Name: an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents
Uploaded: 2014-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Entsprechenden nationalen und institutionellen Ethik sollte vor der Durchführung von Tierversuchen gewonnen werden. 1. Entfernung von EDL Muskel und Nerv <ol><li> Wiegen und tief betäuben einen erwachsenen Maus mit inhalativen Isofluoran mit einem Verdampfer mit 5% Isofluran sowie ein 1,5 l / min Sauerstoffflussrate oder eine Glasglocke mit Isofluoran getränkten Watte auf der Unterseite. </li><li> Sicherzustellen, dass die Maus tief anästhesiert, und nicht zu einem Zehenklemm reagieren. Enthaupten schnell mit großen, geschärft einer Schere oder einem Guillotine. </li><li> Machen Sie eine ventralen Mittellinie Schnitt durch die Rippen mit einer Schere entfernen und die inneren Organe. </li><li> Die Haut des Tieres durch Greifen die Haut vom Halsbereich und ziehen vorbei an den Füßen. </li><li> Entfernen Sie die Beine, indem über den Hüften und legen Sie die Beine Haut in eine Schüssel mit kaltem (4 ° C), carbogenated (95% O 2, 5% CO 2) geringe Kalzium Hoch Magnesiumbicarbonat Kochsalzlösung contaiNing in mM: 128 NaCl, 1,9 KCl, 1,2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 0,85 CaCl 2, 6.5 MgSO 4, und 10 Glucose (pH 7,4 ± 0,05) 16. Der niedrige Kalzium Hochmagnesiumlösung hemmt die synaptische Übertragung während der Präparation. </li><li> Legen Sie die Beine dorsale Seite nach oben in die Schüssel und stecken Sie die Beine und Hüften nach unten mit Nadeln oder Insekten Pins, so dass die Knie-und Knöchelgelenke im 90 ° Winkel sind. Legen Sie einen Stift an jedem Ende der Füße und auf jeder der vorderen und hinteren Oberschenkel einen Stift, um das Gewebe an Ort und Stelle zu halten. </li><li> Castroviejo mit Federschere, heben Sie die obere Schicht der Muskel an den Oberschenkeln und eine Mittellinie geschnitten, um den Ischiasnerv direkt unter aussetzen. Der Ischiasnerv ist knapp unter dem oberen Muskelschicht gelegen und verläuft oberhalb des Oberschenkelknochens aus seiner Ausfahrt in der Nähe von den Hüften bis es Niederlassungen in den gemeinsamen Wadenbein und Schienbeinnerv kurz vor dem Kniegelenk. </li><li> Entfernen Sie den Muskel über dem Ischiasnerv, bis die point, bei dem die tiefen Wadenbeinnerv Zweig taucht in das flexor hallucis longus (FHL) Muskel ist sichtbar. </li><li> Mit # 55 Pinzetten, sezieren das Bindegewebe rund um den Wadenbein Zweig, um ihn von den gastrocnemius und soleus Muskeln, die an der medialen Seite der Tibia sind kostenlos. Schneiden Sie die Sehnen der gastrocnemius und soleus Muskeln und sorgfältig entfernen Sie sie aus unter dem Nerv. </li><li> Entfernen Sie die oberflächliche Muskel auf der lateralen Seite des Schienbeins zu drei verschiedene Sehnenbündel am Sprunggelenk-von medial nach lateral aussetzen: FHL, EDS und tibialis anterior (TA), wobei der EDS unterhalb der TA verborgen. </li><li> Schneiden Sie die TA Sehne am Sprunggelenk, heben Sie die TA oben und weg von der EDL, und schneiden Sie den Muskel in der Nähe der Knie, um sie zu entfernen. </li><li> Schneiden Sie den FHL-Sehne am Knöchel und heben Sie sie zurück, um den Bereich, wo der Nerv in den FHL erreichen. Schneiden Sie direkt unter diesem Punkt und entfernen ~ 2/3 der FHL Muskel. </li><li> Schneiden Sie den Ischiasnerv so nahe dem Hüftgelenk als poslich und schonend entfernen alles Nervenäste mit Ausnahme der tiefen Wadenbein Zweig. </li><li> Schneiden Sie die EDL Sehnen an beiden Knöchel-und Kniegelenke mit großen Feder Schere. </li><li> Mit einer scharfen Schere, entfernen Sie die EDL, die verbleibende FHL und Nerven aus dem umgebenden Gewebe durch einen Schnitt durch die Tibia Knochen im Knie und in der Mitte des Oberschenkels. Schneiden Sie die verbleibende Tibiaknochen, so dass nur die EDL, ein Teil der FHL und Nerven bleiben. </li></ol> 2. Montage der EDL Muskel und Nerv in das Gewebe Bath (Abbildung 1A) <ol><li> Vor Beginn des Experiments vorbereitet Gewebebad. Ständig durchströmen das Bad mit Sauerstoff angereichertem (100% O 2) synthetische interstitiellen Flüssigkeit (SIF), die (in mM) 123 NaCl, 3,5 KCl, 0,7 MgSO 4, 1,7 NaH 2 PO 4, 2,0 CaCl 2, NaCl 9,5 6 H 11 O ( Natriumgluconat), 5.5 Glucose, 7.5 Saccharose und 10 N-2-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2 ethanesulfonic Säure (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. Eine Fließgeschwindigkeit von 15-30 ml / min empfohlen. Gezeigt ist ein im Handel erhält Bad von 25 ml Kapazität mit zwei an der Unterseite der Wanne, brachten Gewebe Pfosten und einer Halterung für eine Kraft und Längenregler (ungefähre Abmessungen Badewanne befestigt stimulierenden Elektroden 8,5 cm x 3 cm x 1 cm; Spezifikationen siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung). </li><li> Verwenden Sie die restlichen FHL Gewebe, um das isolierte Muskelnerv behandeln und legen Sie sie in das Gewebe Badewanne. Legen Sie ein kleines Stück Sylgard auf der Unterseite der Schale und verwenden Sie ein Insektenstift durch die verbleibenden FHL Gewebe, um den Muskel zu stabilisieren. </li><li> Verwenden Sie 6-0 Seidenfäden, beide Sehnen binden und bringen ein Ende mit dem Gewebe Post und die andere mit dem Hebelarm der Kraft und Länge Controller (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Daten). Verwenden Sie den kleinsten Fadenlänge, die praktisch ist. Entfernen Sie die Insektenstift und Sylgard, nachdem Sie die Sehnen gebunden haben. HINWEIS: Um einfach zu erleichternVerbindung mit dem Hebelarm ein kleines Stück Draht in einen &quot;J&quot; förmigen Haken in der Hebelarm mit Epoxy gebogen und befestigt werden. Das Nahtmaterial kann dann mit dem Draht verbunden werden, anstatt in die kleine Öffnung am Hebelarm fädelt. </li><li> Machen Saugelektroden von SA 16 Glas indem Sie zuerst eine Glasmikropipette Puller (Heat = 286, Ziehen = 0, Velocity = 150, Time = 200); brechen Sie die Spitze zurück und manuell schleifen es auf einem Schleifstein, bis es zu einem 3 mm Konus. Schmelzen Sie die Spitze mit einem Mikroschmiede auf die gewünschte Innendurchmesser der Spitze von 10 - 100 um abhängig von dem Bereich der Nerven man von probieren möchte (siehe den 1B-1C für Elektrodenschaltplan und Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Produktinformationen). </li><li> Füllen Sie ein Glas vorgefertigten Saug-Elektrode mit der inneren Silberdraht mit SIF. </li><li> Absaugen des geschnittenen Endes des Nervs in der Elektrode und eine Verbindung zu dem positiven Anschluss des Differenzverstärkers. Wickeln Sie die Elektrode mit einem chlorierten SilberDraht, der mit dem negativen Port des heads verbindet. Erden Sie die SIF-Bad, indem Sie einen zweiten chlorierten Silberdraht aus dem Bad zu Boden-Port des heads ist. Auch erden Infusionsschlauch an den Faraday-Käfig an mehreren Punkten zu elektrischen Störungen über die Perfusion Pumpen eingeführt mildern. </li><li> Stimulieren die Muskeln über die auf beiden Seiten des Muskels im Gewebe Bad, ein Zucken Kontraktion induzieren montiert Elektroden. Alternativ stellen eine stimulierende Elektrode, die auf dem geschnittenen Ende des Nervs. Erhöhen Sie die anregende Spannung, bis eine Spitzenkontraktionskraft beobachtet und dann erhöhen die Spannung um weitere 15% auf supraSpannung (0,5 ms Pulsbreite) zu erreichen. Weiterhin Twitch Kontraktionen im supramaximaler Spannung mit einer 10 sec Rest dazwischen, sondern variieren die Länge des Muskels bis zu einem Spitzenkontraktionskraft erreicht ist, um die optimale Länge (L o) des Muskels zu finden. Alle Längen Rampen und Schwingungen mit dem Muskel an diesem Leng startenth. </li><li> Damit das Muskelnerven Zubereitung in dem Bad für mindestens 1 Stunde bleiben, bevor nachfolgende Datenerfassung zu ermöglichen, das Gewebe um die Badtemperatur zu erreichen und für die normale synaptische Übertragung zu erholen folgende Zerlegung in einem niedrigen Calciumlösung. </li><li> Um die Daten an einem anderen als Raumtemperatur Temperatur zu sammeln, legen Sie einen Temperaturfühler in das Gewebe Bad in der Nähe des Muskels. Langsam bringen das Bad auf Temperatur durch Pumpen erwärmte Wasser durch das Gewebe Bad Bodenplatte. Wickeln Ton mikrowellen Heizkissen um die SIF Reservoir zu helfen, eine gleichbleibende Temperatur. </li></ol> 3. Datensammlung <ol><li> Um eine afferente als afferenten identifizieren, notieren Sie die neuronale Aktivität während der wiederholten Kontraktionen Zucken von einem 0,5 ms supraSpannungsReiz produziert geliefert einmal pro Sekunde. HINWEIS: Muskelspindel-Afferenzen sollten während der Kontraktion Zucken 18,19 (Abbildung 2) zu unterbrechen. </li><li> Verwenden data Erfassungssoftware zu Längenänderungen bei unterschiedlichen Geschwindigkeiten und zu unterschiedlichen Längen gelten. Verwenden Sie ein benutzerdefiniertes Skript, um diese Aufgabe zu automatisieren (siehe Zusatzinformationen für einen Screenshot des Skripts und Anweisungen, wie man die Strecken gegeben anpassen). Anlegerampen-Halte-Abschnitte von 4 Sekunden bei Dehnungslängen von 2,5%, 5% und 7,5% L o und Dehnungsgeschwindigkeiten von 20, 40 oder 60% L o / s 15. HINWEIS: Siehe Bedienungsanleitung für spezifische Kraft und Länge Controller für notwendig Spannungs-Millimeter-Umrechnungsfaktor. </li><li> Am Ende des Experiments bestimmen Muskel Gesundheit bei 24 ° C mit maximalen isometrischen tetanischen Kontraktionen (500 ms Zug, Zug 120 Hz-Frequenz, 0,5 ms Pulsbreite, supraSpannung). Vergleichen Sie die Spitzenkontraktionskraft zu früher berichteten Werten (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

<ol>
	<li>Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+1,+The+Nervous+System,+Motor+Control.">Section 1, The Nervous System, Motor Control.</a> Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).</li><li>Houk, J., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Golgi+tendon+organs+to+forces+applied+to+muscle+tendon.">Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon.</a> J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).</li><li>Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotyping+of+group+III+and+IV+muscle+afferents+in+mouse.">Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse.</a> J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).</li><li>Nichols, T. R., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-bridge+mechanisms+underlying+the+history-dependent+properties+of+muscle+spindles+and+stretch+reflexes.">Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).</li><li>Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociception+from+skeletal+muscle+in+relation+to+clinical+muscle+pain.">Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain.</a> Pain. 54, 241-289 (1993).</li><li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+skeletal+muscle+fibers+of+mice+following+lengthening+contractions.">Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions.</a> J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Barclay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diffusive+O(2)+supply+to+isolated+preparations+of+mammalian+skeletal+and+cardiac+muscle.">Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).</li><li>Taguchi, T., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscular+thin-fiber+receptors+in+aged+rats+recorded+in+vitro.">Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro.</a> European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).</li><li>Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride-sensitive+channels+are+a+major+contributor+to+mechanotransduction+in+mammalian+muscle+spindles.">Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles.</a> J Physiol. 588, 171-185 (2010).</li><li>Wenk, H. N., McCleskey, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+skeletal+muscle-nerve+preparation+and+in+vitro+model+of+ischemia.">A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia.</a> J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).</li><li>Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaliplatin+neurotoxicity+of+sensory+transduction+in+rat+proprioceptors.">Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors.</a> J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+muscle+spindle+afferents+in+the+adult+mouse+using+an+in+vitro+muscle-nerve+preparation.">Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation.</a> PLoS One. 7, e39140 (2012).</li><li>Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicuculline-sensitive+primary+afferent+depolarization+remains+after+greatly+restricting+synaptic+transmission+in+the+mammalian+spinal+cord.">Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord.</a> J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).</li><li>Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+properties+of+mouse+sensory+neurons+innervating+hairy+skin.">Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin.</a> J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).</li><li>Matthews, B. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+muscle.">Nerve endings in mammalian muscle.</a> J Physiol. 78, 1-53 (1933).</li><li>Hunt, C. C., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+receptor+discharges+during+muscle+contraction.">Stretch receptor discharges during muscle contraction.</a> J Physiol. 113, 298-315 (1951).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+analysis+of+isolated+skeletal+muscle.">Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hoheisel, U., Rein&#246;hl, J., Unger, T., Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+capsaicin+activate+mechanosensitive+group+IV+muscle+receptors+in+the+rat.">Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat.</a> Pain. 110, 149-157 (2004).</li><li>Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscle+thin-fiber+sensory+receptors+recorded+from+rat+muscle-nerve+preparations+in+vitro+after+eccentric+contraction.">Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction.</a> J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).</li><li>Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

Das Ziel dieses Artikels war es, ein Verfahren zur Aufzeichnung von Muskelspindel-Afferenzen in einer isolierten Maus-Muskel-Nerv Zubereitung zu beschreiben. Wir haben festgestellt, dass der Maus Spindel Afferenzen reagieren ähnlich wie die von Ratten, Katzen und Menschen 15 zu dehnen, und anderen Laboratorien haben Mäuse als Modellorganismen verwendet, um sensorische Neuronen sowohl im Muskel-und Haut in vitro-Studie (zB 3,13) . Muskel sensorischen afferenten für mindestens 6-8 Stunden bei jeweils 24 ° C und 34 ° C aufgezeichnet. Zur Minimierung der Handhabung der EDL und Nerven, verwenden Sie den verbleibenden Teil der FHL, um das Gewebe zu behandeln, wenn möglich. Nach der Präparation, warten Sie mindestens 1 Stunde bis Datensammlung zu starten, damit das Gewebe, um zu baden und Temperatur für den normalen synaptischen Übertragung ins Gleichgewicht zu erholen. Zuvor war Muskel Gesundheit auf einer Untergruppe von Muskeln in dieser Zubereitung durch Bestimmen, dass der maximale tetanische Gegen verifiziertctile Kraft durch die Muskeln erzeugt wird, ist ähnlich derjenigen von anderen am Anfang und am Ende des Experiments 15 gemeldet. Muskelspindel Afferenzen wurden funktionell in dieser Zubereitung durch die Suche nach einer charakteristischen Pause beim Brennen entsprechend der Kontraktion twitch (Abbildung 2) sowie die erwarteten Momentanfrequenz erhöht sich in Abhängigkeit von Änderungen Länge (Figur 3) identifiziert. Nach unserer Erfahrung die meisten Afferenzen, die in Kontrollbedingungen Fire Muskelspindel-Afferenzen. Die Länge der in dieser Zubereitung (~ 7 mm maximal) beibehalten Nerven ist nicht lang genug, um Unterschiede afferenten Leitungsgeschwindigkeit verwenden, um Muskel afferenten Subtypen 13 zu identifizieren. Zusätzlich, anders als bei Katzen und Menschen, Maßnahmen der dynamischen Empfindlichkeit nicht in der Lage, klar zu unterscheiden Gruppe Ia und II Afferenzen in Mäusen (für eine weitere Diskussion siehe Wilkinson et al. 15). Andere Subtypen von Afferenzen (dh., Gruppe III und IV) können mit zusätzlichen funktionellen Tests in dieser Zubereitung identifiziert werden, beispielsweise durch Zugabe von Substanzen wie Capsaicin, ATP oder Bradykinin, abnehm Bad-pH, Aussetzen der Muskel Ischämie usw. 3,13,21-23 Verwendung Saugelektroden können die Aktivität von mehreren sensorischen Neuronen auf einmal aufgezeichnet werden kann, was die Menge der Daten, die von einer einzelnen Muskel gesammelt werden kann, erhöht. Diese Vorbereitung kann verwendet werden, um die Gesamtwirkung einer Störung der sensorischen Neuronenpopulation Antworten oder die Antworten der identifizierten Afferenzen messen werden. Wenn die Spitze Formen sind einzigartig genug ist, können bis zu 4 sensorischen Neuronen durch Software unterschieden werden (beide Spike2 (Cambridge Electronic Design) und LabChart Pro (AD Instruments) haben ähnlich durchgeführt). In Fällen, bei denen Neuronen nicht unterschieden werden, können Änderungen in der Elektrodenanordnung oder Spitzendurchmesser leicht implementiert werden. Zusammenfassend ist die Maus Muskel-Nerv in vitro preparation ist eine einfache experimentelle Ansatz, der verwendet werden kann, um die Reaktionseigenschaften des Muskels sensorischen afferenten verschiedenen physikalisch-chemischen Störungen, Verletzungen und Krankheitsmodellen untersucht werden. Zusätzlich wird dieses Präparat ideal geeignet, um die Vorteile der leistungsfähigen genetischen Werkzeuge zur Verfügung, bei Mäusen, einschließlich der transgenen Tiere und optogenetischen Werkzeugen zu nehmen.

Skelettmuskeln werden von sensorischen Neuronen, die das zentrale Nervensystem mit wichtigen Informationen über den Muskel-Umgebung bieten innerviert. Muskelspindeln sind hochspezialisierte eingekapselten Strukturen intrafusale Muskelfasern, die parallel extrafusalen Muskelfasern zusammengesetzt sind. Spindeln von Gruppe Ia und II Afferenzen, die Veränderungen in der Muskellänge und intrafusalen Faser Ton wird dynamisch durch innervier Gamma-Motoneuronen 1 geregelt kodieren innerviert. Gruppe Ib Afferenzen zwischen Muskelfasern und die Sehnenansätze angeordnet und sind empfindlich gegenüber Veränderungen der Muskelkraft, beispielsweise während der Muskelkontraktion 2. Die Gruppe Ia, Ib und II Afferenzen bieten propriozeptiven Rückmeldungen, die in den entsprechenden Motorsteuerung unterstützt. Weitere Populationen von Muskel Afferenzen in der gesamten Muskel befindet (Gruppe III und IV) dienen Metabolit Aufbau, das Vorhandensein von nozizeptiven Reize und Muskeltemperatursignal <sup&gt; 3. Dieser Muskel sensorische Informationen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase, verhindert Muskelschäden und Regel Bewegung. Muskel Afferenzen können ihre Feuermuster, basierend auf früheren Erfahrungen 4 zu ändern. Aktivierung von Nozizeptoren können auf die Induktion von chronischen Schmerzzuständen und 5 abweichende Signalisierung von der Muskel Propriozeptoren führen kann, um Probleme mit dem Gleichgewicht oder Bewegungs 6 führen. Wir verwenden eine isolierte Muskelnerv in vitro Vorbereitung, um die Reaktion des Muskels sensorischen Neuronen Rezeptor Endungen von erwachsenen Mäusen beider Geschlechter zu studieren (abgebildet sind Antworten 2-4 Monate alten C57BL / 6 Mäuse). Die Maus ist das Modell genetische Spezies für Studien bei Säugetieren. Diese Vorbereitung erfordert die Isolierung des tiefen Wadenbein Zweig der Ischiasnerv und dem extensor digitorum longus (EDL) Muskels, ein schnell zuckenden Muskel der Peronealgruppe im lateralen Teil des Unterschenkels gefunden. Die EDL wird oft verwendet, um die Muskelkontraktionseigenschaften 7-9 zu studieren, hat tendons, die einfach sind, zu isolieren und ist klein genug, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung Diffusions in Ruhe und mit vernünftigen Kontraktion Arbeitszyklen 10 zu ermöglichen. Andere Muskeln in diesem Bereich (beispielsweise soleus und tibialis anterior) von ähnlicher Größe sind und diese Zubereitung kann leicht modifiziert werden, um von Afferenzen dieser Muskeln aufzunehmen. Eine Saugelektrode auf das Schnittende des Nervs zu Muskel sensorischen afferenten Brenn aufnehmen platziert. Einzelnen Neuronen identifiziert und basierend auf ihrer Spitzenform mit Spitze Sortiersoftware analysiert. Stimulationselektroden in der Badewanne oder auf den Nerv kann verwendet werden, um die Muskelkontraktion hervorzurufen. Muskellänge und Kraft gesteuert und gemessen unter Verwendung von kommerziell verfügbaren Systemen werden. Ähnliche In-vitro-Präparate haben in Nagetieren verwendet worden, um der Gruppe III und IV Muskel Afferenzen bei der Ratte, Gruppe Ia und II Spindel Afferenzen in der Ratte vierten Zehe Lumbrikalmuskel Muskel 12 und Gruppe III und IV Muskel Afferenzen in t studieren EDL 11er Maus Fußsohlenmuskel 13. Ein in vitro-System hat die Vorteile der pharmakologischen Zugänglichkeit und direkte Steuerung des Perfusat und physikochemischen Größen wie Temperatur und pH-Wert. Ein in vitro-Ansatz eliminiert das Potenzial in vivo verwechselt der Anästhesie-und Muskeldurchblutung Status. Während die Muskelnerven Herstellung ermöglicht die Untersuchung der direkten Reaktion einer Störung auf den Afferenzen, die Fähigkeit zur Modulation der Gamma efferenten Spindel Empfindlichkeit und anderen integrierten Antworten Studie, die mit in vivo-oder ex vivo-14 3 Zubereitungen als geopfert möglich ist keine neuronale Zellkörper in dieser Zubereitung. Dieses Präparat wurde früher verwendet, um die Reaktion der Maus Muskelspindel-Afferenzen zu einer Batterie von Rampe zu charakterisieren und zu halten Dehnungen und Schwingungen und es wurde festgestellt, dass die Maus afferenten Responses waren ähnlich denen in anderen Spezies, wie Ratten, Katzen und Menschen berichtet. Maus afferenten Reaktionen gefunden wurden ähnlich sowohl 24 ° C und 34 ° C Badtemperatur zu sein, obwohl bei 34 ° C absolut Feuerraten schneller waren und die Afferenzen waren in der Lage, schneller zu reagieren Länge ändert 15. Wir beschreiben im Folgenden, wie diese Vorbereitung kann verwendet werden, zu identifizieren und zu untersuchen die Muskelspindel-Afferenzen werden. Darüber hinaus kann diese Herstellung leicht modifiziert werden, um die Reaktion der anderen Muskel afferenten Subtypen 13 zu untersuchen, um die Eigenschaften der sensorischen afferenten in Reaktion auf ein Medikament oder einen Krankheitszustand oder verschiedene andere Variablen (zB Alter, Geschlecht, Gen-Knockout) zu vergleichen.

<table><tbody><tr><td>Force and Length Controller &amp;amp; Tissue Bath</td><td>Aurora Scientific, Inc.</td><td>300C-LR &amp;amp; 809B-IV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &amp;amp; Easy Load II Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07523-80 &amp;amp; EW-77200-60</td><td></td></tr><tr><td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &amp;amp; Headstage Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 1800; 700000 &amp;amp; 700500</td><td></td></tr><tr><td>Simulator</td><td>Grass&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; Aurora Scientific, Inc.</td><td>S88&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; 701 C</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Swift</td><td>892070</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Source</td><td>Fiberlite</td><td>Model 190</td><td></td></tr><tr><td>Analog to Digital Board</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition &amp;amp; Analysis Software</td><td>AD Instruments</td><td>LabChart Pro 7</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Holder</td><td>A-M Systems</td><td>672445</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Glass</td><td>Dagan</td><td>SA16</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td></td></tr><tr><td>Isoflourane</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>18627</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Surgical Tools&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Large Dissecting Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14014-17</td><td></td></tr><tr><td>Large Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Large Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>#55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharp Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Silk Suture</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF&lt;br/&gt; (Low Calcium solution is equilibriated with 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05; SIF is equilibriated with 100% O2 gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>230391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium gluconate</td><td>Sigma</td><td>S2054-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>S8282-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Muskel sensorischen Neuronen innervieren Muskelspindeln und Golgi-Sehnenorgane kodieren Länge und Kraftänderungen wesentlich, Propriozeption. Zusätzliche Afferenzen überwachen andere Eigenschaften der Muskelumgebung, einschließlich Metaboliten Aufbau, der Temperatur und nozizeptiven Reize. Insgesamt kann abnormale Aktivierung von sensorischen Neuronen von Bewegungsstörungen oder chronischen Schmerzsyndromen führen. Wir beschreiben die Isolierung des extensor digitorum longus (EDL) Muskel-und Nerven für in-vitro-Studie von Dehnungs-evozierte zuführenden Reaktionen in der erwachsenen Maus. Sensorischen Aktivität von Nerven mit einem Saug-Elektrode erfasst und einzelnen Afferenzen kann mit Spike-Sortiersoftware analysiert werden. In-vitro-Präparate erlauben eine gut kontrollierte Studien zur sensorischen Afferenzen ohne die möglichen verwechselt der Anästhesie oder verändert Muskeldurchblutung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu identifizieren und testen Sie die Reaktion der Muskelspindel-Afferenzen zu strecken. Wichtig ist,diese Vorbereitung unterstützt auch die Studie von anderen Subtypen der Muskel Afferenzen, Antworteigenschaften nach der Arzneimittelanwendung und den Einbau von leistungsfähigen genetischen Ansätzen und Krankheitsmodellen in Mäusen.

Die Reaktion des Muskels Afferenzen kann nach einer Vielzahl von Störungen aufgezeichnet werden, je nachdem, welche afferenten Subtyp untersucht wird. Vertreter Reaktionen der Muskelspindel-Afferenzen die Muskelkontraktion und Rampe und halten Strecke werden hier gezeigt. Um eine afferente als afferenten identifizieren twitch Kontraktionen werden einmal pro Sekunde (0,5 ms Pulsbreite), um zu sehen, ob es eine Pause in der Brenn während der Kontraktion 18,19 gegeben. Figur 2 zeigt eine repräsentative Spur von neuronaler Aktivität und Muskelspannung während diese zuckenden Kontraktionen. Kein neuronale Aktivität während zucken Kontraktionen beobachtet, wie für Spindel Afferenzen erwartet. Wenn die aufgezeichnete afferenten eine Gruppe Ib Golgi-Sehnen-Organ afferenten eine Erhöhung Feuerrate während der Kontraktion zu erwarten. Unter Kontrollbedingungen meisten Afferenzen mit einem regelmäßigen Muster Brenn (~ 12 Impulse / s bei 24 ° C und ~ 32 Impulse / s bei 34 ° C) Sind Muskelspindel-Afferenzen. Eine Untergruppe der Spindel Afferenzen wird nur Feuer während Strecke (in der Hand ~ 11% der Spindel Afferenzen) 15. 3A zeigt eine repräsentative rohen Spur von zwei Muskelspindel-Afferenzen der Reaktion auf eine Rampe und halten Strecke durch die Kraft und Länge Controller erzeugt. Der Spike Histogramm Merkmal LabChart wird verwendet, um zu identifizieren und zu analysieren, die momentane Feuerfrequenz der beiden einzelnen Neuronen getrennt (3B-3C). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Isolierte Muskel-Präparat A) Die extensor digitorum longus (EDL) und innervierIschiasNerv in einem isolierten Gewebe Bad mit sauerstoff synthetischen interstitiellen Flüssigkeit (SIF) durchströmt montiert. Eine extrazelluläre Verstärker auf einen sucti verbundenauf der Elektrode zeichnet neuronalen Aktivität. Ein Dual-Kraft und Länge Controller-mit der entsprechenden Software-Kontrollen und Maßnahmen Muskelkraft und Länge. Die Gewebe Bad Elektroden liefern Reize zu erzeugen zucken oder tetanische Kontraktionen. Pumpen erwärmte Wasser durch interne Bad Plattenkanäle steuert die Gewebetemperatur Bad. B) gezogen Glaselektrode mit Saug ~ 3 mm verjüngten Spitze. C) Vergrößerte Darstellung der idealen Form der Spitze für die Absaugung Elektrode, die mit einem Mikroschmiede produziert wird. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. afferenten entsprechend der Kontraktion zucken. Neuronale activity (obere Kurve) und die Muskelspannung (untere Kurve) von 30 zucken Kontraktionen sind mit überlappenden oberen Spur in schwarz überlagert. Afferenten Aktivität Pausen während der Kontraktion-induzierte Spannungserhöhung, die eine charakteristische Antwort von Muskelspindel-Afferenzen ist. Klammer und Pfeil über der oberen Spur bezeichnen die Zeit während der Kontraktion, wenn die Aktivität angehalten wird. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3. afferenten Antwort während einer Rampe Rampe und Halten Stretch A) Raw neuronale Aktivität von zwei Afferenzen (obere Kurve) und halten strecken, um die EDL (untere Kurve in gezeigt Muskellänge). B) Sofortfeuerfrequenz (Inst angewendet. Fr., Impulse pro Sekunde) der Einheit zeigt Aktivität bei L o von A (in blau dargestellt). C) InstantanéOrganisationseinheiten Schussfrequenz der kleineren Einheit, die nur Brände während der Strecke (in orange dargestellt). Beide Geräte zeigen die Spitze Frequenzanpassung beim Streck, die charakteristisch für Muskelspindel-Afferenzen 1 ist.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muskel sensorischen Neuronen sind in proprioceptor Signalübertragung beteiligt und auch auf Stoffwechselzustand und Verletzungen bezogene Ereignisse zu berichten. Wir beschreiben einen erwachsenen Maus in vitro Muskel-Nerven Vorbereitung für Studien über Stretch-aktivierte Muskel Afferenzen.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Adult Maus Muskel-Nerven Vorbereitung für das Studium der Brenneigenschaften des Muskel-Afferenzen

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

an-vitro-adult-mouse-muscle-nerve-preparation-for-studying-firing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

17.0K Aufrufe.  San José State University.  Muskel sensorischen Neuronen sind in proprioceptor Signalübertragung beteiligt und auch auf Stoffwechselzustand und Verletzungen bezogene Ereignisse zu berichten. Wir beschreiben einen erwachsenen Maus in vitro Muskel-Nerven Vorbereitung für Studien über Stretch-aktivierte Muskel Afferenzen. 

Serie: An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Forschung

Neurowissenschaften

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

The spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural function because it is a neuron of the central nervous system with the unique properties of (1) having readily identifiable targets (the muscle fibers) and therefore having a very well-known function (to control muscle contraction); (2) being the convergent target of many spinal and descending networks, hence the name of "final common pathway"; and (3) having a large soma which makes it possible to penetrate them with sharp intracellular electrodes. Furthermore, when studied in vivo, it is possible to record simultaneously the electrical activity of the motoneurons and the force developed by their muscle targets. Performing intracellular recordings of motoneurons in vivo therefore put the experimentalist in the unique position of being able to study, at the same time, all the compartments of the "motor unit" (the name given to the motoneuron, its axon, and the muscle fibers it innervates1): the inputs impinging on the motoneuron, the electrophysiological properties of the motoneuron, and the impact of these properties on the physiological function of the motoneurons, i.e. the force produced by its motor unit. However, this approach is very challenging because the preparation cannot be paralyzed and thus the mechanical stability for the intracellular recording is reduced. Thus, this kind of experiments has only been achieved in cats and in rats. However, the study of spinal motor systems could make a formidable leap if it was possible to perform similar experiments in normal and genetically modified mice.
For technical reasons, the study of the spinal networks in mice has mostly been limited to neonatal in vitro preparations, where the motoneurons and the spinal networks are immature, the motoneurons are separated from their targets, and when studied in slices, the motoneurons are separated from most of their inputs. Until recently, only a few groups had managed to perform intracellular recordings of motoneurons in vivo2-4 , including our team who published a new preparation which allowed us to obtain very stable recordings of motoneurons in vivo in adult mice5,6. However, these recordings were obtained in paralyzed animals, i.e. without the possibility to record the force output of these motoneurons. Here we present an extension of this original preparation in which we were able to obtain simultaneous recordings of the electrophysiological properties of the motoneurons and of the force developed by their motor unit. This is an important achievement, as it allows us to identify the different types of motoneurons based on their force profile, and thereby revealing their function. Coupled with genetic models disturbing spinal segmental circuitry7-9, or reproducting human disease10,11, we expect this technique to be an essential tool for the study of spinal motor system.

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

This new method permits the simultaneous intracellular recording of a single adult mouse motoneuron and the measurement of the force produced by its muscle fibers. The combined investigation of the electrical and mechanical properties of motor units in normal and genetically modified animals is a breakthrough for the study of the neuromuscular system.

Gleichzeitige Intrazelluläre Aufnahme eines Lumbar Motoneuron und dem Force durch seine Motor Unit in der adulten Maus Produziert<em&gt; In vivo</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Medizin

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative to understand the cellular and molecular changes involved in maintaining and repairing NMJs. For this purpose, we have developed a method to reliably and consistently examine regenerating NMJs in mice. This nerve injury method involves crushing the common fibular nerve as it passes over the lateral head of the gastrocnemius muscle tendon near the knee. Using 70 day old female mice, we demonstrate that motor axons begin to reinnervate previous postsynaptic targets within 7 days post-crush. They completely reoccupy their previous synaptic areas by 12 days. To determine the reliability of this injury method, we compared reinnervation rates between individual 70 day old female mice. We found that the number of reinnervated postsynaptic sites was similar between mice at 7, 9, and 12 days post-crush. To determine if this injury assay can also be used to compare molecular changes in muscles, we examined levels of the gamma-subunit of the muscle nicotinic receptor (gamma-AChR) and the muscle-specific kinase (MuSK). The gamma-AChR subunit and MuSK to are highly upregulated following denervation and return to normal levels following reinnervation of NMJs. We found a close relationship between transcript levels for these genes and innervation status of muscles. We believe that this method will accelerate our understanding of the cellular and molecular changes involved in repairing the NMJ and other synapses.

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

Die Fibula Nervenverletzung Methode: Ein zuverlässiger Test zur Identifizierung und Test Faktoren, die Reparatur neuromuskulären Synapsen

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

In Vivo Elektrophysiologische Messungen der zusammengesetzten Muskel Aktionspotential aus die Vorderbeine in Maus-Modellen der Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen bei Mäusen mittels kombinierter konfokaler und hochauflösender Mikroskopie

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Ein

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video