (TRAP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5-7 ימים של במבחנה רחוב ללא מוצאמכשור, לשאוב את התקשורת מהתרבות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות בעדינות עם פעמים PBS שלוש 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספת 4% פתרון paraformaldehyde ולהשאיר למשך שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להכין את כתם המלכודת (שהוא זמין באופן מסחרי) על ידי התחממות מראש ל -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה 1 בparaformaldehyde, לשאוב את paraformaldehyde ולשטוף בעדינות 3 פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של כתם מלכודת מראש חימם לבאר כל הצלחת להיות מוכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לשאוב את כתם TRAP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות 3 פעמים עם מים ללא יונים מחוממים מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain היטב עם Hematoxylin של גיל (זהירות) ל1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> osteoclasts תמונה באמצעות מיקרוסקופ שדה הבהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בארות עם מים ללא יונים עד עוצמת צבע מספקת של הכתם מושגת, בדרך כלל, כאשר גרעינים מופיעים Bluדואר. </li></ol> 8. האוסטאוקלסטים הספיגה Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצלחת תרבות קלקר 24 גם זמינה מסחרי שהיא מראש מצופה גם עם מצע עצם או ציפוי גבישי סידן זרחה אי-אורגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 מיליליטר של תקשורת מקרופאג גירוי לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 200,000 תאי מח עצם מבודדים טרי שהושגו בסופו של שלב 2 זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להתסיס את הצלחת לפני הצבתו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, לשנות את התקשורת לתקשורת בידול האוסטאוקלסטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שינויי תקשורת יומיומיים עם תקשורת בידול האוסטאוקלסטים 5-7 ימים. </li></ol> 9. כימות האוסטאוקלסטים ספיגת הפעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5-7 ימים של תרבות במבחנה בתקשורת בידול האוסטאוקלסטים על מצע mineralized, לנתח את פני השטח mineralized, כפי שיתואר להלן, על מנת להעריך את יכולתו של osteoclasts כדי ליצור resorptiעל בורות, אינדיקציה לפעילות osteoclastic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מצלחת assay הספיגה ולהוסיף 10% פתרון אקונומיקה 100 μl היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם פתרון אקונומיקה 10% במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות 3 פעמים במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את כל מים שנותרו ולהתנער ממים עודפים מהצלחת ולאפשר לאוויר יבש במשך 3-5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain הצלחת עם ערכת צביעת פון Kossa זמינה מסחרי כדי לאפשר להדמיה קלה יותר של המצע-resorbed האו&quot;ם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ שדה הבהיר לקחת תמונות של חלקי נציג של פני השטח resorbed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת ניתוח תמונה, לחשב את אחוז שטח resorbed כדי לאפשר כימות של פעילות resorptive osteoclastic. </li></ol>

<ol>
	<li>Sims, N. A., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+the+activities+of+bone+formation+and+resorption:+a+multitude+of+signals+within+the+basic+multicellular+unit.">Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit.</a> BoneKEy reports. 3, 481 (2014).</li><li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cell+lineage+in+bone+using+a+chimaera+of+chick+and+quial+embryonic+tissue.">Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue.</a> Nature. 258, 325-327 (1975).</li><li>Walker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+restored+in+osteopetrotic+mice+by+transplants+of+normal+bone+marrow+and+spleen+cells.">Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells.</a> Science. 190, 784-785 (1975).</li><li>Burger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+formation+of+osteoclasts+from+long-term+cultures+of+bone+marrow+mononuclear+phagocytes.">In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).</li><li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+where+comes+the+osteoclast.">From where comes the osteoclast.</a> The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bench+to+bedside:+elucidation+of+the+OPG-RANK-RANKL+pathway+and+the+development+of+denosumab.">Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab.</a> Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).</li><li>Brown, J. E., Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denosumab+in+patients+with+cancer-a+surgical+strike+against+the+osteoclast.">Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).</li><li>Khosla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+the+OPG/RANKL/RANK+system.">Minireview: the OPG/RANKL/RANK system.</a> Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).</li><li>Boyle, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MAPK+kinases+MKK3+and+MKK6+in+osteoclastogenesis+and+bone+loss.">Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss.</a> PloS one. 9, (2014).</li><li>Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand+and+osteoprotegerin+in+bone+cell+biology.">Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology.</a> Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).</li><li>Teramachi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IL-6+Expression+in+Osteoclasts+is+Necessary+but+not+Sufficient+for+the+Development+of+Paget's+Disease+of+Bone.">Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).</li><li>Catalfamo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+induced+and+intrinsic+alterations+in+type+2+diabetes-derived+osteoclast+function.">Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function.</a> Oral diseases. 19, 303-312 (2013).</li><li>Schueler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratibial+injection+of+human+multiple+myeloma+cells+in+NOD/SCID+IL-2Rgamma(null)+mice+mimics+human+myeloma+and+serves+as+a+valuable+tool+for+the+development+of+anticancer+strategies.">Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-Based+Osteoclastogenic+Assays+from+Murine+Bone+Marrow+Cells.">RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblasts+provide+a+suitable+microenvironment+for+the+action+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand.">Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand.</a> Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+osteoclast+development+and+function.">Genetic regulation of osteoclast development and function.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).</li><li>Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors+and+bone+metabolism.">Endocrine disruptors and bone metabolism.</a> Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).</li><li>Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+and+androgen+receptors+in+bone+health+and+disease.">The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).</li><li>Martin, T. J., Udagawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+osteoclast+function.">Hormonal regulation of osteoclast function.</a> Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts.">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130, 811-823 (2007).</li><li>Bellido, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+interleukin-6,+osteoclastogenesis,+and+bone+mass+by+androgens.+The+role+of+the+androgen+receptor.">Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor.</a> The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).</li><li>Roato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+among+cells+of+bone,+immune+system,+and+solid+tumors+leads+to+bone+metastases.">Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases.</a> Clinica., &amp; developmental immunology. 2013, (2013).</li><li>Autio, K. A., Morris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bone+physiology+for+the+treatment+of+metastatic+prostate+cancer.">Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer.</a> Clinical advances in hematolog., &amp; oncology. 11, 134-143 (2013).</li><li>Sottnik, J. L., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+targeting+osteoclastic+activity+in+prostate+cancer+bone+metastases.">Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases.</a> Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).</li></ol>

אף אחד מהמחברים יש גילוי או ניגוד העניינים להכריז.

יכולת לבודד בקלות ולטפח מספר גדול של osteoclasts במבחנה הייתה אחראית על סיוע לקידום הבנה של ביולוגיה עצם ומחלות תיווך האוסטאוקלסטים. זה היה זיהוי של RANKL שיובילו לכך, בעת שזוהה לאחרונה כרגולטור העיקרי של היווצרות האוסטאוקלסטים, בידול והישרדות 16-18. זה היה הניסיון שלנו כי הטיפוח במבחנה של osteoclasts ממח עצם תלוי במידה רבה בצפיפות זריעה. הבחנו כי כישלון של פרוטוקול זה כדי להניב osteoclasts הוא בדרך כלל עקב צפיפות זריעה הכי מוצלחת כאשר ציפוי תאים שמקורם במח עצם. כך, בפרוטוקול זה, מומלץ לזרע 200,000 תאים לכל צלחת 24 גם כן. יתר על כן, על מנת להשיג הצלחה מקסימלית עם טכניקה זו, מומלץ להכין את תקשורת האינדוקציה האוסטאוקלסטים בדיוק כפי שתואר לעיל ולשנות את התקשורת ביםזמן ame בכל יום, לאחר 3 הימים הראשונים שבם לא צריך להפריע לתרבות צלחות. הדבר עשוי לאפשר ריכוז קבוע של גורמי תקשורת אינדוקציה האוסטאוקלסטים. בנוסף, מצאנו כי השימוש בחומרים כימיים מסוימים גם מאפשר פוטנציאל גדול יותר לculturing של מספר הגדול של osteoclasts multinucleated. טכניקה זו היא מוגבלת על ידי הזמינות של צנטריפוגות RT, שבו אפשר לשנות את פרמטרים של האצה האטה ורכש של חומרים כימיים מסוימים. זה אחרת פרוטוקול מאוד פשוט, שבה היה לנו הרבה הצלחה, במגוון רחב של עכברים ברמות שונים של גיל ורקע גנטי (למשל, C57BL / 6, CD1, NOD SCID, db LEP - / -). טכניקה זו מציעה שיטה אמינה ליצירת osteoclasts במבחנה ולקבוע את היכולת שלהם נספגת שוב מטריצת mineralized. שימוש בפרוטוקול זה, ניתן לבודד מספר גדול של osteoclasts multinucleated בvitro בדרך כלל בשבוע אחד. הניסיון שלנו הוא שבידוד האוסטאוקלסטים ובתרבות חוץ גופית באמצעות תוצאות טכניקות שפורסמו בעבר בתוצאות משתנים מאוד במונחים של ייצור האוסטאוקלסטים, ופעמים רבות תוצאת חוסר יכולת לטפח osteoclasts 9,12,14. הפונקציה האוסטאוקלסטים היא מורכבת וספיגת עצם היא תהליך מתוזמר ביותר שמתווך ברמה המקומית על ידי הצטלבות בין osteoblasts וosteoclasts 19. בנוסף לשליטה המקומית של איזון עצם, מתעורר ראיות מצביע על כך שהפעילות האוסטאוקלסטים נשלטת באופן מערכתי על ידי גורמים הקשורים למערכת חיסונית, עצבי, וגורמים שיטתיים אחרים 20-24. כהבנה של ביולוגיה האוסטאוקלסטים ממשיכה להתקדם במהירות, ובכלל זה תפקידם השונים בתהליכים הנעים בין שיפוץ עצם לתפקידם בויסות גרורות סרטן לעצם 25-27, פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים למורכביםently לבודד כמויות גדולות של osteoclasts במבחנה.

שיפוץ עצם הוא דינמי וכרוך בצימוד של יצירת עצם עם ספיגת עצם 1. תהליך חוזקה מוסדר זו הוא אחראי לשמירה על השלד במהלך הומאוסטזיס נורמלי, ובתגובה לפציעה ומחלה. Osteoclasts הם תאים ייחודיים, multinucleated המסוגלים resorbing שתי מטריצות אורגניות ואי-אורגניות של עצם. Osteoclasts נגזרים משושלת מונוציטים / מקרופאג של מח עצם 2-5. ליקויים בתפקוד או ההיווצרות של osteoclasts יכולים לגרום למגוון רחב של פתולוגיות קליניות, כוללים מצבים שכיחים כמו אוסטאופורוזיס. היכולת ליצור osteoclasts במבחנה אפשרה להתקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה עצם 6. כתוצאה מכך, סוכנים טיפוליים חדשים צצים לטיפול במחלות הקשורות להאוסטאוקלסטים אשר אחראים על תחלואות ותמותה משמעותיות של 7 </sעד&gt;. תחזוקת homeostatic של מסת עצם וכוח דורשת פעולה מתואמת של osteoblasts יוצרי העצם וosteoclasts resorbing עצם 8,9. הומאוסטזיס העצם משתנה במספר המחלות, כוללים אוסטאופורוזיס לאחר גיל מעבר, שבו פעילות מוגברת האוסטאוקלסטים מובילה לאובדן פתוגניים של מסת עצם וצפיפות 10. עם עלייה בזמינות של דגמים עכבריים מהונדסים של מחלות בבני אדם, יש יותר הזדמנות לפענח את התפקיד של osteoclasts במחלת עצם אנושי 11-13. פרוטוקולים רבים לטכניקות culturing האוסטאוקלסטים מופיעים בספרות, בוריאציות רבות תיארו 9,12,14. Xing ועמיתיו מתארים שיטה דומה לפרוטוקול מתואר להלן, בתיאורם של מבחני osteoclastogenic מתאי מח עצם עכבריים. עם זאת כדי לשחרר את תאי מח העצם הבאים קציר עצם ארוך, Xing לשטוף et al. העצם חלול בתקשורת מלאה α ממ14. Catalfamo בוחן את ההשפעה של היפרגליקמיה על תפקוד האוסטאוקלסטים ומתאר שיטה שבה כל התאים מגויסים על ידי שטיפת מוח עצם בתרבית למשך 24 שעות, ובנקודה שאינם חסיד התאים מבוטלים 12, טכניקה המשמשת גם על ידי בויל אח &#39; . 9 פרוטוקולים שפורסמו בעבר אלה מחייבים את הנוהג של שטיפת מוח העצם, תרגול מייגע, שגם מציג את הסיכון לפגיעת מחט מקל ואובדן מח עצם יקר, כאחד חייב לחתוך את שני הקצוות של העצם. הפרוטוקול, שאנו מתארים, מיישם את השימוש במכתש ועלי כדי לבודד osteoclasts, שהוא דומה לשיטה של בידוד מקרופאג שתואר על ידי et Weischenfeldt אל. 15 הניסיון שלנו, לעומת זאת, הוא שבידוד האוסטאוקלסטים ובתרבות חוץ גופית באמצעות תוצאות טכניקות שפורסמו בעבר בתוצאות משתנים במונחים של ייצור האוסטאוקלסטים, ופעמים רבות תוצאהבחוסר יכולת לטפח osteoclasts. לכן, אנו פיתחנו פרוטוקול המאפשר לבידוד העקבי של מח עצם עכבר כדי לייצר מספר גדול של osteoclasts multinucleated במבחנה, עם תשואה של כ 70-80% מתאים בתחילה מצופים יוצר מקרופאגים ולאחר מכן osteoclasts, בנוכחות תקשורת אינדוקציה האוסטאוקלסטים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1017">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:503px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-CSF, recombinant mouse</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMC2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>462-TEC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin E2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> Osteoclasts הם תאים מאוד מיוחדים שנובעים משושלת מונוציטים / מקרופאג של מח העצם. היכולת הייחודית שלהם לנספגות שוב שני מטריצות אורגניות ואי-אורגניות של עצם משמעות הדבר היא כי הם משחקים תפקיד מפתח בויסות שיפוץ שלד. יחד, osteoblasts וosteoclasts אחראים לתהליך הצימוד הדינמי שכולל גם ספיגת עצם ויצירת עצם פועלת יחד כדי לשמור על השלד הנורמלי במהלך מחלה ובריאות. כתא resorbing-העצם העיקרי בגוף, שינויים בבידול האוסטאוקלסטים או פונקציה יכולים לגרום להשפעה עמוקה בגוף. מחלות הקשורות לתפקוד האוסטאוקלסטים שינה יכולים טווח חומרת מחלה בילוד קטלנית עקב אי ליצור חלל מוח לhematopoiesis, לנצפתה יותר בכינוי פתולוגיות כגון אוסטאופורוזיס, שבו ספיגת עצם osteoclastic מוגזמת לתשומה כדי לשבר היווצרות. אף אוזן גרון &quot;&gt; יכולת לבודד osteoclasts במספרים גבוהים במבחנה אפשרה להתקדמות משמעותית בהבנה של מחזור שיפוץ עצם וסללה את הדרך לגילוי של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות שמאבק במחלות אלו. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד ולטפח osteoclasts ממח העצם של עכבר שיניב מספר גדול של osteoclasts.

<html> מטרתה של שיטה זו הייתה לבודד בקלות מספר רב של osteoclasts במבחנה, בדרך כלל בשבוע אחד. בידוד מוצלח של מספר רב של osteoclasts אושר באמצעות מכתים tartrate עמיד phosphatase החומצה (איור 1 א). osteoclasts גדול הם דמיינו כתאים סגולים גדולים עם גרעינים רבים (בדרך כלל ≥ 3 גרעינים). שימוש בפרוטוקול זה, זה נפוץ לבודד osteoclasts עם כ -30 גרעינים להאוסטאוקלסטים (איור 1). שימוש במשטח mineralized נחשב שיטת תקן הזהב להערכת פעילות resorptive האוסטאוקלסטים במבחנה. באמצעות שיטה זו, אחוז משטח mineralized, או &quot;בורות ספיגה&quot; שיצר מאפשרת לקביעת קיבולת resorptive האוסטאוקלסטים (איור 2). _upload / 52,056 / &quot;width =&quot; 52056fig1highres.jpg 500 &quot;/&gt; צביעת איור 1. (א) Tartrate חומצה עמידה phosphatase של מח עצם בתרבית הבאה 10 ימים בתרבות בתנאים אינדוקטיביים האוסטאוקלסטים. מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה 10x מדגים osteoclasts מרובה גדול, multinucleated כי הם מלכודת (כתמים סגולים) חיוביים. דוגמה להאוסטאוקלסטים גדול, multinucleated מתואר על ידי קו מקווקו אדום. מיקרוסקופ שדה (ב) מואר בהגדלה 10x מפגינה האוסטאוקלסטים חיובי גדול, multinucleated, TRAP. דוגמא לגרעין בתוך האוסטאוקלסטים multinucleated מוצגת על ידי החץ האדום. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52056/52056fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52056/52056fig2highres.jpg" width="500" /><br/&gt; איור 2. מיקרוסקופ שדה מואר בהגדלה 10x מדגים בורות ספיגה שהוקמה על ידי פעילות ספיגת osteoclastic. מטריצת Mineralized מוכתמת בכתם פון Kossa כדי לאפשר להדמיה. שחור קווים מקווקווים מתארים דוגמא לאזורי resorbed של מטריצה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52056/52056fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts הוא תא resorbing-עצם העיקרי בגוף. יכולת לבודד osteoclasts במספרים גדולים הביאה התקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה האוסטאוקלסטים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבידוד, טיפוח וכימות פעילות האוסטאוקלסטים במבחנה.

גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

osteoclast-derivation-from-mouse-bone-marrow

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

24.0K Views.  Stanford University School of Medicine.  Osteoclasts הוא תא resorbing-עצם העיקרי בגוף. יכולת לבודד osteoclasts במספרים גדולים הביאה התקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה האוסטאוקלסטים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבידוד, טיפוח וכימות פעילות האוסטאוקלסטים במבחנה. 

Video: Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

ביות של תאים hematopoietic אל מח העצם

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.