Name: imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators
Uploaded: 2014-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators at JoVE.com

Işin çoğunluğu ve ilgili personel NIH hibe NS060677 ve kısmen NIH MH099559 ve (BSK kadar) MH104069 verir tarafından desteklenmiştir. Eserin de CHDI Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan protokoller Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri göre ve UCLA Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1.1) Mikropipet, AAV2 / 5 Virüs Yükleme hazırlayın <ol><li> Virüsün enjeksiyon için iyi borosilikat cam mikropipetler kullanın. Dikey bir çekici ile iki aşamalı bir çekme programı kullanılarak mikropipet çekin. Konik bir pipet öğütücü kullanılarak 40 ° &#39;lik bir açı ile pipet. 40 um ve 6 bir şaft uzunluğu - - 7 mm kullanım için ideal olan pipet 20 bir uç çapına sahip olacaktır. Pipet ve cerrahi aletler otoklav. Tatbikatta,% 70 etanol ile silinerek sterilize edilir. </li><li> 10 ul alikolar içinde -80 ° C virüsü AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1.5 x 10 ila 13 GC / ml) depolayın. Cerrahi öncesinde, dondurucu üzerinden hacimde çıkar ve th doldurmak için kullanılan kadar buz üzerinde saklayıne mikropipet. </li><li> Virüs, bir şırınga pompası kullanılarak mikropipet doldurun. Sıkıca takviye edilmiş bir pistonu olan bir cam şırıngaya, uygun uygun büyüklükte bir hortum sıkıştırma yoluyla hortumun bir parçasının bir ucunu. Montaj için uygun boyutta bir çıkarılabilir bir iğne sıkıştırma yoluyla boru parçasının diğer ucuna otoklavlanmış mikropipet takın. </li><li> Viral vektör yüklemeden önce, bir iğne ile 1 ml şırınga içinde Sudan Kırmızı IV (~ 1 mg / 50 mi) ile boyanmış, mineral yağ ile sistemin (27 g doldurarak boru, şırınga ve mikropipet de dahil olmak üzere pompa sisteminin hava kabarcıklarını çıkarmak ). </li><li> Cam mikropipet altında parafilm temiz bir parça yerleştirin ve 5 dağıtmak - parafilm üzerine viral vektörün 10 ul. </li><li> Geri 0.5 ml / dk&#39;da, enjektörün pistonu hareket ettirerek viral vektör Suck ve cam pipet ile ilgili vektör ve yağ arasındaki sınırı. </li></ol> 1.2) Anestezi, Saç Kesme, HKraniotomi için ead Tespit ve Hazırlık <ol><li> N2 O ve O 2, ve% 5 izofluran ile dolu odacık içine bir fare (P49-63, C57BL / 6) koyun. Maksatlı hareket kaybı ve yavaşlatılmış solunum hızı (- 90 / dk ~ 60) tarafından anestezi derinliğini değerlendirin. Fare anestezi sırasında kafasına saçlarını kesti. </li><li> Başını bir anestezi ve havalandırma sisteminin içine yerleştirilen künt kulak çubukları ve burun tarafından güvenli ile, stereotaktik çerçeve içinde fareyi takın. % 3 - 2 sürekli izofluran koruyun. Fareler anestezi altında göz kırpma refleksi kaybetmek beri her iki göze yapay gözyaşı merhem sürün. </li><li> Ağrı tedavisi için bir deri altından enjeksiyon ile Buprenorfin (0.1 mg / ml), 0.05 ml uygulayın. </li><li> % 10 povidon iyot ve% 70 alkol ile üç kez temiz bir cerrahi alan, iki çözümleri arasında değişen ve povidon iyot ile başlayan. Önden başlar ve herhangi bir önceden kesilmiş tüyleri çıkarmak için arkaya doğru silin. </li><li> Üst o bir cilt kesi yapmakgözler arasında başlar ve kulakları arasındaki biter kafa f. </li></ol> 1.3) Kraniyotomi ve Microinjections <ol><li> Bir pamuklu çubukla kaydırarak periost çıkarın ve sonra diş pamuk topları ile kafatası yüzeyini kurulayın. Enjeksiyon yeri çevresinde bir işareti yapmak, ve bir yüksek devirli tarafından desteklenmektedir küçük bir çelik çapak kullanarak işaretinin kenarına etrafında matkap. </li><li> Kemik çıkarın ve tuzlu su ile yüzeyi temizleyin. </li><li> Ön-arka 0,8, medial-lateral: şu koordinatlara (mm) striatumdaki yanal sol dorsal içine pipet yerleştirin 2,0, dorsal-ventral pial yüzeyinden: -2,4 13. Bu koordinatlar mikroenjeksiyon iğne ucu sadece biraz bu çekirdeğin içinde nüfuz anlamı sadece dorsolateral striatum (Şekil 1A, B) Yukarıda oturur anlamına unutmayın. Zararlı kan damarları kaçının. Pipet bir kan damarına doğru olması için olursa, hafifçe ayarlayın0.2 mm - 0.1 ile koordine eder. </li><li> 0.2 ml / dk&#39;da ayarlanmış enjeksiyon oranı ile enjeksiyon başlayın ve tipik olarak virüs 1-1,5 ul enjekte edilir. </li><li> 10 dakika boyunca, enjeksiyondan sonra yerinde pipet bırakın ve daha sonra yavaş yavaş pipet çıkarın. </li><li> Sürekli dikiş dış naylon sütür ile cerrahi yara kapatarak bitirin. </li></ol> 1.4) Kurtarma <ol><li> 24 saat için bir ısıtma pedi üzerine temiz bir kafes içinde fare koyun. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyatı geçirmiş fare iade etmeyin. Bu sternal yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar fare gözetimsiz bırakmayın. </li><li> Trimetoprim Sulfamethoxiazole ekleme, bir hafta boyunca su içinde (40 mg trimetoprim 200 mg sulfamethoxiazole ihtiva eden 500 ml su başına 5 mi). Ameliyat sonrası Buprenorfin kadar 3 gün boyunca günde iki kez uygulayın. </li><li> , A beslenen bir 12 saat ışık-karanlık döngüsü üzerinde fareyi korumak ve günlük sulanannd ameliyattan sonra 3 gün sonra günde başına düşen ağırlıklı. Bu 3 gün içinde,% 10&#39;dan daha fazla bir vücut ağırlığı kaybı ile herhangi bir fare tehlikeye, ve bunun yerine bir deneye tabi kalma ötenazi olacaktır olarak kabul edilir. </li><li> Ayrı, haftada iki kez fare kafes değiştirmek ve en az günde bir kez genel sağlık izlemek. Stereotaksik mikroenjeksiyon sonrası 3 hafta - Tipik olarak, fare 2 içinde kullanılır. </li></ol> Konfokal Ca 2+ Görüntüleme 2. Akut Beyin Dilim Hazırlık Kesme ve Kayıt Çözümleri 2.1) hazırlanması. <ol><li> (MM) ihtiva eden çözelti, kesme hazırlayın: 194 sukroz, 30 NaCl, 4.5 KCl, 10 D-glikoz, 1 MgCl2, 1.2 NaH 2 PO 4 ve% 95 O2 ve% 5 CO2 ile doymuş 26 NaHCO 3. </li><li> Içeren kayıt solüsyonu (mM olarak) hazırlayın: 124 NaCl, 4.5 KCl, 1 MgCl2, 10 D-glikoz, 2 CaCl2, 1.2 NaH 2 PO 4 </sub&gt; ve 26 NaHCO 3; pH 7,3-7,4, 290 -% 95 O2 ve% 5 CO2 ile doymuş 295 mOsm. Kayıt çözümü ile beyin dilim tutarak beher doldurun ve 34 ° C&#39;de tutmak. </li></ol> 2.2) Dilimleme <ol><li> İki üç hafta stereotaksik mikroenjeksiyon sonra, derin ve ölümcül fare uyutmak, ve sonra başını kesmek. </li><li> Beyin ayıklayın ve uninjected sağ yarımkürede kaldırmak için bir bıçak kullanın ve süper yapıştırıcı kullanarak Vibratome tepsiye bıraktı birini monte edin. Buz gibi soğuk kesim tamponu ile Vibratome tepsiyi doldurun, ve% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile doyurarak tutun. </li><li> 300 mikron kalınlığında koronal veya sagittal striyatal beyin dilimleri kesin. Genellikle, 4-5 koronal veya 6-7 sagital striyatal dilim alınabilir. </li><li> 34 ° C&#39;de ısıtıldı dilim tutarak behere dilimleri transferi ve daha sonra recordi oda sıcaklığında depolamadan önce, 30 dakika boyunca orada tutmakng. </li><li> [Ca2 +] görüntüleme önce en az 30 dakika oda sıcaklığında oksijenli bir kayıt tamponu içinde beyin dilimleri inkübe edin. </li></ol> 3. İmmünohistokimya (İHK) <ol><li> İki hafta virüsünün, enjeksiyondan sonra, transkardiyal PBS ile fare PBS içinde% 10 formalin ve ardından serpmek. </li><li> Kaldır gecede sonrası düzeltmek ve en az 2 gün tamponlu% 30 sakaroz beyin cryoprotect. </li><li> Bir kriyostat mikrotom kullanılarak 40 um bölümler hazırlayın. </li><li> 10 dakika aralıkla kesitler, PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> % 10 normal keçi serumu ile PBS içinde 1 saat süre ile ve% 0.5 Triton X-100 ile bölümleri inkübe edin. </li><li> % 0.5 Triton X-100 içeren PBS içinde hazırlanan primer antikor içinde 4 ° C&#39;de bir gece boyunca bölümleri inkübe edin. Bu kapsamda kullanılan primer antikorlar: tavuk anti-GFP, 1: 1000 fare anti-S100β 1: 400, fare anti-neun 1: 600, fare anti-glutamin sentetaz 1: 300 arasındadır. </li><li> 10 m bölümlerinin PBS ile 3 kez durulayınaralıklarla. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca,% 10 normal keçi serumu ile PBS içinde hazırlanan ikincil antikorlarla bölümleri inkübe edin. Aşağıdaki gibi, ikinci antikorlar: keçi anti-fare Alexa546 1: 500, keçi anti-tavuk Alexa488 1: 500. </li><li> Daha sonra yavaş yavaş, bir cam lamel bölümleri kapsayacak, kuru bir cam slaytlar üzerinde bölümleri monte ve antifade montaj orta birkaç damla uygulanır. 4 ° C&#39;de slaytlar saklayın. </li><li> 1.3 sayısal diyafram ile 40X yağ daldırma lens ile bir konfokal mikroskop görüntüleri almak. </li></ol> 4. Konfokal [Ca 2 +] i Görüntüleme NOT: [Ca 2+] i 0.8 sayısal diyafram ile 40X su daldırma objektif lens ile bir konfokal mikroskop kullanılarak yapıldı görüntülenmesi. <ol><li> 2 ml başına - sa 1 ila 5 kayıt bölümü içinde, bir yer dilim dilimleme ve 1 akış hızında oda sıcaklığında oksijenli bir kayıt tamponu superfuse sonraMin. Sonra deney sırasında hareketini en aza indirmek için dilimin üstüne naylon dizeleri ile bir platin arp yerleştirin. </li><li> Görselleştirmek ve 10X suya daldırma hedefi altında parlak bir alan luminesansın ile dorsal striatum bulun. </li><li> 40X suya daldırma objektif lens geçmek ve Argon lazer 488 nm hattı açın. Odak düzlemi değiştirerek, soma, şube ve ağızları bazal floresan görüntüleme, yaklaşık 20 mikron dilim yüzeyinin altında bulunan hücreleri bulmak. Notun tehlikeye hücreler genellikle kaçınılmalıdır ortalamanın üzerinde floresan seviyesi, gösterir. </li><li> Taramayı başlatmak için &#39;çerçeve tarama&#39; modunu kullanın. Genellikle, 0.5 ayarlanmış lazer yoğunluk - maksimum çıkış% 5 [Ca2 +] sito-GCaMP3 ile görüntü yeterlidir. Astositlerin bütün topraklarında [Ca 2 +] i dinamiklerini izlemek için, çerçeve ya da daha hızlı başına 1 sn tarama hızı ile &#39;Çerçeve Tarama&#39; recomme olduğunuNDED, ancak bu durum, sözkonusu deneye bağlı olarak karar verilmesi gereklidir. </li><li> Görüş tüm alanında 2 astrositler - 1 izlemek için 3 kat - Gerekirse, görüntü için [Ca 2 +] i süreçlerinde, 2 dijital büyütme kullanmak. </li><li> Kayıt sırasında doymuş piksel önlemek için, hücreleri PseudoColor için &#39;Hilo&#39; arama modunu kullanın. Her zaman kırmızı renk doygunluğu göstergesi olarak görünür olmadığını test etmek için, yaklaşık 5 dakika boyunca bir &quot;pilot kayıt&quot; ile başlar. Eğer öyleyse, lazer çıkış gücünü düşürecek, ya da PMT alt / Kazanç / ofset değerleri ve piksel değerleri olmayan doymuş aralıkta test etmek için bir başka pilot kayıt yapmak. - 5% (10 mW), PMT 550-650 Volt, Kazanç 2.0 - lazer gücü 0,5 3.5x ve ofset 0: Tipik haliyle, bir araya getirilen parametrelerin görüntüleme astrosit için kullanılan [Ca2 +] striatumda I aşağıdaki gibidir -% 5. </li></ol>

<ol>
	<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS.">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice.">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release.">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes.">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li><li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology:+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps.">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li><li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication.">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li><li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo.">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo.">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262 (2014).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li><li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus:+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li><li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li><li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington's+disease+model+mice.">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2/1,+rAAV2/2,+rAAV2/5,+and+rAAV2/8+transduction+in+the+rat.">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tarif edilen yöntemler, US yerinde daha sonra [Ca2 +] görüntüleme için in vivo striatal astrositlerde sito-GCaMP3 ifade etmek için izin vermektedir. Bu yöntem transgenik veya sağlam hedeflenen protein, hızlılık ifade ve deneysel uygulama ve anatomik özgüllük esnekliği dahil knock-fareler kullanılarak üzerinde avantajlara sahiptir. AAV2 / 5 ile GCaMP3 ekspresyonu spesifik ve güçlü olduğu bulundu. Serotip 5 AAV ile GFAP GfaABC 1 D ilerleticinin birleşimi, özgünlüğünü elde etmek için kritiktir. Burada tarif edilen tekniğin bir sınırlama virüs enfeksiyonu ve cerrahi prosedür, özellikle yüksek-titreli virüs 19, astrosit reaktiviteye sebep olmasıdır. Önemli bir şekilde, bu çalışmada, nispeten düşük bir titreye sahip, AAV2 / 5 microinjections astrosit reaktivitesi 19 ile ilişkilendirilmiştir GS azalmalara neden olmamıştır. Benzer kontrolleri Hipp bildirilmiştirocampal astrositler 8. Ancak, astrocytes heterojen 20 çünkü, ve büyük olasılıkla beynin farklı bölgelerinde farklı işlevleri yerine çünkü az değil, çalışılacak her bir beyin bölgesinden bu kontrollerin gerekliliğini vurgulamak önemlidir. Virüs: mikro-enjeksiyon ile hedef gen ekspresyonunun sağlamlığını etkileyebilecek önemli faktörlerden biri, farklı fare türüne ve hayvan gelişimi üzerinde değişiklikler arasında değişir kullanımda koordinatları vardır. Eski ~ 8 haftalık sadece C57BL / 6 fareleri bu inceleme boyunca kullanıldı. 4 hafta sonrası enjeksiyon, sonra 9 ay boyunca stabil kaldı enjeksiyon 21 sonrası - Ayrıca sıçanlarda striatal nöronlar ve astrositlerde GFP viral ifadesi, 4 gün sonrası enjeksiyon tespit 2 tarafından bir platoya ulaşmış olabileceğini gösterilmiştir. Cyto-GCaMP3 ifade zaman ders tam da burada tespit edilmemiştir, ancak virüs ifade için en az iki haftadırönerilir. Striatal astrositlerde GeCIS arasında AAV2 / 5 aracılı ifadesini kullanarak yaklaşımı şimdi daha iyi [Ca 2 +] i striatumunda sinyal astrocyte anlamak için kullanılabilir. Spesifik olarak, sito-GCaMP3 ifade seviyesi astrositlerin küçük popülasyonlarında [Ca2 +] sinyallerinin (~ 10 hücre) ve tek astrositlerin bütün bölgeleri içinde görüntüleme olanak sağlamak üzere yeterince yüksektir. [Ca 2+] i sinyallerin detaylı analiz halen devam etmektedir, ancak bugüne kadar [Ca 2 +] i sinyaller olarak uzak soma 50 um (Şekil 4) ~ olarak distal süreçlerden tespit edilmiştir. Astrosit [Ca 2 +] i sinyalleri ve striatum içindeki karşılıklı ve nedensel işlevleri hakkında ayrıntılı deneyler mümkün bulunmaktadır. Gelecekte, rafine yaklaşımlar (destekçiler yani) astrositlerde tanımlı genetik nüfusa GeCIS sağlamak için gerekli olan tek can, böyleceastrositlerde 20 farklı popülasyonları içinde kalsiyum sinyalizasyonu keşfetmek.

Astrositler beynin her yerde ve bol miktarda glial hücreler bulunmaktadır. İyi astrocytes hayati destek ve hücre dışı boşlukta K + konsantrasyon tamponlama, alımı nörotransmitterlerin sağlamanın yanı sıra besinlerin de dahil olmak üzere homeostatik rolleri hizmet ettiğini kurulmuştur. Ancak son çalışmalar onlar da kendiliğinden ortaya çıkar ve nöronal aktivitenin 1 artmıştır [Ca 2+] i sinyallerini görüntülemeye olduğunu göstermektedir. Astrosit varlığı [Ca 2 +] i sinyal giderek nöronlar ile iletişimi tetiklemek için düşünülmüş, ve gibi astrositlerden içinde &quot;Ca 2+ uyarılabilirliğinin&quot; bir formu olarak yorumlanmıştır. Son iki yılda mevcut veriler astrocytes ve nöronlar belki iki yönlü bir tarzda, iletişim kurabileceğini iki ayarları öneririz. İlk olarak, astrositlerin sıklıkla nörotransmiterler ve aktive [Ca2 +] artışa yanıtnöronlar 2 serbest nöromodülatörler. İkinci olarak, [Ca2 +] astrositler içine dahil artışlar da nöronlar ve kan damarlarını etkileyen astrositlerden sinyal molekülleri salınımına neden olur. Kanıt astrositlerden salınan moleküllerin astrosit-to-nöronun sinyalizasyonu ile sinaps, devreler ve sonuçta davranış 3-5 işlevlerinde değişikliklere yol açtığını göstermektedir. Ancak, bu hızla gelişmekte olan bir araştırma alanı kalır ve astrosit daha iyi ve ayrıntılı bir anlayış [Ca 2 +] i mevcut belirsizliklerin 6 bazı çözmek için gerekli olduğu ileri sürülmüştür. Geçmiş çalışmalarında, astrositlerde içine organik Ca 2+ gösterge boyaların toplu yükleme güvenilir algılamak için başarısız olduğu gösterilmiştir [Ca 2+] kültür ve yerinde 7-10 tüm astrositlerde içinde i sinyaller. Bu bulgular bize ve diğerleri 6,11,12 tarafından tartışılmıştır. Emerging resim [Ca 2 +] i nöronlar ve kan damarları ile etkileşimleri için birincil siteleri astrocyte süreçler (örneğin, şube ve ağızları), içinde sinyaller, nadiren ayrıntılı olarak incelenmiştir olmasıdır. Son zamanlarda, örneğin sitosolik GCaMP3, GCaMP5G ve GCaMP6 ve plazma zar olarak bulunan genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Geçiş) &#39;nin kullanımı, bağlı versiyonlar (örneğin Lck-GCaMP3) astrositlerin bu küçük bölümlerinde [Ca2 +] sinyalleri çalışma izin vermiştir gibi ince süreçler, plazma zarı yakın ve tüm toprakları 7,8 içinde. Bununla birlikte, Geçiş organik Ca 2 + göstergesi boyalar üzerinde bir dezavantajı vardır ve Geçiş uygun olarak ifade etmek için genetik yöntemler haftalık dönemler için in vivo olarak astrositleri seçici kodlayan genlerin sunmak için bu gerekliliktir. In vivo ifadesi tipik knock-fareler veya virüs bazlı teslimat uygulaması ile, transgenik fareler kullanılarak elde edilirHamam böcekleri. Mevcut jove makalede, adeno-bağlantılı virüsler kullanarak çizgili astrositlere Geçiş sunmak için kullanılan yöntem ve prosedürler rapor etmektedir. Biz örnek olarak cyto-GCaMP3 odaklanmak, ancak aynı temel prosedürü diğer Geci veya floresan protein bazlı muhabiri herhangi için çalışır.

<table><tbody><tr><td>Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette grinder</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>syringe needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5 virus</td><td>UPenn vector core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudan red IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>CVS Pharmacy</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Krazy&amp;reg;Glue</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Microslicer</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopes</td><td>Olympus</td><td>FV300 and FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>chicken anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-s100&amp;beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-glutamine synthetase</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-chicken-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Striatumda sito-GCaMP3 arasında astrosit spesifik ekspresyonu sağlamak için, daha önce, sağlam GCaMP3 ve raportör geni tahrik etmek için gösterilmiştir, adeno-bağlantılı virüs (AAV) 5 serotip ve GFAP GfaABC 1 D yükseltici (Şekil 1A), kullanılan hipokampal ve kortikal astrositlerde 8,14 anlatım. İki hafta fare striatumu içine, virüs mikroenjeksiyon sonra fare (~ 10 haftalık), perfüze edilmiş ve IHC striatum (Şekil 1B) sito-GCaMP3 ekspresyonunu değerlendirmek için, ince beyin bölümlerinde gerçekleştirilmiştir. Biz GFP antikorları kullanarak cyto-GCaMP3 tespit ve aynı zamanda bilinen bir astrocyte işaretleyici, S100β ile dilimleri lekeli. Sito-GCaMP3 ifadesi, sadece S100β pozitif hücrelerde bulunmuştur. Resim sentezleme astrosit özel dışavurumunu göstermektedir, neuN (Şekil 2A ve 2B) ile görselleştirilmiştir nöronlarda bulunmuştur. Önemli olarak, sito-GCaMP3 sentezleme ~ S100β pozitif hücrelerin% 60, (Fi saptandıGüre gösterir 2C). Astrositler hafif şiddetli 15 potansiyel değişikliklerin bir spektrumunu temsil astrocyte reaktivitesi olarak bilinir hale gelmiş değişiklikler göstererek bu yaralanma, iskemi ve enfeksiyon gibi beyin hakarete cevap. Biz virüs mikroenjeksiyon açık astrocyte reaktivitesi olduysam değerlendirmek için aradı. Daha önce, glutamin sentetaz (GS) düşük ekspresyon düzeyi reaktif astrositler 16,17 ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, WT ve virüs enjekte edilen farelerin striatum GS sentezleme karşılaştırılmıştır. Metrik olarak GS seviyelerini kullanarak hiçbir açık astrocyte reaktivite gösteren, - Biz virüs enjeksiyonundan (C Şekil 3A) aşağıdaki striatal astrositlerde GS ifadede anlamlı bir değişiklik bulunamadı. Bu genel yaklaşım reaktivitesi diğer işaretlerini kullanarak astrocyte reaktivite değerlendirilmesi gelecekteki çalışmalarında genişletilmiş olabilir. Ancak, GFAP düzeyleri striat reaktivitesi ölçmek için uygun bir yol olmayabilir unutmayınal Astrositler, GFAP bazal koşullarda 18 altında en striyatal astrositlerde saptanabilir seviyelerde ifade edilir çünkü. Özetle, IHC ile, biz sito-GCaMP3 sentezleme striatumda astrositlere güçlü ve spesifik olduğu sonucuna, ve GS sentezleme seviyesi değişim ile değerlendirilen virüsten enjeksiyon astrosit reaktiviteye sebep yoktu. Önümüzdeki striatal astrositlerde [Ca2 +] Görüntünün virüs enjekte edilen farelerde akut beyin dilimleri hazırlandı. Akut 300 mikron kalınlığında bir sagital ve koronal kesitler hazırlandı ve bir iyileşme süresinden sonra, dilimler [Ca2 +], bir argon lazer 488 nm hattı kullanarak görüntülenmesi için bir konfokal mikroskop, bir kayıt bölümü içine yerleştirilmiştir. (Açıkça çalı morfolojiye sahip hücrelerde de görünür yeşil floresan gösterdi, Şekil 4 - sito-GCaMP3 sentezleyen striatal astrositler kolayca striatal dilimleri (sıçan başına 7 dilimleri 6 ~) (genellikle tümü) çoğunda tespit edilebilir </stronG&gt;). Temsili bir alandan 1 Hz, kayıt tipik bir 5 dakika Şekil 4A&#39;da gösterilmektedir; cyto-GCaMP3 göstererek en az 10 astrocytes görüntülü olabilir ve İlgi (ROI) Bölgeler Şekil 4A çizilmiştir. 2.0 ek bir dijital zoom ile yüksek büyütme görüntüleme - 3.0 Tek astrositler (Şekil 4B) tanımlamak için gerekli oldu. Şekil 4B&#39;de gösterildiği gibi, bu durumda, bütün astrosit bölgeler, sito-GCaMP3 ekspresyonu ile açığa çıkarılmıştır. Spontan Ca 2 + sinyalleri kolayca somata hem de dalları ve astrositler 6 ağızları ölçüldü. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/51972/51972fig1highres.jpg" /> Şekil 1: yetişkin fare striatumu içine AAV2&#39;nin / 5 ile GeCIS Viral teslim (örn cyto-GCaMP3). A. şematik Dorsolateral striatuma AAV2 / 5 mikroenjeksiyon için protokolü göstermektedir.B. striatum göre mikroenjeksiyon iğne ve stereotaksik enjeksiyonu için kullanılan koordinat yaklaşık konumunu gösterir. Panel B bir Nissl-lekeli dilim görüntü ALLEN BEYİN ATLAS indirildi. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/51972/51972fig2highres.jpg" /> Şekil 2: Cytoplasma GCaMP3 ifade striatal astrositlere özgü oldu. . A - sito-GCaMP3 sentezleme ancak gösterilenler gibi ko deneyler için bir nöronların belirteci (NeuN) (A), C Özet çubuk grafik ile, astrositler için bir marker (S100β) (B) colocalizes gösteren B. Örnek çizimin A ve B. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/51972/51972fig3highres.jpg" /> Şekil 3: striyatal astrositlerde içinde Cytoplasma GCaMP3 ifade GS ifadesinde değişikliğe sebep olmamıştır.A - GCaMP3 için AAV2 / 5 almış farelerden GCaMP3 ve GS IHC B. Örnek görüntüler. Kontrol dışı enjekte edılen fareler için görüntüleri de gösterilmiştir. C&#39;de bar grafiktir A ve B gibi deneylerin sonuçları özetlemektedir (ns bir Student t-testi, p &lt;0.05 ile anlamlı olmadığını gösterir). <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/51972/51972fig4highres.jpg" /> Şekil 4: sito-GCaMP3 olan striatal astrositlerden kaydedildi [Ca2 +] sinyalleri temsil eden örnekler. A. A (1 numaralı - 10) 10 astrositler gösteren z-yığın düzleştirilmiş görüntü .The göstermek aşağıda izleri [Ca 2 +] i sinyaller basık A ve B A&#39;da gösterilen 10 hücrelerden 5 dakika boyunca kaydedildi ve yakınlaştırılmış z. Tek bir astrocyte.The için -stack görüntü göstermek aşağıda izleri [Ca 2+] isinyalleri B&#39;de gösterilen tek bir hücre için 5 dakika boyunca kaydedildi.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators at JoVE.com

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Görüntüleme hücre içi Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.8K Görüntüleme.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 

Video: Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Biyoloji

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Nörobilim

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

Genetik Olarak Kodlanmış Ca2+ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca2+ Alımı Görüntüleme

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Farelerin dentat gyrus hücrelerinde nöron aktivitesi için gerçek zamanlı görüntüleme 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal activity in awake animals during behavior tasks. Since the hippocampus is closely associated with episodic and spatial memory, it has become an essential brain region in&#160;this field&#39;s research. In recent research, engram cells and place cells were studied by recording the neural activities in the hippocampal CA1 region using the miniature microscope in mice while performing behavioral tasks including open-field and linear track. Although the dentate gyrus is another important region in the hippocampus, it has rarely been studied with in vivo imaging due to its greater depth and difficulty for imaging. In this protocol, we present in detail a calcium imaging process, including how to inject the virus, implant a GRIN (Gradient-index) lens, and attach a base plate for imaging the dentate gyrus of the hippocampus. We further describe how to preprocess the calcium imaging data using MATLAB. Additionally, studies of other deep brain regions that require imaging may benefit from this method.

Yazar Spotlight: Dentate Gyrus Granül Hücrelerinin Nöral Aktivitesinin Minyatür Mikroskop ile İncelenmesi

The dentate gyrus of the hippocampus carries out essential and distinct functions in learning and memory. This protocol describes a set of robust and efficient procedures for in vivo calcium imaging of granule cells in the dentate gyrus in freely moving mice.

Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

Görüntüleme hücre içi Ca

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler