This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Uygun ulusal ve kurumsal etik hayvan deneyleri gerçekleştirmeden önce alınmalıdır. EDL kas ve sinir 1. Kaldırma <ol><li> Tartılır ve derinden% 5 izofluoran bir buharlaştırıcı artı 1.5 L / dk oksijen akış hızı veya alt izofluoran batırılmış pamuk ile bir çan kavanoz kullanarak inhale izofluoran bir yetişkin fare uyutmak. </li><li> Fare derin anestezi ve bir ayak tutam yanıt vermiyor emin olun. Hızla büyük, bilenmiş makas veya giyotin kullanarak başını kesmek. </li><li> Makas kullanılarak kaburga üzerinden ventral orta hat kesim yapmak ve iç organları çıkarın. </li><li> Boyun bölgesinden cilt tutup ayaklara çekerek hayvan derisini. </li><li> Kalça üzerinde keserek bacakları çıkarın ve carbogenated soğutulmuş (4 ° C) ile bir çanak (% 95 O2,% 5 CO2), düşük miktarda kalsiyum, magnezyum, yüksek bikarbonat tamponlu tuzlu su çözeltisi içine contai cidarlı bacakları yerleştirinmM olarak Ning: 128 NaCl, 1.9 KCl, 1.2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 0.85 CaCl2, 16 6.5 MgSO 4 ve 10 glikoz (7.4 ± 0.05 değerinde pH). Düşük kalsiyum, yüksek magnezyum çözüm diseksiyonu sırasında sinaptik iletim inhibe eder. </li><li> Çanak bacağı dorsal yüzü yukarı yerleştirin ve bacakları pin ve diz ve ayak bileği eklemlerinde 90 ° açıyla böylece iğne veya böcek pimleri kullanarak aşağı kalçalar. Yerinde tutmak için her bir doku ayak ucu ile ön ve arka uyluk her birinde bir pim bir pim yerleştirin. </li><li> Castroviejo yaylı makas kullanılarak, uyluk kas üst tabakası yukarı kaldırın ve hemen altındaki siyatik sinir ortaya çıkarmak için kesilmiş bir orta hat yapmak. Siyatik sinir, sadece üst kas tabakasının altında yer alan ve kalça yakın çıkışından femur üzerinde çalışır kadar sadece diz ekleminin önce ortak peroneal ve tibial sinirin içine o dalları. </li><li> Po kadar siyatik sinirin üzerindeki kas çıkarınint hangi fleksör hallusis longus (FHL) kas içine derin peroneal sinir dalı dalışlar görünür. </li><li> Içinde 55. forseps kullanarak, tibia medial tarafında gastroknemius ve soleus kaslarının kurtulması için peroneal dal etrafında bağ dokusu disseke. Gastroknemius ve soleus kaslarının tendonları kesin ve dikkatli bir sinir altında çıkarın. </li><li> Ta altında gizli EDS, FHL, EDL, ve tibialis anterior (TA): eklem-den medial lateral ayak bileğinde üç ayrı tendon demetleri maruz tibia yan tarafında yüzeysel kas çıkarın. </li><li> , Ayak bileği ekleminde TA tendonu kesilmiş EDL yukarı ve uzağa TA kaldırın ve çıkarmak için diz yakın kas kesmek. </li><li> Ayak bileğinde tendon FHL kesin ve sinir FHL girer alanına ulaşmak için geri kaldırın. Sadece bu noktanın altında kesin ve FHL kas ~ 2/3 kaldırmak. </li><li> Kutuplu olarak kalça eklemine yakın siyatik siniri kesmekmak ve yavaşça derin peroneal dalı dışındaki tüm sinir dalları kaldırdığını. </li><li> Büyük yaylı makas kullanılarak hem ayak bileği ve diz eklemlerinde EDL tendonları kesin. </li><li> Keskin bir makas kullanarak, diz kaval kemiği keserek çevreleyen dokudan EDL, kalan FHL ve sinir kaldırmak ve uyluk ortasıdır. Böylece sadece EDL, FHL ve sinir parçası olarak kalır kalan kaval kemiği kesip. </li></ol> Doku banyoya EDL Kas ve Sinir 2. montajı (Şekil 1A) <ol><li> Deneyin başlamasından önce, doku banyosu hazırlamak. Sürekli ile banyo serpmek oksijenli (% 100 O2) sentetik bağırsak sıvısı (SIF) 123 NaCl, 3.5 KCl (mM olarak), 0.7 MgSO 4, 1.7 NaH 2 PO 4, 2.0 CaCl2, 9.5 NaC 6H 11 O ( sodyum glukonat), 5.5 glikoz, 7.5 sukroz, ve 10 N 2-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-ve -2hanesulfonic asit (HEPES); pH 7.4 ± 0.05 17. 15-30 ml / dk bir akış oranı tavsiye edilir. Banyosunun dibinde, bir monte edilen doku yazılan ve bir kuvvet ve uzunluğu, kontrol cihazı için bir bağlama (yaklaşık banyo boyutunda sabit iki uyarıcı elektrot, 25 ml kapasiteli bir ticari olarak temin edilebilir bir banyodur gösterilmiştir 8,5 cm x 3 cm x 1 cm; özellikleri için ) Malzeme / Ekipman Tablosuna bakın. </li><li> Izole kas-sinir işlemek ve doku banyosu içine yerleştirmek için kalan FHL doku kullanın. Çanak tabanında sylgard üzerinde küçük bir parça yerleştirilir ve stabilize etmek için kas kalan FHL doku ile bir böcek pimi kullanılır. </li><li> Hem tendonları kravat ve bir doku yazılan uca ve kuvvet ve uzunluk kontrolörün manivela diğer tutturmak için 6-0 ipek dikişlerle kullanın (özellikler için Malzeme / Ekipman Tablo). Pratik olan en küçük dikiş uzunluğu kullanın. Eğer tendon bağlı sonra böcek pin ve Sylgard çıkarın. NOT: Kolay kolaylaştırmak içinkoluna bağlantı tel küçük bir parça epoksi ile kol kola bir &quot;j&quot; şeklinde kanca içine bükülmüş ve sabit olabilir kol. Ameliyat dikiş ipliği daha sonra tele bağlı yerine kaldıraç kolu üzerinde oluşan küçük bir delik arasından geçirilebilir. </li><li> Önce bir cam mikropipet çektirmenin kullanarak SA 16 camından emme elektrotlar Yap (Isı = 286, = 0, Hız = 150, Zaman = 200 çekin); geri ucunu kırmak ve elle 3 mm konik orada yaklaşık kadar bileme taş üzerinde eziyet. (Elektrot ürün bilgileri için şematik ve Tablo Malzeme / Ekipman için Şekil 1B-1C bakın) örnekleme isteyen sinirin alanına bağlı olarak 100 mikron - 10 arasındaki istenen ucu iç çapı microforge kullanarak ucu eritin. </li><li> SIF ile iç gümüş tel bir premade cam emme elektrot doldurun. </li><li> Elektrot içine sinirin kesik ucuna emme ve diferansiyel yükseltecin pozitif bağlantı noktasına bağlanır. Bir klorürlü gümüş elektrot sarınheadstage olumsuz portuna bağlanır tel. Headstage zemin noktasına banyo ikinci bir klorürlü gümüş tel çalıştırarak SIF banyo topraklayın. Ayrıca perfüzyon pompaları ile tanıtıldı elektriksel gürültü azaltmak için birden fazla noktada Faraday kafesine perfüzyon boru topraklayın. </li><li> Bir seğirme daralma indüklemek için, doku banyosu içindeki kas her iki tarafına monte edilen elektrodlar vasıtası ile kas stimüle eder. Alternatif olarak, sinirin kesik ucuna bir uyarıcı elektrot yerleştirmek. Bir zirve kasılma gücünün gözlenene kadar uyarıcı gerilimini artırmak ve üst maksimum voltajda (0.5 milisaniye darbe genişliği) ulaşmak için ek bir% 15 voltajı arttırır. Arasında bir ara-10 saniye geri kalanı ile, maksimum voltajda Seğirme kasılmaları devam eder, ancak pik kasılma kuvveti elde edilene kadar kas uzunluğu değişir kas optimal uzunluğu (L O) bulmak ulaşılır. Tüm uzunluğu rampaları ve titreşimler, bu Leng de kas ile başlayacakTh. </li><li> Kas, sinir dokusu hazırlanması banyo sıcaklığına ulaşmaya ve normal sinaptik iletimi için düşük bir kalsiyum çözeltisi içinde diseksiyon sonrası düzgün izin vermek için bir sonraki veri toplama için en az 1 saat boyunca banyosu içinde kalmasını sağlar. </li><li> Oda sıcaklığında başka bir sıcaklıkta veri toplamak amacıyla, kas yakın doku banyosu içine bir sıcaklık probu yerleştirin. Yavaş yavaş bir doku banyosu taban plakası içinden ısıtılmış su pompalanarak banyo sıcaklığına kadar getir. Istikrarlı bir sıcaklık korumaya yardımcı olmak SIF rezervuar etrafında kil mikrodalga ısıtma pedleri sarın. </li></ol> 3. Veri Toplama <ol><li> Bir mili ileticisi olarak afferent tespit tekrarlanan seğirme kez teslim 0,5 milisaniye supramaksimal gerilim uyaran tarafından üretilen kasılmalar her saniye sırasında nöronal aktiviteyi kaydetmek için. NOT: Kas mili afferentler seğirme kasılma 18,19 (Şekil 2) sırasında duraklatma gerekir. </li><li> Kullanım data toplama yazılımı farklı hızlarda ve farklı uzunluklarda uzunluk değişiklikleri uygulamak için. Bu görevi otomatikleştirmek (verilen uzanıyor özelleştirmek için nasıl komut ve yön bir ekran görüntüsü için ek bilgileri görmek) için özel bir komut dosyası kullan. % 2.5,% 5 ve% 7.5 L, O streç uzunlukları ve / 15 sn 20, 40 ya da% 60 L, O hızlarda streç 4 saniye rampa ve tutma kesimleri uygulanır. NOT: Gerekli bir voltaj-milimetre dönüşüm faktörü için özel kuvvet ve uzunluk denetleyici için kullanım kılavuzuna bakınız. </li><li> Deneyin sonunda, maksimal izometrik kasılmalar tetanik (500 msn tren 120 Hz frekans tren, 0.5 milisaniye darbe genişliği, üst maksimum voltajda) kullanılarak 24 ° C &#39;de kas sağlığı belirler. Önceden bildirilen değerlere zirve kasılma gücünü karşılaştırmak (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

<ol>
	<li>Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+1,+The+Nervous+System,+Motor+Control.">Section 1, The Nervous System, Motor Control.</a> Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).</li><li>Houk, J., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Golgi+tendon+organs+to+forces+applied+to+muscle+tendon.">Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon.</a> J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).</li><li>Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotyping+of+group+III+and+IV+muscle+afferents+in+mouse.">Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse.</a> J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).</li><li>Nichols, T. R., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-bridge+mechanisms+underlying+the+history-dependent+properties+of+muscle+spindles+and+stretch+reflexes.">Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).</li><li>Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociception+from+skeletal+muscle+in+relation+to+clinical+muscle+pain.">Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain.</a> Pain. 54, 241-289 (1993).</li><li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+skeletal+muscle+fibers+of+mice+following+lengthening+contractions.">Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions.</a> J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Barclay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diffusive+O(2)+supply+to+isolated+preparations+of+mammalian+skeletal+and+cardiac+muscle.">Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).</li><li>Taguchi, T., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscular+thin-fiber+receptors+in+aged+rats+recorded+in+vitro.">Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro.</a> European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).</li><li>Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride-sensitive+channels+are+a+major+contributor+to+mechanotransduction+in+mammalian+muscle+spindles.">Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles.</a> J Physiol. 588, 171-185 (2010).</li><li>Wenk, H. N., McCleskey, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+skeletal+muscle-nerve+preparation+and+in+vitro+model+of+ischemia.">A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia.</a> J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).</li><li>Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaliplatin+neurotoxicity+of+sensory+transduction+in+rat+proprioceptors.">Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors.</a> J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+muscle+spindle+afferents+in+the+adult+mouse+using+an+in+vitro+muscle-nerve+preparation.">Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation.</a> PLoS One. 7, e39140 (2012).</li><li>Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicuculline-sensitive+primary+afferent+depolarization+remains+after+greatly+restricting+synaptic+transmission+in+the+mammalian+spinal+cord.">Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord.</a> J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).</li><li>Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+properties+of+mouse+sensory+neurons+innervating+hairy+skin.">Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin.</a> J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).</li><li>Matthews, B. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+muscle.">Nerve endings in mammalian muscle.</a> J Physiol. 78, 1-53 (1933).</li><li>Hunt, C. C., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+receptor+discharges+during+muscle+contraction.">Stretch receptor discharges during muscle contraction.</a> J Physiol. 113, 298-315 (1951).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+analysis+of+isolated+skeletal+muscle.">Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hoheisel, U., Rein&#246;hl, J., Unger, T., Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+capsaicin+activate+mechanosensitive+group+IV+muscle+receptors+in+the+rat.">Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat.</a> Pain. 110, 149-157 (2004).</li><li>Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscle+thin-fiber+sensory+receptors+recorded+from+rat+muscle-nerve+preparations+in+vitro+after+eccentric+contraction.">Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction.</a> J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).</li><li>Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

Bu makalenin amacı, bir fare izole kas-sinir hazırlık kas iğ afferentlerin kayıt için bir yöntem tarif oldu. Biz fare mili afferentler sıçan, kedi ve insanlarda 15 gelenler gibi germek için benzer yanıt bulduk, ve diğer laboratuarlar kas ve in vitro deride hem de duyusal nöronların çalışma model organizma olarak fareleri kullanmıştır (örneğin 3,13 için) . Kas duyusal afferentler 24 ° C ve 34 ° C hem de en az 6-8 saat süreyle kaydedilebilir. EDL ve sinir en aza indirmek için, mümkün doku işlemek için FHL kalan bölümünü kullanın. Diseksiyon sonra, organ banyosu sıcaklığında ve normal sinaptik kurtarmak için dengeye gelmesi için yeterli veri toplama başlatmak için en az 1 saat bekletin. Daha önce, kas sağlık maksimal tetanik Contra belirlenmesiyle bu hazırlıkta kullanılır kas bir alt kümesi ile doğrulanmıştırkasları tarafından üretilen kuvvet ctile deney 15&#39;in başında ve sonunda diğerleri tarafından rapor edilene benzer. Kas mili afferentler (Şekil 3) (Şekil 2) kasılmayı seğirme yanıt ateş karakteristik bir duraklama arıyor yanı sıra uzunluğu değişikliklere yanıt beklenen anlık frekans artışları ile bu hazırlık işlevsel tespit edilmiştir. Bizim tecrübelerimize göre, kontrol koşullarında ateş en afferentler kas iğ afferentler vardır. Bu hazırlık (~ 7 mm maksimum) tutulan sinirin uzunluğu kas aferan subtiplerinin 13 tanımlamak için afferent iletim hızı farklılıkları kullanmak için yeterince uzun değildir. Ayrıca, kedi ve insanlarda aksine, dinamik duyarlılık ölçüleri (daha fazla tartışma için Wilkinson ve ark. 15&#39;e bakınız) açıkça farelerde Grup Ia ve II afferentleri ayırt etmek mümkün değildi. Afferentlerin Diğer alt tipleri (yani., Grup III ve IV), vb iskemi kas açığa, banyo pH azaltılması, kapsaisin, ATP veya bradikinin gibi 3,13,21-23 maddeler eklenerek, örneğin, bu terkipte ilave fonksiyonel testler kullanılarak tespit edilebilir Emme elektrodu kullanarak tek bir kas alınabilir veri miktarını arttırır, birden fazla duyusal nöronlardan etkinliği, bir kez kayıt sağlar. Bu hazırlık duyusal nöron nüfus yanıtlar veya tespit afferentlerinden tepkiler üzerine bir pertürbasyonun genel etkisini ölçmek için kullanılabilir. Başak şekiller yeterli benzersiz iseniz, 4 duyu nöronlarının kadar () Spike2 ikisi (Cambridge Elektronik Tasarım) ve LabChart Pro (AD Instruments benzer gerçekleştirdiniz) yazılım tarafından ayırt edilebilir. Nöronlar ayrımcılık olamaz durumlarda, elektrot yerleştirme veya uç çapının değişiklikler kolayca uygulanabilir. In vitro HAZIRLIK Özet olarak, fare sinir kastirme çeşitli fizikokimyasal tedirginlikler, yaralanma ve hastalık modelleri kas duyusal afferent tepki özelliklerini araştırmak için kullanılan basit bir deneysel yaklaşımdır. Ayrıca, bu preparat ideal transgenik hayvanları ve Optogenetic araçları dahil olmak üzere, farelerde mevcut güçlü genetik araçlar, yararlanmak için uygundur.

İskelet kasları, kas ortamı hakkında önemli bilgiler merkezi sinir sistemi sağlamak duyu nöronlar tarafından innerve. Kas iğ yüksek ekstrafüzal kas lifleri ile paralel olarak yer alan intrafüzal kas elyaflardan oluşan kapsül yapılardır. Iğ Grup Ia ve kas uzunluğu ve intrafüzal lif tonunda değişiklikler dinamik innerve gamma motor nöronlar 1 tarafından düzenlenir kodlamak II aferentler tarafından innerve. Grup Ib afferentler kas lifleri ve onların tendon yapışma arasına konumlandırılmış ve kas kasılmasının 2 sırasında örneğin kas kuvveti değişikliklere duyarlı olan. Grup Ia, Ib ve II afferentler uygun motor kontrolüne yardımcı proprioseptif geribildirim sağlamak. Kas içinde bulunan kas ileticilerin ilave popülasyonlar (Grup III ve IV) metabolit oluşumunu, nosiseptif uyaranın varlığını ve kas sıcaklık sinyal vermektedir <sup&gt; 3. Bu kas duyusal bilgi vücut dengesinin sürdürülmesinde kas hasarı önlemek ve hareketi modüle etmek önemlidir. Kas afferentler önceden tecrübesi 4 dayanarak ateş desenleri değiştirebilir. Nosiseptörlerin aktivasyonu dengesi ya da hareket 6 ile ilgili problemlere neden olabilir kronik ağrı halleri 5 ve kas algılayıcılardan gelen anormal sinyallemesinin indüklenmesine yol açabilir. Biz (de gösterilmiştir 2-4 ay eski C57Bl / 6 farenin ve yanıtları) Her iki cinsiyetten yetişkin farelerin kas duyusal nöron reseptör sonlardan tepkisini incelemek için in vitro hazırlanmasında izole kas-sinir kullanın. Fare memelilerde çalışmalar için bir model genetik türdür. Bu preparat, siyatik sinirinin derin peroneal dal ve ekstensör digitorum longus (EDS), kas, alt bacağın yan kısmında bulunan peroneal grubunun bir hızlı kasılan kasın izole edilmesini gerektirmektedir. EDL genellikle kas kasılma özellikleri 7-9 incelemek için kullanılır, te vardırkolay ndons yalıtmak ve istirahat ve makul daralma görev çevrimleri 10 ile yeterli dağılır oksijen kaynağı sağlayacak kadar küçüktür için. (Örneğin soleus ve tibialis anterior için) bu alanda diğer kaslar benzer bir boyutu vardır ve bu hazırlık kolayca bu kasların aferentler kayıt için değiştirilmiş olabilir. Bir emme elektrodu kas duyu ileticisi, ateş kaydetmek için sinirin kesik ucuna yerleştirilir. Bireysel nöronlar tespit ve başak sıralama yazılımı kullanarak kendi başak şekline göre analiz edilebilir. Banyo ya da sinir üzerinde uyarıcı elektrot kas kasılması uyandırmak için kullanılabilir. Kas uzunluğu ve kuvvet kontrol edilir ve ticari olarak temin edilebilen sistemler kullanılarak ölçülebilir. Benzer nitro preparasyonlar EDS 11 sıçanda t, sıçan dördüncü lumbrikal ayak kas Grup IA ya da II mili ileticileri 12 Grup III ve IV kas ileticileri Grup III ve IV kas ileticileri incelemek için kemirgenlerde kullanılmıştır bölgesindekifare plantar kas 13 diye. In vitro bir sistem farmakolojik erişilebilirlik sıcaklık ve pH gibi perfüzyon ve fizikokimyasal değişkenler doğrudan kontrolünde avantajları vardır. Bir in vitro yaklaşım, in vivo potansiyel anestezi ve kas perfüzyon durumunun boşa ortadan kaldırır. Kas-sinir hazırlık afferentlerde pertürbasyonunun doğrudan yanıt çalışmaya imkan tanırken, in vivo 14 veya ex 3 preparatlar gibi kurban edilir vivo mümkündür mili duyarlılığı ve diğer entegre cevapların gama efferent modülasyonu çalışma yeteneği Bu hazırlık nöron hücre gövdeleri vardır. Bu preparasyon, daha önce rampanın bir pile fare kas mili ileticilerin yanıtını belirler ve esneme ve titreşimi tutmak için kullanılır ve bu fare mili iletici yanıt vermeyen belirlendiBu tür malzeme, sıçanlar, kediler, ve insanlar gibi diğer türlerde de rapor edilenlere benzerdi. Fare mili afferent cevapları 34 ° C mutlak atış hızlarında daha hızlı olmasına rağmen, 24 ° C ve 34 ° C banyo sıcaklıkları hem de benzer bulundu ve afferentler 15 değiştirir hızlı uzunluğuna yanıt daha başardık. Bu preparat kas mili ileticileri belirlemek ve incelemek için kullanılabilir nasıl aşağıda açıklanmaktadır. Ayrıca, bu preparat kolayca bir ilaç ya da hastalık durumunun veya çeşitli diğer değişkenler (yaş, cinsiyet, gen nakavt) yanıt olarak duyu ileticilerinin özelliklerini karşılaştırmak için, diğer alt tiplerinin kas iletici 13 tepkisini incelemek için modifiye edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Force and Length Controller &amp;amp; Tissue Bath</td><td>Aurora Scientific, Inc.</td><td>300C-LR &amp;amp; 809B-IV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &amp;amp; Easy Load II Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07523-80 &amp;amp; EW-77200-60</td><td></td></tr><tr><td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &amp;amp; Headstage Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 1800; 700000 &amp;amp; 700500</td><td></td></tr><tr><td>Simulator</td><td>Grass&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; Aurora Scientific, Inc.</td><td>S88&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; 701 C</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Swift</td><td>892070</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Source</td><td>Fiberlite</td><td>Model 190</td><td></td></tr><tr><td>Analog to Digital Board</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition &amp;amp; Analysis Software</td><td>AD Instruments</td><td>LabChart Pro 7</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Holder</td><td>A-M Systems</td><td>672445</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Glass</td><td>Dagan</td><td>SA16</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td></td></tr><tr><td>Isoflourane</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>18627</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Surgical Tools&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Large Dissecting Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14014-17</td><td></td></tr><tr><td>Large Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Large Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>#55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharp Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Silk Suture</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF&lt;br/&gt; (Low Calcium solution is equilibriated with 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05; SIF is equilibriated with 100% O2 gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>230391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium gluconate</td><td>Sigma</td><td>S2054-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>S8282-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Kas duyusal nöronlar, kas iğ ve Golgi tendon organlarının Propriosepsiyon için gerekli uzunluk ve kuvvet değişiklikleri kodlamak innerve. Ek afferentleri metaboliti birikinti, sıcaklık, ve nosiseptif uyaranlara dahil kas çevrenin diğer özellikleri, izlemek. Genel olarak, duyusal nöronların aktivasyonu anormal hareket bozukluğu olan veya kronik ağrı sendromlara neden olabilir. Biz, erişkin farede esnetilebilir-uyarılmış aferent yanıtların in vitro çalışma için ekstensor digitorum longusun (EDS), kas ve sinir izolasyonunu tarif eder. Duyu aktivitesi, emme elektrodu ile sinirinden kaydedilir ve tek tek ileticileri başak sıralama yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. In vitro preparasyonlar anestezi potansiyeli karıştırıcıların veya değiştirilmiş kas perfüzyon olmadan duyu ileticilerinin üzerinde iyi kontrol edilen çalışmalar için izin verir. İşte biz belirlemek ve germek için kas iğ afferentlerinden tepkisini test etmek için bir protokol açıklar. Önemli bir şekilde,Bu hazırlık da ilaç uygulama ve farelerde güçlü genetik yaklaşımlar ve hastalık modellerinin dahil aşağıdaki kas afferentlerin, tepki özellikleri diğer alt tiplerinin çalışmasını destekler.

Kas afferentlerin tepkisi çalışılmaktadır hangi aferan alt tip bağlı tedirginlikler çeşitli takip kaydedilebilir. Kas kasılması ve rampa ve streç tutmaya kas iğ afferentlerin Temsilcisi cevapları burada gösterilmektedir. Bir mili ileticisi olarak afferent tanımlamak için, seğirme kasılmalar daralma 18,19 esnasında ateş bir duraklama var olup olmadığını görmek için bir kez her saniye (0.5 msn darbe genişliği) verilmiştir. Şekil 2 nöronal aktivite ve kas gerginliği temsili bir iz sırasında gösterir Bu seğirme kasılmalar. Mili afferentleri için beklendiği gibi nöronal aktivite, seğirme kasılmalar sırasında görülmektedir. Kaydedilen afferent bir Grup Ib Golgi tendon organı afferent, kasılma sırasında ateşleme hızı bir artış olsaydı beklenir. Kontrol koşulları 34 ° C&#39;de en çok 24 ° C de normal ateşleme desen (~ 12 darbeleri / saniyedir ileticileri ve ~ 32 dürtüler / san altında) Kas mili afferentler vardır. Mili afferentlerin bir alt sadece olacak yangın streç sırasında (bizim ellerde ~ mili afferentlerin% 11) 15. Şekil 3A iki kas iğ afferentlerin bir temsilcisi ham iz bir rampa yanıt ve kuvvet ve uzunluk kontrolör tarafından üretilen streç tutun gösterir. LabChart başak Histogram özelliği belirlemek ve ani ayrı ayrı iki bağımsız nöronların ateşleme frekansını (Şekil 3B-3C) analiz etmek için kullanılır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. İzole kas hazırlanması a) ekstensör digitorum longus (EDS) ve innerve siyatik sinir oksijenli sentetik dokulararası sıvının (SIF) ile perfüze edilmiş, izole edilmiş bir doku banyosu içine monte edilmiştir. Bir sucti bağlı bir hücre-dışı amplifikatörelektrot üzerinde sinir aktivitesini kaydeder. Uygun yazılım-kontroller ve tedbirler kas kuvveti ve boyu denetleyici-A çift kuvvet ve uzunluğu. Doku Banyo elektrotlar seğirme veya tetanik kasılmaları üretmek için uyaranlara teslim. İç plaka banyo kanaldan sıcak su pompalanması organ banyosu sıcaklığı b.) Çekilir cam emme elektrodu kontrol microforge kullanılarak üretilir emme elektrodu için ideal bir uç şekli ~ 3 mm konik uç ° C). Büyütülmüş tasviriyle. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">burada tıklayın Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.</a> <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Daralma Twitch Şekil 2. Mil Afferent Cevabı. Nöronal activity (üst iz) ve 30 seğirme kasılmalar kas gerginliği (alt iz) siyah üst üste iz bindirilmiş. Afferent aktivite kas iğ afferentlerin karakteristik bir yanıttır daralma bağlı gerilim artırımı sırasında duraklar. Etkinliği ara verildiğinde üst iz üstünde Tutucu ve ok kasılması sırasında zamanı belirtmek. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Figure 3. Mili Afferent Tepki Rampa ve Stretch A tutunuz) iki afferentlerin (üst iz) Ham nöral aktiviteyi bir rampa sırasında ve EDL (alt iz gösterilir kas uzunluğu). B) Ani ateş frekans (Öğr uygulanan streç tutun. Fr., A L o aktiviteyi gösteren birimin saniyede dürtüler) () mavi gösterilmiştir. C) INSTANTANEsadece yangınlar streç sırasında (turuncu gösterilen) küçük birimin lı ateşleme frekansı. Her iki ünite kas iğ afferentlerin 1 karakteristik streç sırasında başak frekans uyumunu sergiler.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Kas duyusal nöronlar propriyoseptör sinyalizasyon dahil ve aynı zamanda metabolik devlet ve yaralanma ile ilgili olaylar üzerine rapor edilmektedir. Biz streç aktive kas afferentlerde çalışmaları için in vitro kas-sinir hazırlanmasında bir yetişkin fare açıklar.

Bir<em&gt; İn Vitro</emKas afferentlerin tahrik Properties incelenmesi için&gt; Yetişkin Fare kas-sinir Hazırlık

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

an-vitro-adult-mouse-muscle-nerve-preparation-for-studying-firing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

16.9K Görüntüleme.  San José State University.  Kas duyusal nöronlar propriyoseptör sinyalizasyon dahil ve aynı zamanda metabolik devlet ve yaralanma ile ilgili olaylar üzerine rapor edilmektedir. Biz streç aktive kas afferentlerde çalışmaları için in vitro kas-sinir hazırlanmasında bir yetişkin fare açıklar. 

Video: An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Nörobilim

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Kültür Bulaşık A Fonksiyonel Motor Birim: Omurilik Eksplantlarından ve Kas Hücrelerinin Co-kültür

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

The spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural function because it is a neuron of the central nervous system with the unique properties of (1) having readily identifiable targets (the muscle fibers) and therefore having a very well-known function (to control muscle contraction); (2) being the convergent target of many spinal and descending networks, hence the name of "final common pathway"; and (3) having a large soma which makes it possible to penetrate them with sharp intracellular electrodes. Furthermore, when studied in vivo, it is possible to record simultaneously the electrical activity of the motoneurons and the force developed by their muscle targets. Performing intracellular recordings of motoneurons in vivo therefore put the experimentalist in the unique position of being able to study, at the same time, all the compartments of the "motor unit" (the name given to the motoneuron, its axon, and the muscle fibers it innervates1): the inputs impinging on the motoneuron, the electrophysiological properties of the motoneuron, and the impact of these properties on the physiological function of the motoneurons, i.e. the force produced by its motor unit. However, this approach is very challenging because the preparation cannot be paralyzed and thus the mechanical stability for the intracellular recording is reduced. Thus, this kind of experiments has only been achieved in cats and in rats. However, the study of spinal motor systems could make a formidable leap if it was possible to perform similar experiments in normal and genetically modified mice.
For technical reasons, the study of the spinal networks in mice has mostly been limited to neonatal in vitro preparations, where the motoneurons and the spinal networks are immature, the motoneurons are separated from their targets, and when studied in slices, the motoneurons are separated from most of their inputs. Until recently, only a few groups had managed to perform intracellular recordings of motoneurons in vivo2-4 , including our team who published a new preparation which allowed us to obtain very stable recordings of motoneurons in vivo in adult mice5,6. However, these recordings were obtained in paralyzed animals, i.e. without the possibility to record the force output of these motoneurons. Here we present an extension of this original preparation in which we were able to obtain simultaneous recordings of the electrophysiological properties of the motoneurons and of the force developed by their motor unit. This is an important achievement, as it allows us to identify the different types of motoneurons based on their force profile, and thereby revealing their function. Coupled with genetic models disturbing spinal segmental circuitry7-9, or reproducting human disease10,11, we expect this technique to be an essential tool for the study of spinal motor system.

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

This new method permits the simultaneous intracellular recording of a single adult mouse motoneuron and the measurement of the force produced by its muscle fibers. The combined investigation of the electrical and mechanical properties of motor units in normal and genetically modified animals is a breakthrough for the study of the neuromuscular system.

Erişkin Fare yılında Motor Ünite tarafından üretilen bir Lomber Motonöron ve Kuvvet Eşzamanlı intrasellüler Kaydı<em&gt; In vivo</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

Fare Siyatik Sinir Vivo elektrofizyolojik ölçümlerde

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

Fare Kolorektal Afferent Endings in vitro Fonksiyonel Karakterizasyonu içinde

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Tıp

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the different organ systems from the periphery towards the central nervous system. As such, the increased activity or &#39;sensitization&#39; of mesenteric afferent nerves has been allocated an important role in the pathophysiology of visceral hypersensitivity and abdominal pain syndromes.
Mesenteric afferent nerve activity can be measured in vitro in an isolated intestinal segment that is mounted in a purpose-built organ bath and from which the splanchnic nerve is isolated, allowing researchers to directly assess nerve activity adjacent to the gastrointestinal segment. Activity can be recorded at baseline in standardized conditions, during distension of the segment or following the addition of pharmacological compounds delivered intraluminally or serosally. This technique allows the researcher to easily study the effect of drugs targeting the peripheral nervous system in control specimens; besides, it provides crucial information on how neuronal activity is altered during disease. It should be noted however that measuring afferent neuronal firing activity only constitutes one relay station in the complex neuronal signaling cascade, and researchers should bear in mind not to overlook neuronal activity at other levels (e.g., dorsal root ganglia, spinal cord or central nervous system) in order to fully elucidate the complex neuronal physiology in health and disease.
Commonly used applications include the study of neuronal activity in response to the administration of lipopolysaccharide, and the study of afferent nerve activity in animal models of irritable bowel syndrome. In a more translational approach, the isolated mouse intestinal segment can be exposed to colonic supernatants from IBS patients. Furthermore, a modification of this technique has been recently shown to be applicable in human colonic specimens.

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.

Fare jejunal ve Kolon Segmentlerde Mezenterik Afferent Sinir Faaliyet Vitro kaydedilmesi

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Nöromüsküler kavşak işlevleri ölçme

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

Vivo Bileşik kas aksiyon potansiyeli Motor nöron hastalığı, fare modellerinde ön ayakları üzerinden elektrofizyolojik ölçümü

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

Farelerde Nöromüsküler Kavşakların Kombine Konfokal ve Süper Redüksiyonlu Mikroskopi ile Karakterizasyonu

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Bir

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler