Avrupa Araştırma Konseyi (FP7/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 ve SFB889) fon kabul.

Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri Alman hayvan refahı için kurallar uyarınca gerçekleştirilmiştir.
Not: Zaman çizelgesi ve protokol ana adımları şekil 1' de gösterilmiştir.
1. hazırlıkları
<ol><li>
Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
	<ol>
<li>DMEM + poligonal MD astrocytes kültür için hazırlamak: % 10 FCS, 100 U penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile DMEM.</li>
		<li>NB + H Yildiz Seklinde astrocytes kültür için hazırlamak: 5 ng/mL HBEGF, 1 x B-27 ek, 1 x glutamin takviyesi, 100 U penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile neurobasal orta. Not: HBEGF daha yüksek konsantrasyonlarda Aliquots hazırlanan ve gerektiğinde Orta olarak eklenecek-20 ° C'de depolanan.</li>
		<li>Diseksiyon orta (10 mM HBSS HEPES) hazırlayın.</li>
		<li>Aliquots 6-7 ml % 0.05 tripsin-EDTA ve 6-7 mL % 0.25 tripsin-EDTA 15 mL tüpler hazır olun. Bunlar-20 ° C'de depolanan ve bir 37 ° C su Banyosunda çözdürülen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İletişim kuralı, başlamadan önce gün 10 cm doku kültürü tedavi bulaşıkta %0,04 polyethylenimine (PEI) her 5 mL kat.</li>
	<li>Ertesi gün, PEI kaldırmak ve iki kez deiyonize, distile su ile bulaşık. DMEM + 12 mL her plakasına ekleyin ve hücreleri kaplama daha önce 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka için en az 30 dk önceden equilibrate.</li>
	<li>Diseksiyon alan hazırlamak: bir laminar akış diseksiyon başlık, yer iki 10 cm Petri yemekler diseksiyon orta buz dolu. Her beyin alanını için izole (örneğin, korteks, Hipokampus), 15-tüp 14 mL diseksiyon orta ile dolu hazırlamak ve buz üzerinde tutun. Diseksiyon araçları (iyi makas, Dumont #3 ve #5 forseps) % 70 etanol ve yere karar diseksiyon mikroskop kapüşonlu ile sprey.</li>
</ol>2. fare veya fare beyin diseksiyon
Not: Her iki fareler ve sıçanlar-ebilmek var olmak kullanılmış. P8-da var olmak kullanılmış daha yaşlı hayvanlar (biz P12 kadar test), ama meninkslerde kaldırma giderek daha zor olacak. Beyin hücreleri büyük hayvanlardan karmaşık işlemler ve doku ayrılma, artan hücre ölümüne giden sırasında kırılabilir bağlantıları kurdu beri Ayrıca, hücre verim ve sağlık, azalacak. Kortikal hazırlıkları burada açıklanan, ancak diğer beyin bölgeleri de kullanılabilir.
<ol><li>% 0.05 tripsin-EDTA bir 37 ° C su banyosunda yerleştirin.</li>
	<li>Hayvanlar (gebe rats E19 pups veya P0-P8 hayvanlar için) yavaş yavaş CO2 konsantrasyonu yükselterek ötenazi ve beyin yalıtır. Aşağıdaki adımları steril tekniği gerektirir.</li>
	<li>
Eğer embriyonik dokuyla çalışma, önce embriyoların rahim kaldırın ve embriyonik keseleri açın sonra hemen kafalarını makasla kesme. Tüm başkanları kesilir, onları önceden soğutulmuş diseksiyon orta aktarın.
	<ol>
<li>Bir kez belgili tanımlık mezartaşı ortamda batık, forseps ve beyincik kapalı çimdik cilt ve kafatası (her ikisi de çok genç hayvanlarda yumuşak) açın. Dikkatle kolu yukarı ve dışarı kafatası beyin geri kalanı. Not: 2-4 E19 embriyo kortikal astrocytes çanak başına 500.000 hücre, diseksiyon gününde kaplama, en az sekiz 10 cm yemekler için yeterince doku verim.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eski veya yeni doğan yavruları için kafalarını makasla kesmek ve hemen cilt kafasının arkasından düz bir çizgi burnun ucu için kesim tarafından beyin yalıtır. Kafatasının sol ve sağ, sonra kafatası kemik Asansör bir kenara ve dikkatle kesilmiş deri çek. Beyincik kesme ve yukarı ve dışarı kafatası beyin diğer kol. Not: 2-3 P0-P8 pups kortikal astrocytes çanak başına 500.000 hücre, diseksiyon gününde kaplama, en az sekiz 10 cm yemekler için yeterince doku verim.</li>
	<li>Korteks temel orta yapısından ayrı. Forseps hemisferlerin arasında boyuna çatlak içinde yer sonra hareket forseps bir Yarımküre (boyuna çatlak dikey) korteks ve orta yapıları arasında her hemisphere ücretsiz çimdik için.</li>
	<li>Forseps kullanarak her hemisphere (ve onun Hipokampus) tüm meninkslerde çıkarın, sonra hippocampi ayrı. Hipokampal astrocytes gerekiyorsa, her Hipokampus 14 mL diseksiyon orta buz dolu bir 15 mL tüp içine taşıyın.</li>
	<li>Özel bölgeler gerekli (örneğin, frontal korteks) daha fazla alanlarda her hemisphere'nın korteks kaldırın. 1 mm3daha büyük parçalara astrocytes oluşturmak için kullanılacak kortikal herhangi bir doku kes. Diseksiyon orta buz dolu ayrı bir 15 mL tüp kortikal doku tüm parçaları toplamak.</li>
</ol>3. doku sindirim ve ayrılma
<ol><li>Bir kez tüm doku parçaları toplanır, tüp altına yerleşmek bekleyip sonra mümkün olduğu kadar orta Aspire edin.</li>
	<li>2-3 mL % 0.05 tripsin-EDTA serolojik pipet kullanarak ekleyin ve 20 dakika 37 ° C su banyosu tüplerde kuluçkaya. Not: tüm tripsin-EDTA hızla doku parçaları karıştırın ve tekrar yerleşmek için izin vermek için pipet üzerinden yayın.</li>
	<li>Dikkatle tripsin-EDTA, tüpün dibinde mümkün olduğunca küçük sıvı olarak doku parçalar halinde bırakarak Aspire edin.</li>
	<li>Kalan tripsin EDTA yıkamak için önceden soğutulmuş diseksiyon orta 5 mL ekleyin. Üst kısmındaki doku parçaları karıştırma ulaşmak için tüp tarafına pipet.</li>
	<li>Diseksiyon orta Aspire edin ve doku parçalar halinde mümkün olduğunca küçük sıvı olarak bırakın. Önceden soğutulmuş diseksiyon orta iki kez daha fazla ile bu çamaşır tekrarlayın.</li>
	<li>Son yıkama adımdan sonra istimal DMEM + (oda sıcaklığına kadar ısındı) 1.000 µL pipet ucu ve triturate pipetting tarafından doku ve kabarcıklar tanıtımı olmadan aşağı 1 mL ekleyin. Not: bu-ebilmek değişmek belgili tanımlık eriyik, hangi astrocytes oldukça duyarlı olan pH gibi bu kabarcıklar, üreten önlemek önemlidir.</li>
	<li>50 mL tüp açılış 100 µm hücre süzgeç koyun ve önceden soğutulmuş DMEM + 4.5 mL filtresiyle önceden ıslak.</li>
	<li>Disosiye doku süspansiyon hücre süzgeç üzerine 1 mL pipette ve başka bir 4.5 mL ekleyin önceden soğutmalı hücreleri hücre süzgeç aracılığıyla yıkamak için + DMEM.</li>
</ol>4. hücre kaplama Passaging tarafından Astrocyte zenginleştirme için
<ol><li>Örneğin, hücreleri hücre süspansiyon 10 µL trypan mavi ile 10 µL sulandrarak ve karışımı bir hemasitometre üzerine pipetting saymak.</li>
	<li>12 mL DMEM + 10 cm çanak başına 500.000 hücrelerde plaka. Not: DMEM + astrositik büyüme için yararlıdır nöronlar veya microglia için daha çok. Sallayarak sırasında cam coverslips kuyu içinde hareket eden fiziksel güçleri çok bu 10 cm yemekleri (coverslips) olmadan oyunculuk daha güçlü. Hücreleri 24-şey Tabaklarda sarsıldı, onlar sağlıksız hale veya ölmek. Sadece plaka astrocytes sallayarak sonra 24-şey plakaları.</li>
	<li>Hücre kültürleri da kuluçka makinesine 37 ° C ve % 5 CO2 ' de yedi gün boyunca tutun.</li>
	<li>Gün 6, adım 5'te açıklandığı gibi kültür PEI kaplı plakalar gün sallayarak ve hücreleri, passaging önce hazırlayın.</li>
</ol>5. passaging hücreleri
<ol><li>
Bir gün önce passaging, hücre kültürü plakaları %0,04 PEI ile kat.
	<ol>
<li>İmmunocytochemistry, viral iletim veya plazmid transfection (her bir steril 12 mm veya 25 mm cam coverslip, sırasıyla içeren) 24-şey veya 6-şey tabak kullanın.</li>
		<li>Cam coverslips % 70 etanol en az 1 h için kuluçka tarafından sterilize etmek, sonra üç kere coverslips wells yerleştirmeden önce deiyonize, distile suda yıkayın.</li>
		<li>En az 70 µL %0,04 PEI başına 24-şey tabak 12 mm coverslip ve 600 µL %0,04 PEI 25 mm coverslip 6-şey tabak içinde başına ekleyin.</li>
		<li>Western blot ya da RNA-Seq analiz için zaten sonra diseksiyon hücreleri içeren 10 cm yemekleri kullanmaya devam edebilirsiniz. Yemekleri sadece sarsılmış gerekir, sonra hücreleri 1 x PBS ile yıkanmış ve NB + H ile tedavi (yeni yemekleri aktarmak).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gün vitro (DIV) 7 sonra diseksiyon, 10 cm yemekleri hücreleri ile DMEM + bir laboratuvar shaker kuluçka üzerine yerleştirin ve yemekleri 6 h için 110 rpm'de sallamak.</li>
	<li>PEI deiyonize, distile su ile kaplı coverslips üzerinden kapalı iki kez yıkayın. NB + H orta plakaları (24-şey plakaları için ve iyi 6-şey plakaları için başına 2 mL başına 500 µL) ekleyin. Plakayı kuluçka 37 ° C ve 10 cm yemekleri titriyor iken % 5 CO2 veya en az 30 dk önceden equilibrate.</li>
	<li>20-30 dk 6 h sallayarak sona ermeden önceden 1 x PBS, DMEM +, NB + H ve % 0.25 tripsin-EDTA 37 ° c su banyosunda ısıtın.</li>
	<li>6 h sallayarak, kültür yemekleri shaker almak ve (içeren nöronlar sarsılmış kapalı, oligodendrocytes ve microglia) orta ile 10 mL yerini alması sonra çanak başına 1 x PBS önceden ısıttı. Not: Hemen yeniden bağlama astrositik olmayan hücreleri önlemek için ayrılmış hücreleri içeren eski orta Aspire edin önemlidir.</li>
	<li>PBS kaldırın ve 3 mL Önceden ısıtılmış tripsin-EDTA çanak başına ekleyin. Her yemeğin 4 dk. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçka için kuluçkaya. Not: Western blot veya RNA-Seq için numune hazırlama, tripsin-EDTA ekleyerek değil. Bunun yerine, eski yerine koymak PBS 12 mL ile NB + H, sonra da kuluçka makinesine kültürler yerleştirilebilir önceden ısındı.</li>
	<li>5 Önceden ısıtılmış DMEM + 3 mL tripsin-EDTA her için çanak, hücreleri 5 mL serolojik pipet kullanarak çanak dışına pipette ve hücre süspansiyon 50 mL tüp içinde toplamak mL ekleyin. Not: Pipet çanak - altından doğrudan kat yemeğin hücreleri ayırmak gibi daha net hale gelmelidir. Serum tripsin inaktive gibi sadece serum içeren orta (yerine DMEM +), kullanın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 3,220 x g 4 dk 20 ° C'de, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve resuspend hücre Pelet 1 ml NB + H önceden ısıttı.</li>
</ol>6. hücre kaplama son Astrocyte kültürler için
<ol><li>Hücreleri saymak.</li>
	<li>6-iyi tabak (ortamda 2 mL NB + H iyi başına) bir kuyu başına 20.000 hücre veya 24-şey tabak (ortamda 500 µL NB + H iyi başına) bir kuyu başına 5000 hücre plaka.</li>
	<li>Hücre kültürleri da kuluçka makinesine 37 ° C ve % 5 CO2 de daha ileri tedavi veya analiz kadar tutun.</li>
	<li>Yarım orta haftada bir değişimi. Not: Düşük besin ortamlarda Proliferasyona astrocytes durmak ama her ne kadar (deneyim, yok microglia AWESAM kültürde ortaya çıktı) kalan herhangi bir microglia çoğalırlar. Yarım orta bir kez bir hafta herhangi bir potansiyel olarak kalan microglia8zenginleştirme engeller ve monocultures en az üç hafta boyunca sağlıklı kalmak alışverişi.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade.">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li><li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+in+astroglial+cultures:+a+cautionary+note.">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).</li><li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage.">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55 (2), 165-177 (2007).</li><li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Protokol içinde dört adım kritik: 1) konsantrasyonu küçük artışlar olgunlaşmamış kültürler için örneğin, neden olabilir beri tam 5 ng/ml, HBEGF konsantrasyon hazırlanıyor 10 ng/mL HBEGF astrocytes4; de-ayırt 2) doku veya pH değiştirebilir ve astrocyte sağlık engel hücreleri içeren çözümler kaçınmak kabarcıkları; 3) en uygun pH ve sıcaklık sağlıklı astrocytes büyüyen için elde etmek için ortam sıcaklığına önceden; 4) (hiçbir microglia bulundu, ancak AWESAM kültürlerde defa) sadece yarısı orta haftada bir kez kalan herhangi bir microglia olduğu için daha az yeterli besin varsa ve orta, çoğalırlar olasılığı alışverişi8 düzenli olarak değiştirdim. Bu son nokta için astrocyte kaynaklı faktörler kültür içinde tamamen kaldırılması gerektiğini değil, astrositik hayatta kalma, farklılaşma ve yaygın desteklemiyor olabilir gibi unutmamak önemlidir.
DIV14 veya eski kültürler olgun astrocyte kaynağı olarak kullanılması önemlidir (ancak iletim veya transfection adımlar için önceki kültürler kullanılabilir) astrocytes DIV14 küçük, hala sinir kök hücre potansiyel9var çünkü. Viral iletim için kültürler nöronlar ve DIV7 üzerinde transduced astrocytes karışık GFP10transduced (adeno ilişkili virüs virally verimli bir şekilde ifade kullanarak). Plazmid transfection için DIV10-DIV24 astrocytes sık sık kullanılan ve proteinler fluorophore öğesini görüntüsü 2-5 gün sonra11. Astrocytes DIV9 ve DIV14 arasında transduced Eğer deneyim, viral iletim ve plazmid transfection en iyi çalışır. Transfection ve iletim verimliliği yapı ve yöntemi üzerinde bağlıdır, ama biz transfection verimliliği % ~ 20 içinde lipofectamine transfection kullanarak astrocyte monocultures ve adeno ilişkili virüs (AAV) iletim verimliliği olduğunu ~ %90 () bulmak daha fazla bilgi, örneğin, kullanılır yapısı için önceki bizim iş4 bkz.). AAV parçacıklar ve lipofectamine tarafından transfecting ile astrocytes transducing, biz en az 5 ve 2 gün, sırasıyla, inşa ifade için izin. İletim veya transfection önce astrocytes da passaging sonra en az bir gün için kurtarmak için izin verilmelidir.
Ayrıca, kültür farklı zamanda RNA/protein ifadesi karşılaştırmak için hazırlanıyor geldiğinde, malzeme, örneğin, DIV7 hasat için astrocyte monocultures benzer miktarda elde etmek için farklı yoğunlukları, kültürleri kaplama ve DIV21 olabilir 1 x 106 ve 10 cm çanak, başına 500.000 hücre yoğunlukları, sırasıyla kaplama. Örneğin, tüm protein lysate verim 0,5 mg/mL üzerinde ne zaman başlangıçta bir 10 cm çanak üzerinde 500.000 AWESAM astrocytes kaplama sonra hasat DIV14 civarında olacak.
AWESAM Protokolü temsil eden bir hızlı, basit ve ucuz yol kültür astrocytes izolasyon nöronlar ama içinde vivo-RNA ve protein ifade, morfoloji ve4, sinyal verme Ca2 + özellikleri hangi tarihlerde hangi şimdiye kadar hiçbir diğer iletişim kuralı tarafından sağlanır. AWESAM astrocytes immunocytochemistry, immunoblotting, RNA ifade analizi, TIRF mikroskobu ve Ca2 + görüntüleme4de dahil olmak üzere hücre kültür çalışmalar için tipiktir analizleri için kullanılabilir. Özellikle, genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri son gelişmeler daha ayrıntılı klasik Ca2 + boya14daha iyi astrositik işlemlerin görüntülenmesi için izin verir. CA2 + sinyal, veziküler alımı ve kalın ve ince astrositik süreçlerde ekzositozu fizyolojik ilgili, bu işlemler açısından trofik destek, kan akımı, sinaptik sinyal ve plastisite, beyin fonksiyonları etkileyebilecek gibi ve hücreler arası iletişim. AWESAM Protokolü iyi astrositik işlemler çalışma için beyin fizyolojisi15 ve hastalık16,17, nöronal müdahale olmadan ve büyük erişilebilirlik ile ilgili o içinde vitro sağlar Kültür malzemeleri.

Astrocytes trofik desteği, kan akımı, sinaptik sinyal ve plastisite ve hücreler arası iletişim - tüm bunların etrafında ince astrositik süreçleri Merkezi mekanizmalar aracılığıyla beyin fonksiyonlarını etkiler. Burada açıklanan AWESAM Protokolü nöronlar ve yararlı örneğin, birçok protein ve hatta Ca2 + sinyal ifadesi farklı beyin hücre boyunca örtüşme olan diğer glia müdahale olmadan bu süreçlerin çalışma sağlar türleri. Ayrıca, bu yöntem daha önce kullanılan tekniklerin sınırlamalar üstesinden gelir. Özellikle, vivo içindebizim iletişim kuralı sağlar-Morfoloji (Yildiz Seklinde astrocytes ince süreçleri ile) ve bir hızlı, kolay, gen ekspresyonu ve ucuz şekilde gibi.
Doğrudan hücre morfolojisi, gen ekspresyonu ve birçok diğer düzenleyici işlemler çevre tarafından etkilenmiştir. Bir kültür tabak içinde bu faktörler tarafından çevreleyen hücreleri, aynı zamanda hangi hücreleri yetiştirilmektedir orta serbest ifade eder. Astrocytes, HBEGF bir Yildiz Seklinde Morfoloji1 ikna etmek için daha önce bildirildi ancak aynı zamanda astrocytes2de-ayırt etmek için bulunamadı. Ancak, düşük konsantrasyonlarda HBEGF, daha sonra daha fazla vivo içindeoluşturmak için kullanılmıştır-RNA sıralama iki farklı protokol3,4ile tanımlandığı gibi hangi tarihlerde astrocytes. Ayrıca, bağımsız olarak protokolü4orta bileşimi ile astrocyte Morfoloji değiştirir: Neurobasal orta HBEGF bir düşük konsantrasyon ile diğer Orta besteleri (örneğin, süre Yildiz Seklinde astrocytes yetiştirmek için en uygun Serum DMEM içeren) poligonal hücrelerde (hatta astrocytes taze immunopanning tarafından izole) üretmek.
AWESAM Protokolü dezavantajları astrocyte monocultures4büyüyen için önceki teknikleri üstesinden gelir. Astrocyte monocultures büyüyen için önceki teknikleri var aşağıdaki dezavantajları: Yildiz Seklinde astrocytes vivo içinde (MD yöntemi)5/; alışılmadık poligonal Morfoloji uzunluk ve maliyet (astrocytes İndüklenmiş pluripotent kök hücreler alır üzerinden üç ay hazırlık ve pahalı büyüme faktörleri de dahil olmak üzere birçok reaktifler gerektirir) Protokolü'nün6; malzeme (immunopanning yöntemi)3düşük miktarda; ve astrocytes de-farklılaşma ve gereksinimi 3D matris (Puschmann ve ark.) 1 , 2. buna ek olarak, AWESAM Protokolü sağlar: vivo-tarihlerde Morfoloji (ince süreçleri ile Yildiz Seklinde astrocytes); hızlı, kolay ve ucuz yöntemi; malzeme büyük miktarlarda; ve en vivo içinde-gen ekspresyonu immunopanned ve MD astrocytes ile karşılaştırıldığında hangi tarihlerde. Ayrıca, Ca2 + sinyal ve vezikül ince işlemler ve olaylar membran yakın geri dönüşüm çalışması için 2D kültür sağlar (örneğin, TIRF mikroskobu 3D kültürlerde mümkün değildir).
MD yöntemi yayımı 19805poligonal astrocyte monocultures teknik bir basit ve hızlı sunan, beri yaygın olarak kullanılmış. Kısacası, MD yöntemi (FCS) fetal buzağı Serumda büyüyen karışık beyin hücreleri üzerine kuruludur-DMEM, içeren takip (olarak diğer tüm beyin hücresi türleri çanak ayırmak) için astrocytes zenginleştirmek ve daha fazla kültür aynı ortamda basamaklarının sallayarak. FCS ile desteklenmiş DMEM farklı kanser hücre satırlarına tüm bunların MD astrocytes kültür tarafından sergilenen poligonal Morfoloji paylaşmak, fibroblastlar ve adiposit arasında değişen birçok hücre tipleri için kullanılır. Kadar erken 2000'lerde7, küçük düşünce olmuştu astrocytes için uygun bir ortama verilen, özellikle onların tipik Yildiz Seklinde Morfoloji lehine içinde vivobuldu. 2011 yılında yayınlanan bir protokol ulaşmak böyle Yildiz Seklinde Morfoloji: immunopanning yöntemi olarak adlandırılan, serum-Alerjik orta astrocytes3kültür için en iyi duruma getirilmiş kullanır. Bu yöntemi kullanarak, taze izole beyin hücreleri bir dizi hücre türüne özgü hücre yüzey proteinleri astrocytes için zenginleştirmek için hedef antikorlar ile kaplı yemekleri sunulur. Daha fazla vivo içinderağmen-immunopanned astrocytes morfoloji ve ifade profil gibi vitro çalışmalar çoğunluğu hala MD astrocyte yönteme güvenmek. İmmunopanning yöntemi daha karmaşık ve zaman alıcı adımlar kültür ilk gününde kapsar MD yöntemi basit ve hızlı, iken (uzun enzim sindirim süre gibi çözümleri farklı yoğunluk, immunopanning kendisi, dikkatli katmanlama ve çeşitli aralıklarla adımlar - kaplama tüm önce). Ancak, daha özel orta kullanarak, AWESAM yöntemi her iki hızını MD yöntemi ve in vivosunar-tarihlerde immunopanning Protokolü morfolojisi.
Genel olarak, AWESAM Protokolü daha fazla vivo içindeçalışmak için yararlıdır-tarihlerde astrocytes 2D monocultures neurons ve diğer glia (immunostainings, immunoblots ve RNA sıralama tarafından daha önce karakterize4 ) olarak izole içinde. Bu ince astrositik işlemler çalışma için izin verir ve spontan Ca2 + sinyal ve olaylar (tarafından TIRF mikroskobu görüntüsüörneğin,) membran yakın görüntülenmesi için büyük erişilebilirlik sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td style="width:167px;">warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBEGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:344px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laboratory shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Rotamax 120&#160;</td>
			<td>use inside cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

AWESAM (bir low- easy stellate birstrocyte malınan mal) protokolü üzerine kuruludur vivo içindebüyük miktarlarda üretmek için hızlı, basit ve ucuz bir yol-fare ve sıçan astrocyte monocultures hangi tarihlerde : Beyin hücreleri farklı beyin bölgelerden izole olabilir ve hücre kültürü bir hafta sonra astrositik olmayan hücreleri bir shaker kuluçka 6 h için Tarih kültür yemekleri yerleştirerek sarsılmış. Kalan astrocytes sonra yeni kalıplara (NB + H olarak adlandırılan) bir astrocyte özgü orta ile pasajlı. NB + H heparin bağlama EGF benzeri büyüme faktörü (HBEGF), serum orta yerine kullanılan düşük konsantrasyonlarda içerir. NB + H içinde büyüyen sonra AWESAM astrocytes Yildiz Seklinde bir morfoloji ve özellik iyi işlemler var. Dahası, bu astrocytes daha fazla vivo içindevar-tarihlerde gen ekspresyonu daha önceden yayınlanmış yöntemlerle üretilen astrocytes. CA2 + görüntüleme, vezikül dinamikleri ve diğer olaylar membran yakın böylece iyi astrositik süreçleri vitroiçinde canlı hücre confocal veya TIRF mikroskobu kullanarak örneğin, okudu olabilir. Özellikle, AWESAM astrocytes da astrocytes içinde vivoiçin benzer sinyal spontan Ca2 + sergi.

Nöronlar ile birlikte kültürlü ve NB + ortamda yetiştirilen astrocytes 2 hafta sonra kültür (Şekil 2) Yildiz Seklinde görünür. NB + orta ek olarak, ortak kültür astrocytes de büyük olasılıkla onların hayatta kalma ve Morfoloji katkıda bilinmeyen nöron kaynaklı faktörler maruz kalır. Buna ek olarak, MD astrocytes DMEM + (diğer hücre tipleri geçiş önce kapalı sallayarak sonra) monocultures yetiştirilen 2 hafta sonra poligonal görünür. AWESAM astrocytes sallayarak sonra NB + H içinde yetiştirilen kültür 2 hafta sonra çok iyi işlemlerle Yildiz Seklinde görünür.
Biz daha önce RNA ifade profil AWESAM astrocytes, MD ve immunopanned astrocytes4' e göre astrocytes vivo içinde'e daha yakın olduğunu gösterdi. Astrocyte özel protein ifade açısından, kortikal astrocytes ALDH1L1 düzeyi yüksek ve düşük seviyelerde GFAP'nin vivo içinde12ifade eder. Bu da AWESAM astrocytes için geçerlidir ve sitoplazmik bir enzim olarak ALDH1L1 immunostaining hücre iskeleti protein GFAP'nin (Resim 2B) daha ince detay ortaya koymaktadır.
RNA ve protein ifade kenara astrocytes vivo gösterir (örneğin, dış stimülasyon olmadan) sinyal spontan Ca2 + ama poligonal MD astrocytes vitro kez Ca2 + temin için stimülasyon gerektiren sinyal verme, örneğin, ATP veya Glutamat ekleyerek. AWESAM astrocytes in vivo, hücre organları ve virally hücre membran hedefli Lck-GCaMP3 (şekil 3) ile transducing tarafından görüntülenmiştir iyi süreçler, sinyal spontan Ca2 + sergi. Ca2 + bitişik astrocytes boyunca kendiliğinden dalgaları da (şekil 3A) oluşur. İyi süreçler ve microdomains (şekil 3B) sinyal astrositik Ca2 + ücretsiz astrocytes13için belirli kullanılarak analiz edilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56092/56092fig1.jpg"> Resim 1 : İletişim kuralı zaman çizelgesi. DIV0 üzerinde aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için gereken zaman da dahil olmak üzere AWESAM protokolünün ana adımları gösteren bir zaman çizelgesi (kandan gün), DIV7 (gün geçiş) ve ne daha sonra zaman noktalarda sunuyoruz. Nerede hafif karşı hücreleri Yildiz Seklinde astrocytes hasat edilebilir yeşil kutunun gösterilmiştir koyu tonları sırasıyla karşı daha karmaşık Yildiz Seklinde morfoloji ve vade ise, daha az temsil eder. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56092/56092fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56092/56092fig2v3.jpg"> Resim 2 : Orta belirler Morfoloji. (A)şematik nasıl astrocyte Morfoloji değişir gösterilen vs monocultures olarak yetiştirilen ve orta bağlı (yukarıda açıklanan4) olarak nöronlar ile birlikte kültürlü. Astrocyte özel GFAP'nin ana hatları ile Yildiz Seklinde Morfoloji boyama co kültürlü ve AWESAM astrocytes ve poligonal Morfoloji MD astrocytes içinde. (B) GFAP'nin etiketleri MD astrocytes daha güçlü ALDH1L1 ve ALDH1L1 (ama değil GFAP'nin) AWESAM astrocytes iyi süreçleri özetliyor. Ben de astrocyte Monokültür nöronal işaretçiyi MAP2 sergiler. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56092/56092fig2v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56092/56092fig3.jpg"> Şekil 3 : Astrocytes içinde sinyal spontan Ca2 + . (A) GCaMP transduced AWESAM astrocytes sergi spontan Ca2 + olaylar boyunca ince süreçlerinde (ok uçları) dahil olmak üzere astrocyte ağlar. Bir Ca2 + dalga birkaç astrocytes soldan sağa doğru seyahat görüntüler farklı zaman noktalarından, nerede açık renk gösteriyor yüksek Ca2 + konsantrasyonları alanlarında ve siyah alanları temsil eden hücre dışı bölgeler. Görüntüleri canlı hücre confocal mikroskobu kullanılarak elde. (B) Ca2 + konsantrasyonları (a) renk kodlu bölgelerde nasıl yayılır dalga sinyali bir Ca2 + arasında birkaç astrocytes göstermek GCaMP floresan yoğunluğu izleri olarak gösterilen saat içinde değiştirin. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56092/56092fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol at JoVE.com

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Burada açıklanan AWESAM iletişim kuralı diğer beyin hücreleri izolasyonu fare astrocytes bir hızlı, basit ve ucuz şekilde kültür için en iyi yöntemdir. AWESAM astrocytes spontan Ca2 + sinyal, morfoloji ve gen ifade profilleri için astrocytes vivo içindebenzer sergi.

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

culturing-vivo-like-murine-astrocytes-using-fast-simple-inexpensive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

8.3K Görüntüleme.  University of Oxford. Burada açıklanan AWESAM iletişim kuralı diğer beyin hücreleri izolasyonu fare astrocytes bir hızlı, basit ve ucuz şekilde kültür için en iyi yöntemdir. AWESAM astrocytes spontan Ca2 + sinyal, morfoloji ve gen ifade profilleri için astrocytes vivo içindebenzer sergi.

Video: Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Nörobilim

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Fareler Soğuk Hassasiyeti ve Uyum belirlenmesi için Basit ve ucuz Yöntem

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Kullanımı Ödül arayan davranış değişiklikleri Tedbir Basit Yolu<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

An Emerging Target Paradigm to Evoke Fast Visuomotor Responses on Human Upper Limb Muscles

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, and size are processed and integrated within numerous brain areas, then ultimately relayed to the motor periphery. In some instances, a reaction is needed as fast as possible. These fast visuomotor transformations, and their underlying neurological substrates, are poorly understood in humans as they have lacked a reliable biomarker. Stimulus-locked responses (SLRs) are short latency (&#60;100 ms) bursts of electromyographic (EMG) activity representing the first wave of muscle recruitment influenced by visual stimulus presentation. SLRs provide a quantifiable output of rapid visuomotor transformations, but SLRs have not been consistently observed in all subjects in past studies. Here we describe a new, behavioral paradigm featuring the sudden emergence of a moving target below an obstacle that consistently evokes robust SLRs. Human participants generated visually guided reaches toward or away from the emerging target using a robotic manipulandum while surface electrodes recorded EMG activity from the pectoralis major muscle. In comparison to previous studies that investigated SLRs using static stimuli, the SLRs evoked with this emerging target paradigm were larger, evolved earlier, and were present in all participants. Reach reaction times (RTs) were also expedited in the emerging target paradigm. This paradigm affords numerous opportunities for modification that could permit systematic study of the impact of various sensory, cognitive, and motor manipulations on fast visuomotor responses. Overall, our results demonstrate that an emerging target paradigm is capable of consistently and robustly evoking activity within a fast visuomotor system.

Presented here is a behavioral paradigm that elicits robust fast visuomotor responses on human upper limb muscles during visually guided reaches.

İnsan Üst Ekstremite Kaslarında Hızlı Visuomotor Tepkiler uyandırmak için Yükselen Bir Hedef Paradigma

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely impacts the study of cell type specific contributions to disease. Moreover, animal models usually do not reflect variability in mutations and disease courses seen in human patients. Reprogramming methods for generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized patient specific research and created valuable tools for studying disease mechanisms. However, iPSC technology has disadvantages such as time, labor commitment, clonal selectivity and loss of epigenetic markers. Recent modifications of these methods allow more direct generation of cell lineages or specific cell types, bypassing clonal isolation or a pluripotent stem cell state. We have developed a rapid direct conversion method to generate induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs) from skin fibroblasts utilizing retroviral vectors in combination with neuralizing media. The iNPCs can be differentiated into neurons (iNs) oligodendrocytes (iOs) and astrocytes (iAs). iAs production facilitates rapid drug and disease mechanism testing as differentiation from iNPCs only takes 5 days. Moreover, iAs are easy to work with and are generated in pure populations at large numbers. We developed a highly reproducible co-culture assay using mouse GFP+ neurons and patient derived iAs to evaluate potential therapeutic strategies for numerous neurological and neurodegenerative disorders. Importantly, the iA assays are scalable to 384-well format facilitating the evaluation of multiple small molecules in one plate. This approach allows simultaneous therapeutic evaluation of multiple patient cell lines with diverse genetic background. Easy production and storage of iAs and capacity to screen multiple compounds in one assay renders this methodology adaptable for personalized medicine.

We describe a protocol to reprogram human skin-derived fibroblasts into induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs), and their subsequent differentiation into induced Astrocytes (iAs). This method leads to fast and reproducible generation of iNPCs and iAs in large quantities.

Fibroblastlardan Nöronal Progenitör Hücrelere Doğrudan Dönüşüm ve Astrositlere Farklılaşma Kullanarak Nörolojik Hastalıklar için İn vitro Modelleme

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

Genetik Olarak Kodlanmış Ca2+ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca2+ Alımı Görüntüleme

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...