Der Großteil der Arbeit und die beteiligten Mitarbeiter wurden von NIH Zuschusses NS060677 und teilweise durch NIH gewährt MH099559 und MH104069 (BSK) unterstützt. Ein Teil der Arbeit wurde auch von der CHDI Foundation unterstützt.

Alle Tier Protokolle waren in Übereinstimmung mit den US National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der UCLA genehmigt. 1.1) Bereiten Mikropipette und AAV2 / 5 Virus Loading <ol><li> Verwenden Fein Borsilikatglas-Mikropipetten für die Injektion des Virus. Ziehen die Mikropipette unter Verwendung eines zweistufigen Zieh Programm mit einer vertikalen Magnet. Kegel die Pipette in einem Winkel von 40 ° unter Verwendung einer Pipette Mühle. Die Pipette, die ideal für den Einsatz ist wird einen Spitzendurchmesser von 20 bis 40 um und eine Schaftlänge von 6 - 7 mm. Autoklavieren der Pipette und chirurgische Instrumente. Der Bohrer wird durch Abwischen mit 70% Ethanol sterilisiert. </li><li> Speichern des Virus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), bei -80 ° C in 10 &amp; mgr; l Aliquots. Kurz vor der Operation, nehmen Sie die Aliquots aus dem Gefrierfach und Lagerung auf Eis, bis zum Füllen th verwendete-Mikropipette. </li><li> Füllen Sie die Mikropipette mit Virus mit einer Spritzenpumpe. Dicht verbinden Sie ein Ende eines Rohrstück, durch einen entsprechend dimensionierten Rohr Klemmverschraubung, auf eine Glasspritze mit einem verstärkten Kolben. Befestigen Sie die autoklaviert Mikropipette mit dem anderen Ende des Rohrstück durch einen entsprechend dimensionierten abnehmbare Nadelklemmfitting. </li><li> Vor dem Beladen des viralen Vektor, entfernen Luftblasen aus dem Pumpsystem einschließlich Schlauch, Spritze und Mikropipette durch Befüllen des Systems mit Mineralöl mit Sudanrot IV (~ 1 mg / 50 ml) in einer 1-ml-Spritze mit einer Nadel gefärbt (27 G ). </li><li> Ein sauberes Stück Parafilm unter der Glas-Mikropipette, und Abgeben von 5 bis 10 &amp; mgr; l der Virusvektors auf die Parafilm. </li><li> Saugen den viralen Vektor, der durch Bewegen des Kolbens der Spritze nach hinten in 0.5 &amp; mgr; l / min, und markieren die Grenze zwischen dem Vektor und dem Öl auf der Glaspipette. </li></ol> 1.2) Anästhesie, Haarschneide, Head Fixierung und Vorbereitung zur Kraniotomie <ol><li> Eine Maus (P49-63, C57BL / 6) in die Kammer mit N 2 O und O 2 und 5% Isofluran gefüllt. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch den Verlust der zielBewegung und einer verlangsamte Atemfrequenz (~ 60-90 / min). Schneiden Sie Haare auf dem Kopf, wenn die Maus betäubt. </li><li> Setzen Sie die Maus in die stereotaktischen Rahmen, mit seinem Kopf durch stumpfe Ohr Bars und seine Nase in eine Anästhesie- und Beatmungssystem platziert gesichert. Pflegen kontinuierliche Isofluran bei 2 - 3%. Künstliche Tränen Salbe auf beiden Augen, da Mäuse verlieren ihre Lidschlussreflexes unter Narkose. </li><li> Verwalten 0,05 ml Buprenorphin (0,1 mg / ml) durch subkutane Injektion zur Schmerzlinderung. </li><li> Sauberen Operationsbereich mit 10% Povidon-Jod und 70% Alkohol dreimal abwechselnd zwischen den beiden Lösungen besteht und mit Povidon-Iod. Starten Sie von vorne und wischen nach hinten, um alle bereits geschnittenen Haare zu entfernen. </li><li> Machen Sie eine Hautschnitt an der Spitze of der Kopf, der zwischen den Augen beginnt und endet zwischen den Ohren. </li></ol> 1.3) Kraniotomie und Mikroinjektionen <ol><li> Entfernen Sie die Knochenhaut durch Streichen mit einem Wattestäbchen und dann trocknen Sie die Oberfläche des Schädels mit Zahnwattebällchen. Machen Sie eine Markierung an der Injektionsstelle, und bohren um den Rand der Marke mit einem kleinen Stahl Grat angetrieben von einem High-Speed-Bohrer. </li><li> Entfernen Sie die Knochen und reinigen Sie die Oberfläche mit Kochsalzlösung. </li><li> Platzieren Sie die Pipette in die linke Rücken seitlich mit den folgenden Koordinaten (mm) Striatum: anterior-posterioren 0,8, medial-lateral: 2,0, dorsal-ventrale vom Pia-Oberfläche: -2,4 13. Beachten Sie, dass diese Koordinaten bedeutet, dass die Spitze der Mikroinjektionsnadel sitzt direkt über dem dorsolateralen Striatum (1A, B), was bedeutet, dass er nur geringfügig innerhalb dieses Kerns eindringt. Vermeiden schädlicher Blutgefäße. Wenn die Pipette passiert zu sein Recht auf ein Blutgefäß, leicht einzustellen dasKoordinaten von ~ 0.1 - 0.2 mm. </li><li> Starten Einspritzung mit Einspritzrate bei 0,2 ml / min eingestellt, und in der Regel zu injizieren 1 bis 1,5 &amp; mgr; l-Virus. </li><li> Verlassen Sie die Pipette anstelle nach der Injektion für 10 Minuten, und dann langsam zurückziehen der Pipette. </li><li> Beenden Sie durch Schließen der Operationswunde mit fortlaufenden Naht externen Nylonnaht. </li></ol> 1.4) Wiederherstellung <ol><li> Setzen Sie die Maus in einem sauberen Käfig auf einem Heizkissen für 24 Stunden. Sie eine Maus, die Operation, um der Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. Lassen Sie die Maus unbeaufsichtigt, bis es ausreichend das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. </li><li> In Trimethoprim Sulfamethoxiazole (5 ml pro 500 ml Wasser, das 40 mg Trimethoprim und 200 mg sulfamethoxiazole) im Wasser für eine Woche. Verwaltung Buprenorphin zweimal pro Tag für bis zu 3 Tage nach der Operation. </li><li> Pflegen Sie die Maus auf einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus, gefüttert und täglich bewässert, einnd wird einmal pro Tag bis zu 3 Tage nach der Operation gewichtet. In diesen 3 Tagen wird jede Maus mit einem Verlust von mehr als 10% Körpergewicht gelten als gefährdet und werden anstatt an Versuchen unterworfen eingeschläfert werden. </li><li> Getrennt, ändern Sie die Maus Käfig zweimal pro Woche, und mindestens einmal pro Tag zu überwachen für die allgemeine Gesundheit. 3 Wochen nach der stereotaktischen Mikroinjektionen - Typischerweise wird die Maus innerhalb von 2 verwendet. </li></ol> 2. akuten Hirnschnittpräparat für die konfokale Ca 2+ Imaging 2.1) Herstellung von Schnitt- und Recording Solutions. <ol><li> Vorbereitung Schneid Lösung aus (mM): 194 Sucrose, 30 NaCl, 4.5 KCl, 10 D-Glucose, 1 MgCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 und 26 NaHCO 3, mit 95% O 2 und 5% CO 2 gesättigt. </li><li> Vorbereitung Aufzeichnungslösung, umfassend (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl 2, 10 D-Glucose, 2 CaCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 </sub&gt; und 26 NaHCO 3; pH 7,3 bis 7,4, 290 bis 295 mOsm, mit 95% O 2 und 5% CO 2 gesättigt. Füllen Sie den Hirnschnitt hält Becher mit Aufzeichnungslösung, und halten Sie sie bei 34 ° C. </li></ol> 2.2) Slicing <ol><li> Zwei bis drei Wochen nach der stereotaktischen Mikroinjektionen, tief und unheilbar betäuben die Maus und dann enthaupten es. </li><li> Extrahieren Sie das Gehirn, und verwenden Sie ein Messer, um die injizierten rechten Hemisphäre zu entfernen, und montieren Sie die linke auf die Vibratom Tablett mit Superkleber. Füllen Sie den Vibratom Tablett mit eiskaltem Schneid Puffer und halten sättigt sie mit 95% O 2 und 5% CO 2. </li><li> Schneiden koronaler oder sagittaler striatalen Hirnschnitten bei 300 &amp; mgr; m Dicke. Normalerweise 4-5 koronalen oder 6 - 7 können sagittale striatalen Scheiben gesammelt werden. </li><li> Übertragen Sie die Scheiben auf die Scheibe Holdingbecher erwärmt bei 34 ° C, und es halten sie für 30 Minuten vor dem Ablegen bei Raumtemperatur für nachfolgende recording. </li><li> Inkubieren der Hirnschnitten in oxygenierten Aufzeichnungspuffer bei Raumtemperatur für mindestens 30 min vor der [Ca 2+] i-Bildgebung. </li></ol> 3. Immunhistochemie (IHC) <ol><li> Zwei Wochen nach Virusinjektion, perfuse die Maus transkardial mit PBS, gefolgt von 10% Formalin in PBS. </li><li> Entfernen, post-fix über Nacht, und cryoprotect das Gehirn in gepufferten 30% Saccharose für mindestens 2 Tage. </li><li> Bereiten Sie 40 um Abschnitte mit einem Kryostat-Mikrotom. </li><li> Spülen Sie den Abschnitten 3 mal mit PBS bei 10 min-Intervall. </li><li> Abschnitte Inkubation für 1 h in PBS mit 10% normalem Ziegenserum und 0,5% Triton X-100. </li><li> Abschnitte über Nacht Inkubation bei 4 ° C in primären Antikörpers in PBS mit 0,5% Triton X-100 hergestellt. Die primären Antikörper verwendet wurden, waren wie folgt: Huhn anti-GFP 1: 1.000, Maus anti-S100β 1: 400, Maus-anti-NeuN 1: 600, Maus-Anti-Glutamin-Synthetase 1: 300. </li><li> Spülen Sie den Abschnitten 3 mal mit PBS auf 10 min Intervallen. </li><li> Inkubieren Abschnitte mit den sekundären Antikörpern in PBS mit 10% normalem Ziegenserum für 2 Stunden bei Raumtemperatur hergestellt. Der zweite Antikörper waren wie folgt: Ziege anti-Maus Alexa546 1: 500, Ziege-Anti-Huhn Alexa488 1: 500. </li><li> Montieren Sie die Teile auf Glasobjektträger, trocken und mehrere Tropfen Antifade Eindeckmediums, dann langsam decken die Schnitte mit einem Deckglas. Lagern Sie die Folien bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Bilder auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,3. </li></ol> 4. Die konfokale [Ca 2+] i Imaging HINWEIS: [Ca 2 +] i-Bildgebung erfolgte mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x Wasserimmersionsobjektivlinse mit einer numerischen Apertur von 0,8. <ol><li> Zwischen 1 und 5 Stunden nach dem Schneiden, Ort Scheibe im Aufnahmeraum und superfuse mit sauerstoffAufzeichnungsPuffer bei Raumtemperatur mit Durchflussrate von 1-2 ml proMinute Dann legen Sie eine Platin Harfe mit Nylonsaiten auf der Oberseite der Scheibe, um die Bewegung während des Experiments zu minimieren. </li><li> Visualisieren und suchen Sie das dorsale Striatum mit Hellfeld Lumineszenz unter einem 10X Wasserimmersionsobjektiv. </li><li> Wechseln Sie auf die 40X Wasserimmersionsobjektiv Objektiv, und schalten Sie den 488-nm-Linie des Argon-Laser. Durch die Veränderung der Brennebene, finden Zellen etwa 20 &amp; mgr; m unterhalb der Scheibenoberfläche befindet, zeigt basale Fluoreszenz in Soma, Niederlassungen und Zweigstellen. Zu beachten ist, kompromittiert Zellen zeigen meist Fluoreszenzniveau über dem Durchschnitt, die vermieden werden sollten. </li><li> Verwenden Sie Modus &#39;Bildabtastintervalle&#39;, um das Scannen zu starten. Üblicherweise wird die Laserintensität auf 0,5 eingestellt - 5% des maximalen Ausgangs ausreicht, um Bild [Ca 2+] i mit Zyto-GCaMP3. Zur Überwachung [Ca 2+] i Dynamik im gesamten Gebiet der Astrozyten ist die &quot;Rahmenscan &#39;mit einer Abtastrate von 1 Sekunde pro Frame oder schneller EMPFEHLUNDED, aber das muss je nach Experiment in Frage entschieden werden. </li><li> Wenn nötig, um die Bild [Ca 2+] i in Prozessen verwenden digitale Vergrößerung von 2 - 3 fach zu überwachen 1-2 Astrozyten im gesamten Sichtfeld. </li><li> Zu gesättigten Pixel bei einer Aufnahme zu vermeiden, verwenden Lookup-Modus &quot;Hilo&quot;, um die Zellen Pseudocolor. Immer mit einem &quot;Pilot Aufnahme&quot; für ca. 5 min zu starten, um zu testen, ob rote Farbe erscheint als Hinweis auf Sättigung. Wenn dem so ist, senken Sie die Laserausgangsleistung, oder senken Sie die PMT / Gain / Offset-Werte und führen Sie eine weitere Pilotaufzeichnung zu testen die Pixelwerte im nicht gesättigten Bereich. Typischerweise für die Bildgebung Astrozyten verwendet die kombinierten Parameter [Ca 2+] i im Striatum sind wie folgt: Laserausgangsleistung von 0,5 bis 5% (von 10 mW), PMT 550-650 Volt, Gewinn 2,0 - 3.5X und Offset 0 - 5%. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebenen Verfahren haben uns erlaubt, Zyto-GCaMP3 in striatalen Astrozyten in vivo für die anschließende [Ca 2+] i-Bildgebung in situ auszudrücken. Dieses Verfahren hat Vorteile gegenüber der Verwendung von transgenen oder Knockout-Mäusen, wie robust der Expression des Zielproteins, Geschwindigkeit und Flexibilität der experimentellen Durchführung und anatomischen Besonderheiten. Der Ausdruck GCaMP3 mit AAV2 / 5 wurde als spezifisch und robust. Die Kombination von GFAP GfaABC 1 D-Promotor mit der AAV-Serotyp 5 ist kritisch, um die Spezifität zu erzielen. Eine Einschränkung des hier beschriebenen Verfahrens ist, dass Virusinfektion und Chirurgie Verfahren kann Astrozyten Reaktivität führen, insbesondere mit hohem Titer Viren 19. Wichtig ist, dass in der aktuellen Studie, AAV2 / 5 Mikroinjektionen mit einer relativen niedrigem Titer nicht verursacht Abnahme der GS, die mit Astrozyten Reaktivität 19 in Verbindung gebracht wurden. Ähnliche Kontrollen für hipp gemeldetocampal Astrozyten 8. Jedoch ist es wichtig, die Notwendigkeit dieser Regler für jeden Gehirnbereich zu unterstreichen, nicht zuletzt wegen Astrozyten sind heterogene 20, und weil sie wahrscheinlich unterschiedliche Funktionen in unterschiedlichen Regionen des Gehirns. Einer der wichtigen Faktoren, die die Robustheit des Zielgen-Expression unter Verwendung der Mikroinjektion Virus beeinflusst, ist die Koordinaten im Einsatz, die unter den verschiedenen Mausstämmen und verändert sich über die Entwicklung der Tiere variiert. Nur C57BL / 6-Mäuse von ~ 8 Wochen wurden in dieser Studie verwendet. Es wurde auch gezeigt, dass die virale Expression von GFP in striatalen Neuronen und Astrozyten der Ratte nachgewiesen werden 4 Tage nach der Injektion erreichte ein Plateau von 2 - 4 Wochen nach der Injektion, und blieb dann für 9 Monate stabil nach der Injektion 21. Der zeitliche Verlauf der Zyto-GCaMP3 Ausdruck wurde nicht gerade hier bestimmt, sondern mindestens zwei Wochen für Virus-Expressions sindempfohlen. Der Ansatz der Verwendung von AAV2 / 5-vermittelten Expression von GeCIS in striatalen Astrozyten können nun verwendet werden, um besser zu verstehen, Astrozyten [Ca 2+] i Signalisierung im Striatum werden. Insbesondere ist Zyto-GCaMP3 Expressionsniveau ausreichend hoch, um Bildgebung von [Ca2 +] i-Signale in kleinen Populationen von Astrozyten (~ 10 Zellen) und innerhalb der gesamten Gebiete der einzelnen Astrozyten zu ermöglichen. Die detaillierte Analyse der [Ca 2+] i-Signale noch nicht abgeschlossen, doch bisher [Ca 2+] i Signale von distal Prozesse soweit ~ 50 &amp; mgr; m entfernt von der Soma (4) erfasst wurde. Ausführliche Experimente an Astrozyten [Ca 2+] i-Signale und deren korrelative und verursachenden Funktionen im Striatum sind denkbar. In der Zukunft, raffinierte Ansätze (dh Promotoren) sind notwendig, um GeCIS genetisch definierten Populationen von Astrozyten zu liefern, so dass manerkunden Calcium-Signalgebung in verschiedenen Bevölkerungsgruppen von Astrozyten 20.

Astrozyten sind allgegenwärtig und reichlich Gliazellen des Gehirns. Es ist gut bekannt, dass Astrozyten dienen wichtige Unterstützung und homöostatischen Rollen einschließlich Pufferung der K + -Konzentration in den extrazellulären Raum, Aufnahme von Neurotransmittern sowie Bereitstellung von Nährstoffen. Neuere Studien zeigen jedoch, dass sie [Ca 2+] i-Signale, die spontan auftreten und werden durch neuronale Aktivität 1 erhöht zeigen auch. Die Existenz von Astrocyten [Ca 2+] i-Signalisierung wurde immer angenommen, dass die Kommunikation mit den Neuronen auslösen, und hat als solche als eine Form von &quot;Ca 2+ Erregbarkeit&quot; in Astrozyten interpretiert. Die verfügbaren Daten über die letzten zwei Jahrzehnte deuten zwei Einstellungen in dem Astrozyten und Neuronen kommunizieren kann, vielleicht in einer bidirektionalen Art und Weise. Ersten, Astrozyten reagieren häufig mit einer Zunahme der [Ca 2+] i, wenn sie von Neurotransmittern und AktivNeuromodulatoren von Neuronen 2 veröffentlicht. Zweitens [Ca 2+] i steigt innerhalb Astrozyten bewirken die Freisetzung von Signalmolekülen aus Astrozyten, die wiederum Nervenzellen und Blutgefäße beeinflussen. Hinweise darauf, dass Moleküle aus Astrozyten Freigabe über Astrozyten-to-Neuron Signalisierungs Änderungen in den Funktionen der Synapsen, Schaltungen und schließlich 3-5 Verhalten führen. Allerdings bleibt diese eine sich schnell entwickelnde Forschungsgebiet, und es wurde argumentiert, dass eine bessere und detailliertes Verständnis der Astrozyten [Ca 2+] i wird benötigt, um einige der derzeitigen Unsicherheiten 6 lösen. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass das Laden von mehreren organischen Ca 2+ Indikatorfarbstoffe in Astrozyten nicht zuverlässig zu erfassen [Ca 2+] i-Signale innerhalb gesamte Astrozyten in der Kultur und in situ 7-10. Diese Ergebnisse wurden von uns und anderen 6,11,12 diskutiert. Die Emerging Bild ist, dass [Ca 2+] i-Signale innerhalb Astrozyten Verfahren (zum Beispiel, Zweige und Ästchen), die die primären Standorte für Interaktionen mit Neuronen und Blutgefäße sind, haben nur selten im Detail erforscht. Vor kurzem hat die Anwendung genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren (GeCIS) wie zytosolischen GCaMP3, GCaMP5G und GCaMP6 und Plasmamembran tethered Versionen (zB Lck-GCaMP3) hat das Studium der [Ca2 +] i-Signale in kleine Fächer von Astrozyten wie erlaubt so dünn Prozesse, in der Nähe der Plasmamembran und im gesamten Hoheitsgebiet zu 7,8. Allerdings GeCIS einen Nachteil gegenüber organischen Ca 2+ Indikatorfarbstoffe und das ist die Voraussetzung für genetische Methoden, um die kodierenden Gene selektiv Astrozyten in vivo für Zeiträume von Wochen zu liefern für die GeCIS angemessen sein ausgedrückt. Expression in vivo wird typischerweise unter Verwendung von transgenen Mäusen erreicht, knock-in Mäuse oder mit Virus basierte Auslieferung AppKakerlaken. In der vorliegenden JoVE Artikel berichten wir Methoden und Verfahren eingesetzt, um GeCIS zu striatalen Astrozyten mit Adeno-assoziierten Viren liefern. Wir konzentrieren uns auf Cyto-GCaMP3 als ein Beispiel, aber die gleichen grundlegenden Verfahren funktioniert für jede andere GECI oder fluoreszierendes Protein basierten Reporter.

<table><tbody><tr><td>Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette grinder</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>syringe needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5 virus</td><td>UPenn vector core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudan red IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>CVS Pharmacy</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Krazy&amp;reg;Glue</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Microslicer</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopes</td><td>Olympus</td><td>FV300 and FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>chicken anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-s100&amp;beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-glutamine synthetase</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-chicken-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Für Astrozyten spezifische Expression von Cyto-GCaMP3 im Striatum, verwendeten wir Adeno-assoziierten Virus (AAV) des Serotyp 5 und die GFAP GfaABC 1 D-Promotors (1A), die zuvor gezeigt wurde, robuste und GCaMP3 Reportergen fahren Expression in hippokampalen und kortikalen Astrozyten 8,14. Zwei Wochen nach der Virusmikroinjektion in die Maus-Striatum wurde die Maus (~ 10 Wochen alt) perfundiert und IHC auf dünnen Hirnschnitten durchgeführt, um Cyto-GCaMP3 Expression im Striatum (1B) zu bewerten. Wir haben festgestellt Zyto-GCaMP3 mit GFP Antikörper und auch gefärbt die Scheiben mit einer bekannten Astrozyten Marker, S100β. Cyto-GCaMP3 Expression wurde nur in S100β positiven Zellen gefunden. Keine Expression wurde in Neuronen mit NeuN (2A und 2B) visualisiert gefunden, was darauf hindeutet, Astrozyten spezifische Expression. Wichtig ist, dass Zyto-GCaMP3 Ausdruck in ~ 60% der S100β positiven Zellen (Fi erkanntAbbildung 2C). Astrozyten antworten Gehirn Beleidigungen wie Verletzungen, Ischämie und Infektion durch die Anzeige ändert, die sich als Astrozyten Reaktivität, die ein Spektrum von möglichen Änderungen von leichten bis schweren 15 stellt gekannt haben. Wir versuchten zu beurteilen, ob Virus Mikroinjektion verursacht offenkundige Astrozyten Reaktivität. Es wurde zuvor gezeigt, dass eine reduzierte Expression von Glutamin-Synthetase (GS) mit den reaktiven Astrozyten 16,17 verbunden. Daher wurde GS-Expression im Striatum von WT und Viren injizierten Mäusen verglichen. Wir fanden keine signifikanten Veränderungen in der GS-Expression in striatalen Astrozyten folgenden Virusinjektion (3A - C), was keinen offenkundigen Astrozyten Reaktivität mit GS Ebenen als Metrik. Dieser allgemeine Ansatz könnte in der künftigen Arbeit mit anderen Markern der Reaktivität erweitert Astrozyten Reaktivität zu bewerten. Beachten Sie jedoch, dass GFAP Ebenen kann kein geeigneter Weg, um Reaktivität in striat messenal Astrozyten, weil GFAP nicht in nachweisbaren Mengen in den meisten striatalen Astrozyten unter basalen Bedingungen 18 ausgedrückt. Zusammenfassend mithilfe IHC wir schließen Zyto-GCaMP3 Ausdruck war robust und speziell für Astrozyten im Striatum, und das Virusinjektion nicht verursacht Astrozyten Reaktivität wie GS Änderungen Expressionsniveau beurteilt. Wir nächsten vorbereitet akuten Hirnschnitten von Virus injizierten Mäusen zu Bild [Ca 2+] i in striatalen Astrozyten. Akuter 300 um dicke sagittale oder koronale Schnitte wurden hergestellt, und nach einer Erholungsphase wurden die Schnitte in einer Aufzeichnungskammer auf einem konfokalen Mikroskop für [Ca 2+] i Abbilden unter Verwendung der 488 nm-Linie eines Argon-Lasers angeordnet. Wie sie zeigten sichtbare grüne Fluoreszenz in Zellen, die mit deutlich buschige Morphologie (Abbildung 4 - striatalen Astrozyten Cyto-GCaMP3 exprimieren konnte leicht in den meisten (normalerweise alle) der striatalen Scheiben (slices 7 pro Maus ~ 6) identifiziert werden, </strong&gt;). Ein typischer 5 min Aufzeichnung bei 1 Hz von einem repräsentativen Bereich ist in 4A gezeigt ist; mindestens 10 Astrozyten Anzeige Zyto-GCaMP3 konnte abgebildet werden und sind in Abbildung 4A als Regions of Interest (ROI) aufgetragen. Stärkere Vergrößerung Bildgebung mit einer zusätzlichen digitalen Zoom von 2,0 - 3,0 war notwendig, um Einzel Astrozyten (4B) zu identifizieren. Unter diesen Umständen wurden ganze Astrozyten Territorien Zyto-GCaMP3 Expression zeigte, wie in 4B gezeigt. Spontane Ca 2+ Signale wurden einfach in den Somata sowie in den Niederlassungen und Zweigstellen von Astrozyten 6 gemessen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51972/51972fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Viral Lieferung GeCIS (zB Zyto-GCaMP3) von AAV2 / 5 in den erwachsenen Maus Striatum. A. Schematische zeigt das Protokoll für AAV2 / 5 Mikroinjektionen in den dorsolateralen Striatum.B. zeigt die ungefähre Position der Mikroinjektionsnadel in Bezug auf das Striatum und den für die stereotaktische Injektionen verwendet Koordinaten. Das Bild einer Nissl-gefärbte Scheibe in Panel B wurde von ALLEN BRAIN ATLAS heruntergeladen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51972/51972fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: Cyto-GCaMP3 Ausdruck war spezifisch für striatalen Astrozyten. A - B. Repräsentative Bilder zeigen, dass Zyto-GCaMP3 Expression kolokalisiert mit einem Marker für Astrozyten (S100β) (B), aber nicht mit einem Marker für Neuronen (NeuN) (A) C. Zusammenfassung Bargraph für Kolokalisationsexperimenten wie sie gezeigt. in A und B. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/51972/51972fig3highres.jpg" /> Figur 3: Cyto-GCaMP3 Expression innerhalb striatalen Astrozyten keine Änderungen in der Expression von GS verursachen.A - B. Repräsentative Bilder der GCaMP3 und GS IHC von Mäusen, die AAV2 / 5 für GCaMP3 erhalten hatte. Images für die Steuerung nicht injizierten Mäusen werden auch gezeigt. C. Bargraph fasst Ergebnisse von Experimenten, wie die in A und B (ns zeigt nicht signifikant mit einem ungepaarten Student t-Test, p &lt;0,05). <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/51972/51972fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: Repräsentative Beispiele von [Ca2 +] i-Signale von striatalen Astrozyten mit Zyto-GCaMP3 aufgezeichnet. Z-Stapel-Bild zeigt 10 Astrozyten (nummeriert von 1 bis 10) A. Ein abgeflachter .Die Spuren unten zeigen [Ca 2+] i-Signale über 5 min von den 10 in A B. A gezeigten Zellen aufgezeichnet abgeflacht und vergrößerten z. -stack Bild für eine einzelne astrocyte.The Spuren unten zeigen [Ca 2+] iSignale über 5 min für die in B gezeigten Einzelzelle aufgezeichnet.

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Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Abbildungsintrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.8K Aufrufe.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 

Serie: Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Forschung

Biologie

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Neurowissenschaften

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

Gehirn Perizyten-Kalzium und hämodynamische Bildgebung bei transgenen Mäusen in Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

Im lebenden Organismus Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung einer Maus mit einem großen Schädelfenster

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

Echtzeit-Bildgebung der Neuronenaktivität in dentaten Gyruszellen von Mäusen 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal activity in awake animals during behavior tasks. Since the hippocampus is closely associated with episodic and spatial memory, it has become an essential brain region in&#160;this field&#39;s research. In recent research, engram cells and place cells were studied by recording the neural activities in the hippocampal CA1 region using the miniature microscope in mice while performing behavioral tasks including open-field and linear track. Although the dentate gyrus is another important region in the hippocampus, it has rarely been studied with in vivo imaging due to its greater depth and difficulty for imaging. In this protocol, we present in detail a calcium imaging process, including how to inject the virus, implant a GRIN (Gradient-index) lens, and attach a base plate for imaging the dentate gyrus of the hippocampus. We further describe how to preprocess the calcium imaging data using MATLAB. Additionally, studies of other deep brain regions that require imaging may benefit from this method.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der neuronalen Aktivität von Körnerzellen des dentaten Gyrus mit einem Miniaturmikroskop

The dentate gyrus of the hippocampus carries out essential and distinct functions in learning and memory. This protocol describes a set of robust and efficient procedures for in vivo calcium imaging of granule cells in the dentate gyrus in freely moving mice.

In vivo Calcium-Bildgebung von Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus bei Mäusen 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

Abbildungsintrazellulären Ca

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