This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516

1. Numune Hazırlama <ol><li> % 10 fetal sığır serumu ve penisilin streptomisin 50 ng / ml, 100 IU / ml ile takviye edilen DMEM kullanılarak doku kültürü şişelerinde CHOK1 hücreleri korumak. 37 ° C sıcaklıkta 5% CO2 nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin. </li><li> Hasat daha sonra 0.16 mm kadar bir kalınlığı olan bir yüzey 14 mm çaplı mikro çukuruna CHOK1 hücreleri ve plaka. 60-70% konfluansa çevresinde görüntüleme için en uygun yoğunluk için, tohum hücreleri. </li><li> 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe hücreleri,% 5 CO2. Yeşil ve tübülin izci yeşil 150 nM Lysotracker DND26 50 nM ihtiva eden bir çözelti içinde hücreleri HBSS (Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi) içindeki hücreleri üç kez yıkayın ve inkübe edilir. 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca hücrelerin inkübe edin. İsteğe bağlı adım: kuluçkalamadan önce, bir mitokondrial matris boyama boyasının (25 nM) ilave bir leke gerçekleştirir. </li><li> Herhangi bağlanmamış boya kaldırmak için HBSS&#39;de hücreleri üç kez yıkayın. Imag öncesinde taze DMEM büyüme ortamı ilave edinhücreleri ing. </li></ol> 2. Mikroskop Yapılandırmaları Video protokolde tarif parçacık takibi için mikroskop, bir ticari olarak temin edilebilir, ters çevrilmiş mikroskop (Şekil 4) şasisi üzerine monte edilir. 3D yörünge parçacık izleme Ancak ticari modülleri artık mevcuttur. <ol><li> 690 nm-1040 nm arasında ayarlanabilir bir çıkış dalga boyu aralığında, Sa femtosaniye lazer uyarım ışık kaynağı: Tutarlı Bir Bukalemun-Ultra II Ti kullanın. </li><li> Lazer ışını IR-kaplı aynalar kullanılarak mikroskop arka limanında hizalanmış olduğundan emin olun. Lazer ışını, bir kalsit doğrusal polarizörün ardından dönen yarım dalga plakası kullanılarak azaltılır. Örnek olarak, ortalama güç 0.5 mW 2 arasında olacak şekilde ışını zayıflatır. NOT: Lazer ışını, örnek düzlemde odaklanmış demetin konumunda ve yörüngesini kontrol etmek için kullanılır galvano-motor tahrikli bir çift ayna tarafından yansıtılır. Birkısa geçişli renkli aynadan yansıması sonrasında mikroskop objektif arka girmeden önce, bir ışın genişletici geçen galvanometre aynalar çıkan dengesi ayarlanmış lazer ışını genişletilmiş tipik yapılandırma (10X). </li><li> Işık yoluna yüksek sayısal açıklık su hedef (60X NA 1.2) yerleştirerek numuneden floresan ışığı toplamak. Bir ya da iki kanal konfigürasyonunda, istenen emisyon dalga boyuna göre, bir floresan filtre küpü seçin. Ayrıca yayılan floresan spektral aralığını seçmek için emisyon band geçiren filtreler kullanır. </li><li> Motorlu bir sahneye örnek yerleştirin ve objektif bir piezo-kumandayı kullanarak mikroskop objektif ince hareketini ayarlayın. </li><li> Sinyal tefrik ve dijital I / O veri toplama kartı gönderilir photomultiplier tüpler içine filtre küp ışık yönlendirin. NOT: Bilgisayar dalga I / O kartının analog çıkış ve provid vardır oluşturulantarayıcılar için ed elektronik kontrol. Fotomultiplikatörler tarayıcılar için çıkış sinyalinden foton sayma girişi ölçülür ve Floresan Dynamics SimFCS yazılımı Laboratuvarı tarafından I / O kartı üzerinden kontrol edilir. </li></ol> 3. Görüntüleme <ol><li> Sahnede hücreleri yerleştirin ve iletilen ışık aydınlatma kullanarak odaklanın. </li><li> Boya dahil olan hücreleri tespit etmek ve altında yatan mikrotübülleri görselleştirmek için raster tarama görüntüleme geçin. Vezikül hareketi varsa ilk alan tanımlayın. </li><li> Izole bir kese tespit edildikten sonra, yörünge takibi için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: <ol><li> Parçacığın boyutu izleniyor göre dairesel tarama boyutunu tanımlamak için yörüngenin yarıçapını seçin. Bir nokta Verici için, duyarlılık ve tepki maksimize etmek uyarma kirişin Noktası Yayılması Fonksiyonu (PSF) bel eşit yörüngenin yarıçapı ayarlayın. </li><li> Eksenel ayarlamaeksenel yön boyunca parçacık konumunun belirlenmesi için gerçekleştirilen iki yörünge arasındaki mesafeyi belirlemek için mesafe. 1,5-3 kat PSF bel eksenel mesafeyi ayarlayın. </li><li> Ayrıca fotoğraf ağartmak oranını belirleyecek yörüngesinin her noktasında harcanan zamanı ayarlamak için parçacığın parlaklığına göre bekleme süresini tanımlayın. 10-100 mikro-saniye arasında bir bekleme süresi kullanın. </li><li> 4-32 msn sırayla yörünge dönemleri verim ve parçacık konumunu belirlemek için bir yüksek temporal çözünürlük sağlamak için 64 veya 128, her yörüngede noktalarının sayısını ayarlayın. </li></ol></li><li> DC raster taranan görüntüde bir imleç seçim yoluyla grafiksel kullanıcı arabirimi yoluyla parçacık üzerindeki kiriş ortalamak için aynalara gönderilen ofset sinyali değiştirin. </li><li> Yörünge tarama tarama-görüntüleme gelen mikroskop moduna geçerek izlemeye başlayabilirsiniz. </li><li> Geribildirim ve veri toplama etkinleştirin. </li></ol> 4. TrajectORY Analizi <ol><li> Yörünge boyunca ve bir &quot;yoğunluk halı&quot; şeklinde, her bir zaman noktasında her bir noktada toplanan floresan görüntülemek için yazılımı kullanın. Halının boyunca alınmış yoğunluğu başka parlak nesneler ile parçacığın etkileşimi hakkında bilgi sağlar. Hem de zaman serisi şeklinde zaman foto-çoğaltıcı tüp toplanan floresan yoğunluğu (x, y ve z tarayıcılar -piezo arasında zamanla DC yerinden yani) yörünge bilgileri hem görüntülemek için yazılımı kullanın. </li><li> Yörünge ilgi sadece bir bölgeyi seçmek için zaman serisi temsil ve &#39;şiddeti halı&#39; bilgileri kullanın. </li><li> Partikül yörünge seçilmiş bir bölümünün 2D çıkıntısının görüntülemek için yazılımı kullanın. Parçacık floresan yoğunluğuna göre renk kodu yörüngesini uygun kontrolleri seçiniz. </li><li> S görüntülemek için seçeneğini seçinfloresan yoğunluğuna göre 3D makale yörünge ve renk-kod. Mikrotubullerin boyunca lizozom hareket özelliklerini görselleştirmek için denetimlerini kullanarak 3D yörünge döndürün. </li></ol>

<ol>
	<li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy.">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li><li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking.">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li><li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles.">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li><li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope.">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li><li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells.">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li><li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility.">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid.">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li><li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections.">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li><li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+maturation.">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li><li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope.">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li><li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes.">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport.">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li><li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells.">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Yüksek zamansal çözünürlüğe sahip üç boyutlu floresan parçacıkların yörüngeleri elde son yıllarda floresan mikroskopi teknikleri ve instrumentations, muazzam gelişmelere rağmen alanında bir meydan okuma kalmıştır. Yüksek zamansal çözünürlüğü, iki boyutta izleme parçacıkları elde edilmişse, eksenel yöne uzantısı genellikle, sistemin 10 bir frekans yanıtı şiddetli bir azalma getirir. Bu video protokolde iki foton mikroskop kullanılarak yüksek temporal çözünürlük (bu deneyde 32 msn) ile yaşayan bir hücre içinde üç boyutlu tek bir parçacık izleme demonstrasyon uygulaması üzerinde duruldu. Böyle bir deneyi gerçekleştirmek için gerekli kurulum lazer tarama mikroskobu gerçekleştiren laboratuarlar için genellikle mevcuttur. 3D yörünge takip için, her iki alet eklentileri hem de kontrol yazılımı commercia için, piyasada mevcutturBöyle Olympus tarafından imal edilenler gibi l lazer tarama mikroskopları. , Bu yayılan floresanın de-tarama gerektirmediği için deneysel olarak tasarım avantajlıdır olarak temin edilebilen bir yüksek güç darbeli kızılötesi lazer kaynağı kullanımı. Bunun da ötesinde, odak floresans ve foto-ağartma out azalma göz önüne alındığında, kızıl ötesi ışınlama, belirli koşullar altında 11, hücreye doğru daha iyi huylu geçmişte gösterilmiştir. İki boyutta bir flüoresan parçacığın hızlandırılmış bir hassas bir kamera kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak, herhangi bir üç boyutlu bilginin olmaması genellikle yörünge bilgilerin biyofiziksel anlamını yorumlanmasında sınırlayıcı olabilir. Örneğin, Mikrotubullerin birlikte hareket kesecikler sık mikrotübülüsler kesişim bölgelerinde 8,12 karşı çalıştırın. Bu durumda, 3B izleme tekniği kullanan bir 3D yapı 2B projeksiyonlar kullanarak limitini üstesinden gelmektedir. X, y tarifi birkaç milisaniye aşağı gidebilir ederken amacımız nanopositioner piezo cihazın zaman tepki nedeniyle, z-ekseninde hareket döneminde, yaklaşık 30 milisaniye ile sınırlıdır. Yöntemin yeri hassas gürültü oranı 4,5 &#39;için bir sinyal olarak ölçekler. Yöntemin tek belirgin sınırlama, parçacığın ortamının bütüncül bir kaybı, yani, komşu floresan kaynakları ile flüoresans parçacığın etkileşimlerin geçmişi izleme, geçici bir yoğunluk halı 13 yeniden olasılığı ile telafi edilir aynı ya da farklı tayf emisyon ya da sergiler. Bu lizozomların hareketi, ya da ya da kinesinlerin dyneins ile ilgilidir mikrotübüller boyunca harekete otomatik uğrama, kesecikler, ticari olarak temin edilebilen boya kullanılarak lekelemeden sonra canlı hücre içinde takip edilebileceğini göstermektedir. Son zamanlarda, lizozomların 2D izleme corr olduveziküller mikrotübül-mikrotübül kavşaklarda 8 de almak yolları tespit çaba mikrotübül ağının süper çözünürlüklü görüntüleme, için sevinçli. Lızozomlara 3D yörüngeleri tek yönlü hareket daha karmaşık bir davranış gösterebilir. Ortalama bir hareket, bükme büküm ve tübüller boyunca olası rotasyonlar bu yörüngeleri görülebilir, görülebilir yönetti rağmen. Bu deneyler, bu iki kritik adım belirledik: birincisi, parlak lekeli parçacıklar elde etmek için yeterince yüksek, aynı zamanda lizozomların bir işaretleme yoğunluğu elde etmek için gerekli olan, ve aynı zamanda, düşük bir parçacık yoğunluğu sağlar bireysel parçacıkların izlenmesine izin için yeterli. İki geçiş parçacıklar durumunda, mikroskop izleme sırasında bir diğerine bir parçacığın geçiş olabilir. İkinci önemli adım, makul bir denge olması izin, piksel bekleme süresinin seçimi ile ilgilidirgürültü oranı ve izleme hızı yüksek sinyal arasını doldurun. Biz izleme siklus başına 32 msn sırayla izleme hızı 1 mm / sn altındaki hızlarda hızlı yönettiği hareketi geçiren lizozomları takip etmek genellikle yeterli olduğunu gözlemledik. Özetle, yörünge izleme üç boyutlu ve &lt;40 msn floresan etiketli veziküllerin hücre içi hareket bir zamansal çözünürlüğe sahip ölçmek için sağlar. 3D yörünge izleme gibi bize farklı derece dinamik hücresel süreçlerin kromatin dinamikleri gerçek zamanlı transkripsiyon ve hücre içi ortamda plasmonik nanopartiküllerin difüzyon bir çalışma, çalışma için gelecekte istihdam edilecek potansiyeline sahiptir.

Yaklaşımlar çok sayıda, bir mikroskop kullanılarak üç boyutlu olarak floresan parçacıkların izlemek için bugüne kadar geliştirilmiştir. En ideal yaklaşımlar, tipik olarak, eksenel yönde izleme elde etmek için mikroskop emisyon optik özel modifikasyonları ile birlikte, iki boyutlu izlemek için uygun, hızlı kameraların kullanımına dayanmaktadır. Bu işlem, uygun bir zaman çözünürlüğü (10 Hz), tipik olarak zaman alıcı ve verir, ancak geleneksel bir partiküldür izlenen halinde, Z yığınlarının bir zaman dizisi gerçekleştirerek, floresan partikül izleyebilir (konfokal ya da iki ya da foton) lazer tarama mikroskobu Etkin bir geri besleme mekanizması 2 ile küçük bir raster görüntüleme bölgenin merkezinde tuttu. Kilitleme-in parçacığa fikri yörünge izleme yönteminin temelidir. Bunun yerine, bir raster dairesel bir yörünge floresan de yaklaşık tarama gerçekleştirilir. Boyunca floresans yoğunluğuyörünge tam parçacık pozisyonunu 4 lokalize. Parçacığın lokalize konumu daha sonra mikroskop tarayıcıları ve yeniden merkezi partikül yörünge konumu üzerinde harekete geçirmek için kullanılabilir. Mikroskop galvanometre tarayıcılar bir analog voltaj ile tahrik edilmektedir. Bu gerilimin AC bileşeni, bir sinüs ve dairesel bir yörünge performans sağlayacak X ve Y, tarama ayna uygulanan bir kosinüs dalgası, yani, odaklı lazer ışını ile bir yörüngeye da yapılabilir. Sinyalinin offset DC yörünge merkezinin pozisyonunu değiştirerek kolaylaştırır. Bir yörünge süresi belirlenir ve AC sinyali için dalga yapılandırıldıktan sonra, geri besleme sistemi bir sinyalin DC bileşenini güncellemek gerekir. Dedektörler toplanan floresan sinyalini okumak mümkün bir yazılım DC kapalı, tarayıcılar ve dedektörleri kontrol etmek parçacığın konumunu hesaplamak için ve güncelleme gereklidirayarlayın. Yörünge parametrelerine (boyut ve zamanlama) dikkatli bir seçim görüntüleme başarılı bir geribildirim için gerekli ve bu parametreler o izlemek için gerekli olan floresan parçacıkların özelliklerine dayalı ayarlanması gerekiyor edilir. Tekniğinin fiziksel ve matematiksel temelleri 2D ve 3D uygulamaları için geçmiş 4,5&#39;den tarif edilmiştir. Bu protokolde kısaca kurulum ana donanım bileşenlerini tanımlamak ve daha ayrıntılı parametrelerin seçimi ve numune hazırlama canlı bir hücrenin içinde yüksek bir zamansal çözünürlükte bir lizozomun yerinden takip etmemizi sağlayan tipik bir deney için gerekli.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Coherent Chamelon- ultra II TI</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor Calcite Polarizer</td><td>Melles Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometer-motor mirror</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&amp;nbsp;</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier tube</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition card</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>LFD</td><td>Global for images-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

3d orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles

Bu Video protokolün amacı, bir modifiye iki-foton mikroskop 1 kullanarak üç boyutlu floresan yörünge parçacık izleme deneyi gerçekleştirmek ve analiz nasıl tartışmaktır. Geleneksel yaklaşımlar (raster tarama veya kare bir yığın tabanlı geniş alan) aksine, 3D yörünge izleme lokalize ve yüksek uzaysal (10 nm doğruluk) ve temporal çözünürlük (50 Hz frekans tepkisi) 3D deplasman ile takip sağlar mikron 2 yüzlerce uzunluğu-ölçeklerde hareketli bir floresan parçacık. Bu yöntem takip edilecek nesnenin etrafında dairesel bir yörünge gerçekleştirmek için bir iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu donanım kontrol eden bir geri besleme algoritmasına dayanır: geri besleme mekanizması yer değiştirme kontrol ederek merkezinde floresan nesne koruyacaktır tarama ışın 3-5. Bu tekniğin avantajlarını göstermek için, biz al içinde hızlı bir hareket organelini, lizozom, takipiving hücre 6,7. Hücreler, standart protokollere göre kaplama, ve bir ticari olarak lizozom boya ile boyandı. Biz yaşayan hücrelerin içinde bir 3D yörünge izleme deneyi gerçekleştirmek için, kısaca donanım yapılandırması ve daha detaylı kontrol yazılımı tartışmak. Ayrıntılı olarak tarama mikroskobu kontrol ve parçacık etrafında kapalı bir yörüngede kirişin hareketi mümkün kılmak için gerekli parametreleri tartışırlar. Bu yöntem etkili bir şekilde canlı hücre içinde 3D mikrotübüller boyunca bir etiketli lizozom hızlı hareketi izlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteren sonucuna varmaktadırlar. Lizozomlar tipik olarak mikrotübül ağı 8 boyunca yönlendirilmiş hareketini görüntüleyen, 0.4-0.5 mm / sn aralığında hızlarla hareket edebilir.

Bu protokole göre hızlı 3D tek parçacık izleme floresan etiketli lizozomların değiştirmesini izlemek için değiştirilmiş iki-fotonlu mikroskop kullanılarak canlı hücreler içinde gerçekleştirilebilir. Yapılan deney endozom olgunlaştırma işlemi 9 sonra hücre içinde hareket eden, izole edilmiş bir lizozom izleme oluşur. Lizozomlar floresan yeşil boya kullanılarak boyandı ve 2-foton uyarma istismar 930 nm&#39;de heyecanlandırdı. Bizim veriler 32 milisaniye (Şekil 1a) bir zamansal çözünürlüğe sahip x, y, z deplasman yörüngeleri elde etmenin mümkün olduğunu göstermektedir. Halı analiz süresi (Şekil 1b) her yörünge boyunca kaydedilen yoğunluğunu gösterir. Yayılan floresanın entegre yoğunluk kaydedilebilir izleme (Şekil 2a) boyunca. Mikrotübül ağın üzerinde hareket eden bir vezikül beklenebilecek gibi yeniden 3D yörünge, yönlendirilmiş bir hareket gösterir. Birdditionally, çevredeki bölgesi (Şekil 2b) arasında bir çizgi tarama görüntü 3D yörünge ilişkilendirmek mümkündür. Bu, bir mikrotübül demetinin doğrultusu boyunca parçacık hareketini onaylar. Mitokondri hareketleri sırasında, bu organel vesikül nihai etkileşimi kaydetmek için hücreler ek olarak bir kırmızı işaret ile boyandı. Bu Mitotracker floresan emisyonu (Şekil 3b) için kaydedilen yoğunluğu halı hücresi (Şekil 3a), içindeki partikülün yörünge 3B ilişkilendirmek mümkündür. Bu durum, hücre içindeki konumunun bir fonksiyonu olarak ağ ile mitokondriyal vesikül yakınlığı etkileşimleri kayıt sağlar. &quot;Mitokondri kanalı&quot; kaydedilen emisyon zirve organelleri etkileşim yolu hakkında işlevsel bilgi vermemektedir. Bu etkileşim sırasında sadece bilgi sağlayabilirve parçacık ile ilgili olarak, flüoresan nesnenin göreli uzaysal pozisyon izleniyor. Bu göreli konum emisyon tepe kaydedilir yörüngesinin içinde açısı elde edilir. Bu deneyi gerçekleştirmek için kullanılan mikroskop şematik bir temsili, Şekil 4&#39;te görülmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/51794/51794fig1highres.jpg" /> Zaman yörüngeleri ve yoğunluğu halı vs 1. Deplasman Şekil. zaman izleri vs) x, y ve z, lizozom yer değiştirme. b) yoğunluğu yörünge (yani her bir dairesel yörünge boyunca alınmış dikey bir eksen yoğunluğu zaman) parçacığın floresan çevresi hakkında bilgi sağlar. Kutulu dışında parlak noktalar başka parlak nesneler ile parçacığın etkileşimler karşılık gelir ve inci gibi yörünge geçişlere ilişkilidir<html> e yörüngeler parlak floresan kaynağına yeniden merkezleri. Kutulu bölgesi iki atlar arasındaki yörünge bölümüne tekabül etmektedir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/51794/51794fig2highres.jpg" /> Bir lizozomun 3D yörünge ardından Şekil 2.. Bir lizozomun bir yörünge bir kısmının) 3D rekonstrüksiyon parçacık izleme kullanılarak toplanmıştır. (; Mavi, düşük foton sayımı kırmızı, yüksek) yörünge parçacık toplanan floresan yoğunluğu kodlu renktir. Eksen ölçekler nm vardır. Bu x, y Not z eksenleri farklı aralıkları var. 3D yörünge b) 2D projeksiyon, bir raster görüntülü Mikrotubullerin tarama hemen üstüne bir yörünge kaplamasını gösteren yörünge toplanmıştır sonra. C) Mitokondri Mitotracker ile boyandı . 3 re &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 51794 / 51794fig3highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 3. (930 nm uyarma) birden fazla kanala yörünge izleme uzatılması. a) hücre b.) yeşil kanal (bu kanalda toplanan floresanstaki Intensity halı içinde bir lizozomun 3D yörünge takibi için kullanılır). c) mitokondri kırmızı floresan matrisi ile boyandı kırmızı kanal içinde Yoğunluğu halı hedef boya. Lizozomun etrafında yörüngede ışın mitokondrial matriks içine geçerken yörünge mitokondri (ok uçları) ile temas alır bölgeler, halı yoğunluğu darbelere olarak görünür. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/51794/51794fig4highres.jpg" /> Şekil deney düzeneği 4. Şeması: İki foton mikroskop modifiye. Lazer set-up şematik gösterimi: 2-Foton Ti: Bir aralık 690-1,040 nm Sa lazer bize olduBaskı, bir polarize ve yarım dalga plakası uyarım gücü kontrol etmek için kullanılır. Tüm diğer maddeler belirtilen kısaltmalar kullanılarak şekilde listelenir. Biz 1.2 bir NA ile 60X objektif kullanılır.

Watch this Scientific Journal Video about 3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles at JoVE.com

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

3d-orbital-tracking-modified-two-photon-microscope-an-application-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Görüntüleme.  University of California, Irvine. In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope. 

Video: 3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Nörobilim

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Gelişim Biyolojisi

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Biyomühendislik

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Biyoloji

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

Maya 4D mikroskopisi

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often require indirect methods due to their small diameter (40-250 nm), which is beneath the diffraction limit of typical light microscopy. We have developed a super-resolution microscopy-based visualization of EVs to bypass the diffraction limit in both two and three dimensions. Using this approach, we can resolve the three-dimensional shape of EVs to within +/- 20 nm resolution on the XY-axis and +/- 50 nm resolution along the Z-axis. In conclusion, we propose that super-resolution microscopy be considered as a characterization method of EVs, including exosomes, as well as enveloped viruses.

Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) is used to bypass the typical diffraction limit of light microscopy and to view exosomes at the nanometer scale. It can be employed in both two and three dimensions to characterize exosomes.

Hücre Dışı Veziküllerin Üç Boyutlu Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskopisi

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Source: Tsuruta, F., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55488">Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles&#39; movement.

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Nöronlardaki Vezikül Motilitelerinin Görselleştirilmesi

1. Imaging Vesicle Motility

	Prepare the plasmids that will label each type of vesicle. For instance, use EGFP-Rab5 for early endosomes, EGFP-Rab7 for ...