Name: an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents
Uploaded: 2014-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

יש לקבל את אתיקה לאומית ומוסדית מתאימה לפני ביצוע ניסויים בבעלי חיים. .1 הסרה של שרירים EDL ועצב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ועמוק להרדים עכבר מבוגר עם isofluorane בשאיפה באמצעות אידוי עם isofluorane 5% בתוספת 1.5 L / קצב זרימת חמצן דקות או צנצנת פעמון עם הכותנה isofluorane ספוג בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהעכבר הוא עמוק בהרדמה ואינו מגיב לקמצוץ הבוהן. במהירות לערוף באמצעות מספריים גדולים, חידדו או גיליוטינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קו האמצע הגחון דרך הצלעות באמצעות מספריים ולהסיר את האיברים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עור בעלי החיים ידי אחיזה בעור מאזור הצוואר ומושך את זה בעבר הרגליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרגליים על ידי חיתוך מעל הירכיים ומניחים את רגלי עור לתוך צלחת עם (4 ° C) המצונן, carbogenated (95% O 2, 5% CO 2) סידן נמוך, contai תמיסת מלח ביקרבונט שנאגרו גבוה מגנזיוםנינג במ&quot;מ: 128 NaCl, KCl 1.9, 1.2 KH 2 PO 4, 26 3 NaHCO, 0.85 CaCl 2, 6.5 MgSO 4, ו10 גלוקוז (pH של 7.4 ± 0.05) 16. סידן הנמוך, פתרון הגבוה מגנזיום מעכב שידור סינפטי במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רגלי צד גב בצלחת ולהצמיד את הרגליים וירכיים למטה באמצעות מחטים או סיכות חרקים, כך שמפרקי הברך וקרסול נמצאים בזווית של ° 90. הנח פינים בכל קצה של הרגליים וסיכה אחת בכל אחת מהקדמית וירכיים אחורי כדי להחזיק את הרקמה במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים אביב Castroviejo, להרים את השכבה העליונה של שריר בירכיים ולעשות קו האמצע לחתוך לחשוף את גיד הנשה ישירות מתחת. גיד הנשה ממוקם ממש מתחת לשכבת השריר העליונה והוא פועל מעל לעצם הירך מהיציאה שלה ליד הירכיים עד שסניפים לperoneal המשותף והעצב הטיביאלי רק לפני מפרק הברך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השריר מעל גיד הנשה עד פוint שבצלילות סניף עצב peroneal העמוקים לתוך שריר longus hallucis המכופף (FHL) הוא גלויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות # 55 מלקחיים, לנתח את רקמת החיבור סביב סניף peroneal כדי לשחרר אותו משרירי הגסטרוקנמיוס וsoleus, אשר נמצאים בצד המדיאלי של הטיביה. חותך את הגידים של שרירי הגסטרוקנמיוס וsoleus ולהסיר אותם בזהירות מתחת לעצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השרירים השטחיים בצד הלטרלי של הטיביה לחשוף שלוש חבילות גיד נפרדות בקרסול משותף מהמדיאלי לרוחב: FHL, EDL, וקדמי tibialis (ת&quot;א), עם EDL החבוי מתחת לת&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גיד ת&quot;א במפרק הקרסול, להרים את ת&quot;א למעלה מן האדים, ולחתוך את השריר ליד הברך כדי להסיר אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גיד FHL בקרסול ולהרים אותו חזרה כדי להגיע לאזור שבו העצב נכנס FHL. חותך רק מתחת לנקודה זו ולהסיר ~ 2/3 של שריר FHL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גיד הנשה הקרוב למפרק הירך כמו possible ועדינות להפשיט את כל ענפי העצב, פרט לסניף peroneal העמוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גידי EDL בשני מפרקי הקרסול והברך באמצעות מספריים אביב גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חדים, להסיר את האדים, FHL שנותר ועצב מן הרקמה הסובבת על ידי חיתוך דרך עצם השוקה בברך ובאמצע הירך. לחתוך את עצם השוקה שנותר, כך שרק האדים, חלק מFHL והעצב יישארו. </li></ol> 2 הרכבה של השרירים EDL והעצב לתוך אמבט רקמות (איור 1 א) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת הניסוי, להכין את האמבטיה הרקמות. כל הזמן perfuse האמבטיה עם חומץ (100% O 2) נוזל ביניים סינטטי (SIF) המכיל (במ&quot;מ) 123 NaCl, KCl 3.5, 0.7 MgSO 4, 1.7 לאא 2 PO 4, 2.0 CaCl 2, 9.5 NAC 6 H 11 O ( gluconate נתרן), 5.5 גלוקוז, סוכרוז 7.5, ו10 N &#39;N -2-hydroxyethylpiperazine- -2-etחומצת hanesulfonic (HEPES); pH 7.4 ± 0.05 17. קצב זרימה של 15-30 מ&quot;ל / דקה מומלצת. מוצג היא אמבטיה זמינה מסחרי של 25 מ&quot;ל קיבולת עם שתי אלקטרודות גירוי קבועות לתחתית האמבטיה, הודעה רקמות רכובה והר לבקר כוח ואורך (מידות אמבטיה משוערת 8.5 סנטימטר x 3 ס&quot;מ x 1 סנטימטר; למפרטים ראה טבלה של חומרים / ציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברקמת FHL שנותרה לטפל בשריר העצב הבודד ולמקם אותו לתוך האמבטיה הרקמות. מניחים חתיכה קטנה של sylgard בתחתית הצלחת ולהשתמש בסיכת חרקים דרך רקמת FHL שנותרה כדי לייצב את השרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 6-0 תפרי משי לקשור את שני הגידים ולהדביק קצה אחד לתפקיד רקמות ואחר לזרוע המנוף של הכוח ובקר אורך (ראה טבלה של חומרים / ציוד למפרט). השתמש באורך התפר הקטן ביותר שהוא מעשי. הסר את סיכת החרקים וsylgard לאחר שקשרת את הגידים. הערה: כדי להקל קלחיבור למנוף זרוע חתיכה קטנה של חוט יכולה להיות כפופה ל&quot; j &quot;וו בצורה וקבועה לזרוע המנוף עם אפוקסי. התפר אז יכול להיות קשור לחוט במקום מושחל לתוך החור הקטן על זרוע המנוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך אלקטרודות יניקה מSA 16 זכוכית באמצעות חולץ micropipette הכוס הראשון (חום = 286, משוך = 0, מהירות = 150, זמן = 200); לשבור את הקצה אחורי וידני לטחון אותו על אבן השחזה עד שיהיו על להתחדד 3 מ&quot;מ. ממסים את הקצה באמצעות microforge לקוטר הפנימי הקצה הרצוי של בין 10-100 מיקרומטר בהתאם לאזור של עצב אחד רוצה לטעום מ( ראה איורים 1 ב-1C לאלקטרודה סכמטי ולוח של חומרים / ציוד למידע על מוצר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא האלקטרודה יניקת זכוכית premade לחוט הכסף הפנימי עם SIF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יניקת סוף החתך של העצב לאלקטרודה ולהתחבר ליציאה החיובית של מגבר ההפרש. עטוף את האלקטרודה עם כסף chloridedחוט שמתחבר ליציאה השלילית של headstage. קרקע האמבטיה SIF על ידי הפעלת חוט כסף chlorided שני מהאמבטיה לנמל הקרקע של headstage. גם לקרקע את צינורות טפטוף לכלוב פאראדיי במספר רבים של נקודות כדי להקטין רעש חשמלי הציג באמצעות משאבות זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את השרירים באמצעות אלקטרודות מוצמדות לכל צד של השריר באמבטיה הרקמות כדי לגרום להתכווצות עווית. לחלופין להציב אלקטרודה מגרה בקצה החתך של העצב. הגדל את מתח המגרה עד כוח התכווצות שיא הוא ציין ולאחר מכן להגדיל את המתח על ידי 15% נוספים כדי להגיע למתח supramaximal (0.5 רוחב פולס אלפיות שני). המשך התכווצויות העווית במתח supramaximal, עם שאר 10 שניות שביניהם, אבל להשתנות האורך של השריר עד כוח התכווצות שיא הוא הגיע כדי למצוא את האורך האופטימלי (o L) של השריר. כל רמפות האורך והתנודות יתחילו עם השרירים בleng זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הכנת שריר העצבים להישאר באמבטיה במשך שעה לפחות 1 לפני איסוף הנתונים הבא על מנת לאפשר לרקמות כדי להגיע לטמפרטורת האמבט ולשידור סינפטי רגיל להתאושש לאחר נתיחה בפתרון סידן נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף נתונים בטמפרטורה אחרת מאשר טמפרטורת חדר, למקם את הבדיקה טמפרטורה לאמבטיה הרקמות ליד השריר. לאט לאט מביא את האמבטיה עד לטמפרטורה על ידי שאיבת מים מחוממים באמצעות צלחת בסיס אמבטיה רקמות. לעטוף כריות חימום במיקרוגל חימר סביב מאגר SIF כדי לעזור לשמור על טמפרטורה יציבה. </li></ol> .3 אוסף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות מביא כמביא ציר, להקליט את הפעילות העצבית במהלך צירים חוזרים ונשנים עווית המיוצרים על ידי גירוי מתח 0.5 supramaximal האלפיות השני נמסר פעם אחת בכל שנייה. הערה: afferents כישור השריר צריכה להשהות במהלך 18,19 התכווצות עווית (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש daתוכנת רכישת ta כדי להחיל את השינויים באורך במהירויות שונות ואורכים שונים. השתמש בתסריט מותאם אישית כדי להפוך משימה זו (ראה מידע נוסף לצילום מסך של התסריט והוראות כיצד להתאים אישית את המתיחות שניתנו). החל משתרע רמפה והחזקה של 4 שניות באורכי מתיחה של .2.5%, 5%, ו7.5% o L ומהירויות מתיחה של 20, 40, או 60% o L / 15 שניות. הערה: עיין במדריך למשתמש של כוח ספציפי ובקר אורך לגורם המרת מתח ל-מילימטר הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של הניסוי, לקבוע בריאות שריר ב24 מעלות צלזיוס באמצעות התכווצויות מקסימליים איזומטרי tetanic (500 רכבת אלפיות שנייה, תדירות רכבת הרץ 120, 0.5 רוחב פולס msec, מתח supramaximal). השווה את כוח התכווצות השיא לערכים שדווחו בעבר (~ 24V N / 2 סנטימטר 9,20). </li></ol>

<ol>
	<li>Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+1,+The+Nervous+System,+Motor+Control.">Section 1, The Nervous System, Motor Control.</a> Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).</li><li>Houk, J., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Golgi+tendon+organs+to+forces+applied+to+muscle+tendon.">Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon.</a> J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).</li><li>Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotyping+of+group+III+and+IV+muscle+afferents+in+mouse.">Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse.</a> J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).</li><li>Nichols, T. R., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-bridge+mechanisms+underlying+the+history-dependent+properties+of+muscle+spindles+and+stretch+reflexes.">Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).</li><li>Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociception+from+skeletal+muscle+in+relation+to+clinical+muscle+pain.">Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain.</a> Pain. 54, 241-289 (1993).</li><li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+skeletal+muscle+fibers+of+mice+following+lengthening+contractions.">Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions.</a> J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Barclay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diffusive+O(2)+supply+to+isolated+preparations+of+mammalian+skeletal+and+cardiac+muscle.">Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).</li><li>Taguchi, T., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscular+thin-fiber+receptors+in+aged+rats+recorded+in+vitro.">Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro.</a> European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).</li><li>Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride-sensitive+channels+are+a+major+contributor+to+mechanotransduction+in+mammalian+muscle+spindles.">Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles.</a> J Physiol. 588, 171-185 (2010).</li><li>Wenk, H. N., McCleskey, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+skeletal+muscle-nerve+preparation+and+in+vitro+model+of+ischemia.">A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia.</a> J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).</li><li>Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaliplatin+neurotoxicity+of+sensory+transduction+in+rat+proprioceptors.">Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors.</a> J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+muscle+spindle+afferents+in+the+adult+mouse+using+an+in+vitro+muscle-nerve+preparation.">Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation.</a> PLoS One. 7, e39140 (2012).</li><li>Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicuculline-sensitive+primary+afferent+depolarization+remains+after+greatly+restricting+synaptic+transmission+in+the+mammalian+spinal+cord.">Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord.</a> J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).</li><li>Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+properties+of+mouse+sensory+neurons+innervating+hairy+skin.">Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin.</a> J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).</li><li>Matthews, B. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+muscle.">Nerve endings in mammalian muscle.</a> J Physiol. 78, 1-53 (1933).</li><li>Hunt, C. C., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+receptor+discharges+during+muscle+contraction.">Stretch receptor discharges during muscle contraction.</a> J Physiol. 113, 298-315 (1951).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+analysis+of+isolated+skeletal+muscle.">Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hoheisel, U., Rein&#246;hl, J., Unger, T., Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+capsaicin+activate+mechanosensitive+group+IV+muscle+receptors+in+the+rat.">Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat.</a> Pain. 110, 149-157 (2004).</li><li>Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscle+thin-fiber+sensory+receptors+recorded+from+rat+muscle-nerve+preparations+in+vitro+after+eccentric+contraction.">Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction.</a> J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).</li><li>Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

מטרתו של מאמר זה הייתה לתאר שיטת רישום מafferents כישור שריר בהכנת שריר עצבים עכבר בודדת. מצאנו כי afferents ציר העכבר מגיבה באופן דומה למתוח כמו אלה מחולדות, חתולים ובני אדם 15, ומעבדות אחרות השתמשו עכברים כיצורי מודל ללמוד נוירונים חושיים בשני השרירים והעור במבחנה (לדוגמא 3,13) . afferents החושית השריר ניתן להקליט לפחות 6-8 שעות בשני 24 מעלות צלזיוס ו34 C °. כדי למזער את הטיפול באדים ועצב, להשתמש בחלק הנותר של FHL לטפל רקמה בכל ההזדמנות אפשרית. בעקבות הנתיחה, לחכות לפחות שעה 1 כדי להתחיל אוסף נתונים כדי לאפשר לרקמות לאזן לטמפרטורת אמבטיה ולשידור סינפטי נורמלי להתאושש. בעבר, בריאות שרירים אומתה על קבוצת משנה של שרירים המשמשים בהכנה זו על ידי קביעה כי קונטרה tetanic המקסימליכוח ctile שנוצר על ידי השרירים דומה לזה שדווח על ידי אחרים בתחילת והסיום של הניסוי 15. afferents כישור השריר זוהו פונקציונלי בהכנה זה על ידי מחפש אתנחתא אופיינית בירי בתגובה לעווית התכווצות (איור 2), כמו גם את העליות בתדירות מיידית הצפויות בתגובה לשינויים באורך (איור 3). מניסיוננו, רוב afferents שהופעלה בתנאי שליטה היא afferents כישור שריר. אורכו של העצב נשמר בהכנה זו (~ 7 מקסימום מ&quot;מ) הוא לא מספיק זמן כדי להשתמש בהבדלי מהירות הולכה מביא לזהות תת מביא שריר 13. בנוסף, שלא כמו בחתולים ובני אדם, באמצעים של רגישות דינמית לא היו מסוגלים להבחין בבירור הקבוצה Ia והשני afferents בעכברים (לדיון נוסף ראה וילקינסון et al. 15). סוגים אחרים של afferents (כלומר., הקבוצה שלישית ורביעי) יכול להיות מזוהה בבדיקות פונקציונליות נוספות בהכנה זו, למשל על ידי הוספת חומרים כמו קפסאיצין, ATP, או ברדיקינין, ירידת pH אמבטיה, חושף את השרירים לאיסכמיה, וכו &#39;3,13,21-23 באמצעות אלקטרודות יניקה מאפשר הפעילות מתא עצב חושי מרובה שתירשם בו זמנית, דבר המגדיל את כמות הנתונים שניתן לאסוף משריר אחד. הכנה זו יכולה לשמש כדי לאמוד את ההשפעה הכוללת של ההפרעות על תגובות אוכלוסיית נוירון חושיות או התגובות של afferents המזוהות. אם צורות ספייק הן ייחודיות מספיק, עד 4 תאי עצב תחושתיים יכולה להיות מופלה על ידי תוכנה (שני Spike2 (Cambridge אלקטרוני עיצוב) ו( מכשירים לספירה Pro LabChart) ביצע באופן דומה). במקרים בהם לא יכולים להיות מופלים נוירונים, שינויים במיקום האלקטרודה או קוטר קצה יכולים בקלות להיות מיושמים. לסיכום, שריר העצבים עכבר בהכנה מבחנהני הוא גישה ניסויית פשוטה, שניתן להשתמש כדי לחקור את מאפייני התגובה של afferents החושית שרירים לדגמי הפרעות, פציעה והמחלה physicochemical שונים. בנוסף, הכנה זו היא אידיאלית לנצל את כלים רבי עוצמה הגנטיות הזמינים בעכברים, כולל בעלי חיים מהונדסים וכלים optogenetic.

שרירי שלד מעוצבבים על ידי נוירונים חושיים המספקים את מערכת העצבים המרכזית עם מידע חשוב על סביבת השריר. צירים שריר מאוד מתמחים מבנים במארז מורכבים מסיבי שריר intrafusal הממוקמים במקביל לסיבי שריר extrafusal. צירים מעוצבבים על ידי הקבוצה Ia והשני afferents שלקודד שינויים באורך שריר וטונוס סיבי intrafusal מוסדרים באופן דינמי על ידי הנוירונים מוטוריים גמא innervating 1. afferents Ib הקבוצה ממוקמות בין סיבי שריר והוספות גידם ורגישים לשינויים בכוח שרירים, למשל בעת התכווצות שרירים 2. Ia הקבוצה, Ib והשני afferents לספק משוב הפרופריוצפטיבית שמסייע בשליטה מוטורית מתאימה. אוכלוסיות נוספות של afferents שרירים הממוקמים ברחבי השריר (קבוצה שלישית ורביעי) משמש כדי לאותת הצטברות המטבוליט, הנוכחות של גירויי nociceptive, וטמפרטורת שריר <sup&gt; 3. מידע חושי שריר זה הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס, מניעת נזק לשרירים וויסות תנועה. afferents השריר יכולה לשנות את דפוסי הירי שלהם המבוססת על הניסיון קודם 4. הפעלה של nociceptors יכולה להוביל לגיוס של מדינות כאב כרוניות 5 ואיתות סוטה מproprioceptors השריר יכול להוביל לבעיות של שיווי משקל או תנועה 6. אנו משתמשים בשרירי עצבים מבודדים בהכנת מבחנה ללמוד את התגובה של הסופים קולט נוירון חושי שרירים מעכברים בוגרים משני המינים (המוצגים הם תגובות של 2-4 חודש C57Bl / 6 עכברים ישנים). העכבר הוא המין הגנטי המודל למחקרים ביונקים. הכנה זו דורשת הבידוד של הסניף העמוק peroneal של העצב משית ושרירי longus digitorum פושטי (אדי), שרירים עווית מהירים של קבוצת peroneal נמצאת בחלק הלטרלי של הרגל התחתונה. EDL משמש לעתים קרובות כדי לחקור את תכונות התכווצות השרירים 7-9, יש tendons כי הם קלים לבודד והוא קטן מספיק כדי לאפשר אספקת חמצן diffusive נאותה במנוחה ועם מחזורי חובת התכווצות סבירים 10. שרירים אחרים באזור זה (לדוגמא soleus וקדמי tibialis) הם בגודל דומה והכנה זה יכול לשנות בקלות כדי להקליט מafferents משרירים אלו. האלקטרודה יניקה ממוקמת על קצה החתך של העצב להקליט ירי מביא חושי שריר. ניתן לזהות נוירונים בודדים ונותחו על פי צורת ספייק שלהם באמצעות תוכנת מיון ספייק. גירוי אלקטרודות באמבטיה או על העצב יכול לשמש כדי לעורר התכווצות שרירים. אורך שריר וכוח יכולים להיות מבוקר ונמדדו באמצעות מערכות זמינות מסחרי. דומה במבחנה הכנות כבר בשימוש במכרסמים כדי ללמוד afferents שריר הקבוצה השלישית והרביעית בחולדה 11 EDL, afferents ציר הקבוצה Ia והשנייה בשריר בוהן העכברוש הרביעי lumbrical 12 ושרירים הקבוצה שלישי והרביעיים afferents בtהוא שריר plantar העכבר 13. מערכת במבחנה יש את היתרונות של נגישות תרופתית ושליטה ישירה של משתני perfusate וphysiochemical כמו טמפרטורה וחומציות. גישה במבחנה מבטלת את הפוטנציאל in vivo מבלבל מעמד זלוף הרדמה ושרירים. בעוד הכנת שריר העצבים מאפשרת לחקר התגובה הישירה של ההפרעות בafferents, היכולת ללמוד אפנון efferent גמא של רגישות ציר ותגובות משולבות אחרות שאפשרי עם in vivo 14 או ex vivo 3 הכנות הוא הקריבה כ אין גופי תא עצביים בהכנה זו. הכנה זו שימשה בעבר כדי לאפיין את התגובה של afferents כישור שריר עכבר לסוללה של רמפה ולהחזיק מתיחות ורעידות ונקבע כי respons מביא ציר העכברes היו דומה לאלו שדווחו במינים אחרים כגון חולדות, חתולים, ובני אדם. תגובות מביא ציר עכבר נמצאו דומה בשתי מעלות צלזיוס 24 ו34 ° טמפרטורות האמבטיה C, אם כי ב34 ° שיעורי ירי מוחלט C היו מהירים יותר וafferents היו יותר מסוגל להגיב לאורך מהר משנה 15. אנו מתארים בהמשך כיצד הכנה זו יכולה לשמש כדי לזהות וללמוד את afferents כישור שריר. יתר על כן, הכנה זו יכולה בקלות להיות שונה כדי ללמוד את התגובה של תת מביא שריר אחר 13, כדי להשוות את המאפיינים של afferents החושית בתגובה למדינת תרופה או מחלה או משתנה שונים אחרים (למשל, גיל, מין, נוקאאוט גן).

<table><tbody><tr><td>Force and Length Controller &amp;amp; Tissue Bath</td><td>Aurora Scientific, Inc.</td><td>300C-LR &amp;amp; 809B-IV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &amp;amp; Easy Load II Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07523-80 &amp;amp; EW-77200-60</td><td></td></tr><tr><td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &amp;amp; Headstage Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 1800; 700000 &amp;amp; 700500</td><td></td></tr><tr><td>Simulator</td><td>Grass&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; Aurora Scientific, Inc.</td><td>S88&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; 701 C</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Swift</td><td>892070</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Source</td><td>Fiberlite</td><td>Model 190</td><td></td></tr><tr><td>Analog to Digital Board</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition &amp;amp; Analysis Software</td><td>AD Instruments</td><td>LabChart Pro 7</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Holder</td><td>A-M Systems</td><td>672445</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Glass</td><td>Dagan</td><td>SA16</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td></td></tr><tr><td>Isoflourane</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>18627</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Surgical Tools&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Large Dissecting Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14014-17</td><td></td></tr><tr><td>Large Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Large Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>#55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharp Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Silk Suture</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF&lt;br/&gt; (Low Calcium solution is equilibriated with 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05; SIF is equilibriated with 100% O2 gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>230391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium gluconate</td><td>Sigma</td><td>S2054-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>S8282-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

עצב סנסורי שריר innervating צירים שרירים ואיברי גיד Golgi לקודד אורך וכוח שינויים חיוניים לפרופריוספציה. סיבים הביא נוספים לפקח על מאפיינים אחרים של סביבת השריר, כוללים הצטברות המטבוליט, טמפרטורה, וגירויים nociceptive. בסך הכל, הפעלה לא תקינה של תאי עצב תחושתיים יכולה להוביל להפרעות תנועה או תסמונות כאב כרוניות. אנו מתארים את הבידוד של longus digitorum פושטי השריר (EDL) ועצב למחקר במבחנה של תגובות מביא עורר קטע בעכבר המבוגר. פעילות חושית נרשמה מהעצבים עם האלקטרודה יניקה וניתן לנתח afferents בודדת באמצעות תוכנת מיון ספייק. במבחנה הכנות לאפשר למחקרים מבוקרים היטב על afferents החושית ללא בלבול הפוטנציאלי של הרדמה או זלוף השריר שינה. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזהות ולבחון את התגובה של afferents כישור השריר למתוח. חשוב לציין,הכנה זו תומכת גם במחקר של סוגים אחרים של afferents שריר, מאפייני התגובה הבאים יישום סמים ושילוב של גישות חזקות גנטיות ומודלי מחלה בעכברים.

התגובה של afferents שריר ניתן להקליט הבא מגוון של הפרעות, תלוי באיזה מביא תת סוג נחקר. תגובות נציג של afferents כישור שריר להתכווצות שרירים ורמפה ולהחזיק מתיחה מוצגות כאן. מקבלות התכווצויות לזהות מביא כמביא ציר, תפרפרו פעם אחת בכל שנייה (0.5 רוחב פולס אלפיות שני) כדי לראות אם יש הפסקה בירי במהלך 18,19 התכווצות. איור 2 מראה עקבות נציג של פעילות עצבית ומתח שרירים במהלך התכווצויות עווית אלה. אין פעילות עצבית שנצפתה במהלך צירים עווית, כצפוי לafferents ציר. אם מביא נרשם היה מביא איבר גיד הקבוצה Ib Golgi, עלייה בירי שיעור במהלך ההתכווצות שניתן היה לצפות. בתנאי השליטה ביותר afferents עם דפוס קבוע ירי (~ 12 דחפים / sec ב24 ° C ו~ 32V דחפים / sec ב34 ° C) הם afferents כישור שריר. קבוצת משנה של afferents הציר יהיה רק באש במהלך המתיחה (בידיים שלנו ~ 11% מafferents הציר) 15. איור 3 א מציג עקבות גלם נציג של שתי afferents כישור השריר מגיבות לרמפה ולהחזיק מתיחה המיוצרת על ידי בקר הכוח ואורך. תכונת ספייק היסטוגרמה של LabChart משמשת לזיהוי ולנתח אותם בתדר הירי של שני נוירונים בודדים בנפרד (איורים 3 ב-C3). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 שריר מבודד הכנה) longus digitorum פושטי (EDL) וגיד הנשה innervating הם רכובים באמבטית רקמות מבודדת perfused עם נוזל החומץ סינטטי ביניים (SIF). מגבר תאי מחובר לsuctiעל האלקטרודה רושמת פעילות עצבית. כוח כפול ואורך בקר עם תוכנת בקרה ואמצעים מתאימות בכוח שריר ואורך. אלקטרודות האמבטיה הרקמות לספק גירויים כדי לייצר עווית או התכווצויות tetanic. שאיבת מים מחוממים בערוצי צלחת אמבטיה פנימיים שולטת בטמפרטורת האמבטיה רקמות. B) משך האלקטרודה יניקת זכוכית עם תיאור ~ 3 מ&quot;מ קצה מחודד. C) מוגדל של צורת הקצה האידיאלית עבור האלקטרודה היניקה כי הוא מיוצר באמצעות microforge. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 ציר מביא תגובה לעווית התכווצות. Activit עצביy (זכר עליון) ומתח שרירים (זכר תחתון) מ30 התכווצויות עווית הם על גבי עם עקבות חופפות העליונים בשחור. פעילות מביא עוצרת בעליית מתח מושרה התכווצות, אשר היא תגובה אופיינית לafferents כישור שריר. Bracket וחץ מעל העקבות העליונים מציינים את הזמן במהלך התכווצות כאשר הפעילות מושהה. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3 ציר מביא תגובה לרמפה והחזיקו למתוח) פעילות עצבית גלם של שתי afferents (זכר עליון) במהלך רמפה ולהחזיק מתיחה להחיל את אדי (אורך שריר מוצג בזכר תחתון). B) תדירות הזרקה מיידית (Inst. האב, דחפים לשנייה) של היחידה המציגה את הפעילות בo L מ( מוצגים בכחול). C) Instantaneתדירות היחידות הארגוניות ירי של היחידה קטנה יותר שרק שריפות במהלך המתיחה (המוצגת בכתום). שני היחידות להפגין הסתגלות תדירות ספייק במהלך מתיחה אופייני לafferents כישור שריר 1.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

עצב סנסורי שרירים מעורב באיתות proprioceptor וגם לדווח על אירועים ממלכתיים ופציעה קשורה חילוף חומרים. אנו מתארים עכבר בוגר בהכנת שריר עצבים מבחנה ללימודים בafferents שרירים מופעל מתיחה.

<em&gt; במבחנה</emהכנת שרירים עצבים&gt; עכבר למבוגרים ללימוד מאפייני ירי afferents השריר

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

an-vitro-adult-mouse-muscle-nerve-preparation-for-studying-firing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

17.0K Views.  San José State University.  עצב סנסורי שרירים מעורב באיתות proprioceptor וגם לדווח על אירועים ממלכתיים ופציעה קשורה חילוף חומרים. אנו מתארים עכבר בוגר בהכנת שריר עצבים מבחנה ללימודים בafferents שרירים מופעל מתיחה. 

Video: An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

The spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural function because it is a neuron of the central nervous system with the unique properties of (1) having readily identifiable targets (the muscle fibers) and therefore having a very well-known function (to control muscle contraction); (2) being the convergent target of many spinal and descending networks, hence the name of "final common pathway"; and (3) having a large soma which makes it possible to penetrate them with sharp intracellular electrodes. Furthermore, when studied in vivo, it is possible to record simultaneously the electrical activity of the motoneurons and the force developed by their muscle targets. Performing intracellular recordings of motoneurons in vivo therefore put the experimentalist in the unique position of being able to study, at the same time, all the compartments of the "motor unit" (the name given to the motoneuron, its axon, and the muscle fibers it innervates1): the inputs impinging on the motoneuron, the electrophysiological properties of the motoneuron, and the impact of these properties on the physiological function of the motoneurons, i.e. the force produced by its motor unit. However, this approach is very challenging because the preparation cannot be paralyzed and thus the mechanical stability for the intracellular recording is reduced. Thus, this kind of experiments has only been achieved in cats and in rats. However, the study of spinal motor systems could make a formidable leap if it was possible to perform similar experiments in normal and genetically modified mice.
For technical reasons, the study of the spinal networks in mice has mostly been limited to neonatal in vitro preparations, where the motoneurons and the spinal networks are immature, the motoneurons are separated from their targets, and when studied in slices, the motoneurons are separated from most of their inputs. Until recently, only a few groups had managed to perform intracellular recordings of motoneurons in vivo2-4 , including our team who published a new preparation which allowed us to obtain very stable recordings of motoneurons in vivo in adult mice5,6. However, these recordings were obtained in paralyzed animals, i.e. without the possibility to record the force output of these motoneurons. Here we present an extension of this original preparation in which we were able to obtain simultaneous recordings of the electrophysiological properties of the motoneurons and of the force developed by their motor unit. This is an important achievement, as it allows us to identify the different types of motoneurons based on their force profile, and thereby revealing their function. Coupled with genetic models disturbing spinal segmental circuitry7-9, or reproducting human disease10,11, we expect this technique to be an essential tool for the study of spinal motor system.

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

This new method permits the simultaneous intracellular recording of a single adult mouse motoneuron and the measurement of the force produced by its muscle fibers. The combined investigation of the electrical and mechanical properties of motor units in normal and genetically modified animals is a breakthrough for the study of the neuromuscular system.

הקלטה תאית סימולטני של Motoneuron מותנה והחיל הופק על ידי יחידת המנוע שלה בעכבר למבוגרים<em&gt; בחי</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

באפיון פונקציונלי מבחנה של עכבר המעי הגס מביא Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Medicine

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative to understand the cellular and molecular changes involved in maintaining and repairing NMJs. For this purpose, we have developed a method to reliably and consistently examine regenerating NMJs in mice. This nerve injury method involves crushing the common fibular nerve as it passes over the lateral head of the gastrocnemius muscle tendon near the knee. Using 70 day old female mice, we demonstrate that motor axons begin to reinnervate previous postsynaptic targets within 7 days post-crush. They completely reoccupy their previous synaptic areas by 12 days. To determine the reliability of this injury method, we compared reinnervation rates between individual 70 day old female mice. We found that the number of reinnervated postsynaptic sites was similar between mice at 7, 9, and 12 days post-crush. To determine if this injury assay can also be used to compare molecular changes in muscles, we examined levels of the gamma-subunit of the muscle nicotinic receptor (gamma-AChR) and the muscle-specific kinase (MuSK). The gamma-AChR subunit and MuSK to are highly upregulated following denervation and return to normal levels following reinnervation of NMJs. We found a close relationship between transcript levels for these genes and innervation status of muscles. We believe that this method will accelerate our understanding of the cellular and molecular changes involved in repairing the NMJ and other synapses.

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

עצב שׁוֹקִיתִי השיטה פגיעה: A Assay אמין כדי לזהות מבחן הגורמים תיקון Neuromuscular הצומת

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

אין ויוו מדידות אלקטרופיזיולוגיות של פוטנציאל הפעולה השריר מורכב מ Forelimbs העכבר דגמים של ניוון מוטורי נוירון

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

אפיון צמתים עצביים-שריריים בעכברים על ידי מיקרוסקופיה משולבת קונפוקלית וסופר-רזולוציה

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video