Biz Dr Kristen Verhey (Michigan Üniversitesi, Ann Arbor) ve Dr. Gregory Pazour (Massachusetts Üniversitesi Tıp Fakültesi) bazı plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Projenin Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH GM097037, GM116204 ve GM122552 W.Y. için) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

1. NIH 3T3 hücre hazırlık için hız mikroskobu stoktan
<ol><li>deneme hakkında 1,5 hafta 37 ° C'de çözdürme ve hücreleri bir 25 cm2 hücre kültür şişesi 3 mL, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (110 mg/mL ile desteklenmiş DMEM) ile aktarma tarafından dondurulmuş stoktan NIH 3T3 hücre taze bir kültür kurtarmak Sodyum pyruvate, 2 mM glutamin, % 10 fetal sığır serum ve % 1 penisilin/streptomisin.</li>
	<li>%5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Hücreleri hakkında iki günde % 80 confluency, hücre döngüsü polimerlerin sağlamak için deneysel bir gün önce en az üç kez bölün. % 0.25 tripsin 37 ° C'de 2 min için hücrelerle trypsinize, tripsin Aspire edin ve orta 2 mL ile değiştirin. Pipet art arda hücre kümeleri kadar kırmak, hücreler için istediğiniz sayıyı kaldırmak ve medya hacmi getirmek için orta geri ilâ 3 mL. Not: NIH 3T3 daha önce genetik olarak NPHP-4, mCherry için C terminus, erimiş TZ26, yerelleştirir bir protein ifade etmek için. mCherry 561 nm aydınlatma ile kantitatif TZ seçicilik bariyer yerelleştirilmesine ve birincil kirpikler yönlendirmek için heyecanlı bir fluorophore var.</li>
	<li>İki gün önce deney, plaka 35 mm cam alt hücrelere aynı orta adım 1.1 olarak 1,5 mL ile % 60-70 confluency, bulaşık ve hücreleri için kuluçka dönün.</li>
	<li>Bir gün önce deneme, kimyasal olarak istenen plazmid hücrelerle transfect. 500-1000 istenen plazmid ng (bkz: Not aşağıdaki) 1:2.5 oranında transfection reaktif 0.25 ml 30 dk. 35 medyadan aspiratı için antibiyotik olmadan düşük serum medya ile mm cam alt çanak mix ve eski yerine koymak o ile 0.25 mL plazmid / transfection reaktif mix plus ilave 1,25 kalp krizi düşük serum medya olmadan antibiyotik. İndirimli serum medya başarılı bir transfection kolaylaştırılması, birincil kirpikler büyüme inducing, hem de hücreleri deney gerçekleştirmek için yeterince uzun süre hayatta tutan amaca hizmet eder. Hücreleri ertesi gün deneme için kuluçka dönün. Not: IFT20 tek molekül izlenmesini gerçekleştirirken, GFP için onun C terminus, genetiği değiştirilmiş IFT20 erimiş içeren bir plazmid kullanılan25' tir. Tek molekül gerçekleştirirken kendi N terminus bir alıcısı peptid (AP) etki alanı için genetiği değiştirilmiş SSTR3 içeren bir plazmid erimiş SSTR3 izleme ve C terminus GFP için kullanılan22yaşında. SSTR3 yapı yanı sıra ortak biotin ligaz BirA içeren bir plazmid dile getirdi ve transfection medya 10 µM biotin ile desteklenmiştir. BirA sonra biotin ER düzeyinde yeni sentezlenmiş AP-SSTR3-GFP moleküllerin AP etki alanı ekler. Streptavidin, dört biotin bağlama sitelerinde üçü için Birleşik Alexa647 ortalama, sonra fluorescently etiket için AP-SSTR3-GFP moleküller hücre22,27 dış yüzeyinde Imaging önce basına takıma . GFP ve AlexaFluor647 Bu yöntemde kullanılır; Ancak, diğer floresan problar onlar benzer şekilde yüksek fotoğraf-istikrar ve verim kuantum varsa kullanılabilir.</li>
	<li>SSTR3 yapı dışarıdan etiketli, cam alt medyadan deneme önce 1 h bulaşık, hücresinden fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 mL 5 kere yıkayın ve düşük serum medya 1 mL 1 µM ile desteklenmiş Ekle Kaldır kullanarak Alexa647 Birleşik streptavidin.</li>
	<li>En fazla 15 dk önce deneme, cam alt çanak medyayı çıkarın ve 1 mL PBS ile 5 kere transfected ve etiketli hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Görüntüleme arabelleği (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7.3) 1 mL cam alt çanak yerleştirin. Not: görüntüleme arabellekte artık için 3 h uygun hücrelerdir. Bu nedenle, sadece 2 h deneyler her yemeğin üzerinde yapılmaktadır.</li>
</ol>2. hız mikroskobu
Not: Hız mikroskobu Kur bir 1.4-NA 100 × petrol-daldırma apochromatic amaç, 35 mW 633 nm He-Ne lazer, 50 mW katı hal 488-nm ve 561-nm lazerler, bir çip üzerinde çarpma kazanç ile donatılmış bir ters Floresans mikroskobu içerir. şarj birleştiğinde cihaz kamera ve bir mikroskop bilgisayar yazılımı paket için veri toplama ve işleme (şekil 1). Tek kanal görüntüleme için GFP, mCherry ve Alexa647 tarafından 488 heyecanlı mısın nm, 561 nm veya 633 nm lazerler, anılan sıraya göre. Tek molekül izleme için tek nokta aydınlatma bireysel moleküllerin fluorescently etiketli izlemek için kullanılır. Epifluorescence görüntüleme için ışın tek tip bir aydınlatma alana genişletmek için lazer aydınlatma yolundaki bir içbükey mercek yerleştirilir. Floresans emisyon aynı amaç tarafından toplanan, dikroik filtresi (405/488/561/635) ve bir emisyon filtresi (405/488/561/635) tarafından filtre ve tek molekül takibi için 500 Hz veya 2 Hz için çalışan yukarıdaki CCD kamera ile görüntülü epifluorescence görüntüleme.
<ol><li>Cam alt plaka mikroskop sahneye yapıştırmayın ve istenen yapıları düzgün ifade bir hücreyi bulun. Uygun bir hücreyi bulunca NPHP4 mCherry noktanın konumunu görüntüleme uçakta lazer'ın tek nokta aydınlatma için karşılık gelen birincil kirpikler temelini hizalayın.</li>
	<li>NPHP4-mCherry ve IFT20-GFP veya AP-SSTR3-GFP digital mikroskobu yazılım paketi kullanıyorsanız "Odak denetimler" pencere "Kamera" sekmesinde "Ek" işlevini kullanarak bir epifluorescence görüntü yakalama ( Tablo malzemelerigörmek). Not: Bu görüntüleri izleyen tek molekül konumları için bir başvuru olarak hareket edecek.</li>
	<li>Referans görüntüleri elde edilen bir kez yerel olarak etiketli tek moleküllerin konsantrasyonunu azaltmak. Fotoğraf-TZ 1 mW lazer aydınlatma 20 ile çamaşır suyu s ya da floresan yoğunluğu bu arka plan Floresans yakın olana kadar. Not: Otelde tam konsantrasyon kontrol edilebilir, 0.1-1 tek molekülleri etiketli nM kullanılır.</li>
	<li>Tek molekül izleme için hazırlamak için lazer aydınlatma gücü ~0.15 mW tek molekülleri ile GFP etiketli veya ~0.5 mW Alexa647 ile etiketli molekülleri düşür.</li>
	<li>En kısa zamanda lazer güç ve parametrelerini görüntüleme ayarla, maksimum kazanç ve yoğunlaştırılması ve 2 ms kare hızı, tek molekül görüntüleme için uygun aydınlatma lazer meşgul ve sigara-photobleached, onlar taşınmaktadır gibi tek molekülleri etiketli kaydetme "Odak denetimler" penceresindeki "Kamera" sekmesi "Stream" düğmesini tıklatarak TZ photobleached bölgeden. Not: En fazla 2 dk Video ihmal edilebilir bir düzeye silier drift etkilerini en aza indirmek için yakalanması.</li>
	<li>Tek molekül video yakalanıyor sonra belirti yanında tam olarak her molekülünü'nın uyarma PSF kapsayan bir alanda ilgi (AOI) centroid yerelleştirir Gelles laboratuvar gibi bir 2D Gauss uygun algoritması kullanarak video işlemek.</li>
	<li>Tüm tek molekül konumları hassasiyetle seçin < 10 nm ve dağıtım bir 2D Gauss fonksiyonu ile donatılmış tek molekül yerlerin dayalı kirpikler ortasına doğru. Not: 2D 3D dönüştürme algoritması kullanarak, IFT20-GFP ve AP-SSTR3 parkurları 3D ulaşım yolları açıkça silier axonemal veya silier membran üzerinde sırasıyla gösterilir.</li>
</ol>3. 2D 3D dönüştürme için
<ol><li>Bir kez içinde cilium molekülleri (sinyal gürültü oranı > 11) transit için birkaç bin yerelleştirmeler toplanır, cilium uzun ekseni X-boyut olarak seçin. 10 nm aralıklarla depo gözü toplamlar elde etmek ve konumları Y boyut histogramını olun. Not: 2D 3D dönüştürme için el veya herhangi bir yazılım veya programlama dili tarafından değerlendirilecek. Yazarlar başarıyla Matlab ve Python 2.7 dönüşümün hayata geçirdik.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Leung, B. O., Chou, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+super-resolution+fluorescence+microscopy+for+biology.">Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology.</a> Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis.">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440, 935-939 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+distribution+of+transient+interactions+in+the+nuclear+pore+complex+obtained+from+single-molecule+snapshots.">Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).</li><li>Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-regulated+viscous+channel+in+the+nuclear+pore+complex.">Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+three-dimensional+mapping+of+mRNA+export+through+the+nuclear+pore.">High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li><li>Akey, C. W., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+Xenopus+nuclear+pore+complex+revealed+by+three-dimensional+cryo-electron+microscopy.">Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy.</a> J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).</li><li>Akey, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+and+structure+of+the+nuclear+pore+complex+revealed+by+cryo-electron+microscopy.">Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy.</a> J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).</li><li>Czarnecki, P. G., Shah, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+transition+zone:+from+morphology+and+molecules+to+medicine.">The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine.</a> Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).</li><li>Elf, J., Li, G. -. W., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+transcription+factor+dynamics+at+the+single-molecule+level+in+a+living+cell.">Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell.</a> Science. 316, 1191-1194 (2007).</li><li>Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+orbital+tracking+in+a+modified+two-photon+microscope:+an+application+to+the+tracking+of+intracellular+vesicles.">3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles.</a> J Vis Exp. , (2014).</li><li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+single+molecule+tracking+in+living+tissue.">Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue.</a> PloS one. 5, 11639 (2010).</li><li>Marshall, W. F., Nonaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia:+tuning+in+to+the+cell's+antenna.">Cilia: tuning in to the cell's antenna.</a> Curr Biol. 16, 604-614 (2006).</li><li>Scholey, J. M., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+and+cilium-based+signaling.">Intraflagellar transport and cilium-based signaling.</a> Cell. 125, 439-442 (2006).</li><li>Yang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+pattern+recognition+reveals+the+architectural+map+of+the+ciliary+transition+zone.">Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone.</a> Sci Rep. 5, 14096 (2015).</li><li>Craige, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEP290+tethers+flagellar+transition+zone+microtubules+to+the+membrane+and+regulates+flagellar+protein+content.">CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content.</a> J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).</li><li>Kee, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+size-exclusion+permeability+barrier+and+nucleoporins+characterize+a+ciliary+pore+complex+that+regulates+transport+into+cilia.">A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia.</a> Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).</li><li>Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steric+volume+exclusion+sets+soluble+protein+concentrations+in+photoreceptor+sensory+cilia.">Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).</li><li>Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+to+the+ciliary+membrane:+how+to+get+across+the+periciliary+diffusion+barrier.">Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).</li><li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+imaging+reveals+a+major+role+for+diffusion+in+the+exploration+of+ciliary+space+by+signaling+receptors.">Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors.</a> Elife. 2, 00654 (2013).</li><li>Ross, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates.">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).</li><li>Handel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+targeting+of+somatostatin+receptor+3+to+neuronal+cilia.">Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia.</a> Neuroscience. 89, 909-926 (1999).</li><li>Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraflagellar+transport+protein+IFT20+is+associated+with+the+Golgi+complex+and+is+required+for+cilia+assembly.">The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).</li><li>Awata, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHP4+controls+ciliary+trafficking+of+membrane+proteins+and+large+soluble+proteins+at+the+transition+zone.">NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone.</a> J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).</li><li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin.">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Bu iletişim kuralı hız mikroskobu uygulamaya birincil cilium, son derece verimli protein araçta güvenen bir hücresel sinyal organel açıklar. Onlar TZ üzerinde ortalanmış tek nokta aydınlatma yoluyla geçerken hız mikroskobu (< 10 nm) konumları fluorescently etiketli moleküller için yüksek çözünürlüklü sağlayabilir. Daha önce NPC6,7,8ile ticareti protein çalışmaya uygulanmıştır. Ancak, herhangi bir alt kırınım hücresel boşluğu kaçakçılığı çalışmaya uzatılabilir. Kayma ve temporal çözünürlüğe sahip canlı hücre sistemleri tek protein taşıma dinamiği yakalamak yapabiliyor bu tekniği yüksek çözünürlüklü diğer görüntüleme teknikleri üzerinde bir avantaja sahiptir < 10 nm ve < 2 ms, anılan sıraya göre. Bir tek fluorescently etiketli bir protein ilgi gerekir ve yapı transfection, protein yerelleştirme hız mikroskobu gerçekleştirme başlamak için eğitimi için ortak bir moleküler biyoloji yaklaşım yoluyla ifade başka bir avantajdır. Bir yüksek güçlü lazer ile tek noktadan aydınlatma iyi ayrılmış, yüksek çözünürlüklü tek molekül konumları sağlar özelliktir akılda tutmak gerekir. Ancak, bu da aydınlatma alanı sınırlar ve teknik geniş alan yerelleştirme için uygun değildir yapar. Neyse ki, istenirse seçim araştırmacılar için çok geniş alan süper çözümleme teknikleri vardır. Göz önünde bulundurulacak başka bir hız mikroskobu sadece tek molekülleri hareketli yerleri yakalar noktasıdır. Bu nedenle, mobil toplam molekülleri kısmını belirlemek için sıkı BAĞLAMAK ile birlikte analiz için yararlı bir ek olabilir.
Kartezyen ve silindirik koordinasyon sistemi arasında dönüştürme işlemi yerine bir 3D Görünüm 3D tek molekül takip dayalı bir sanal 3D olasılık yoğunluk Haritası oluşturmaktır. Ayrıntılı olarak, birincil kirpikler hangi bir üniforma molekül dağılımı belirli RADIUS boyunca yaratacaktır rotasyonel simetrik bir yapıya sahip elektron mikroskobu veri indirdik. Bu tekdüze dağılım silindirik sistemdeki θ boyuttaki kayma dağıtım sabittir yol açar. Sonra 3D koordinatları (R, X, θ)-ebilmek var olmak kolaylaştırmak-2B koordinatları (R, X, Sabit) olmak. Aslında, Kartezyen ve silindirik sistemleri arasında dönüşüm işlemimiz 2D (R, X, Sabit) 2D (X, Y) etmektir. Sürekli θ, ADenklem kullanılarak hesaplanır için mekansal yoğunluk panlamına gelir<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq3.jpg">(Şekil 2). Vektör hesaplamak için bir matris hesap makinesi kullanın <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq4.jpg"> </img>, hangi karşılık gelen komşu eş merkezli halkalardan kesit görünümü6,7Aj s arasında göreli alanları ile toplam etkileşim siteleri pozisyon j doğrudan deneylerden ölçülür; Böylece, pben rben, etkileşim sitelerinde kayma olasılık yoğunluğu hesaplanabilir amatris denklemi çözerek<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq3.jpg">. 
Kritik bir iletişim kuralındaki herhangi bir pertürbasyon referans resim alma arasındaki tek molekül video mikroskobu kurulumunun en aza indirmek için adımdır. Herhangi bir hareket olursa, güvenle epifluorescence görüntüleme yoluyla elde edildi ultrastructure birincil kirpikler, tek molekül Mekanlar eşleştirmek mümkün değildir. Başka bir önemli adım photobleach için yerel olarak fluorescently etiketli tek moleküllerin konsantrasyonunu azaltmak için aydınlatma alanıdır ama o kadar çok bu nüfus tamamen photobleached. SSTR3 söz konusu olduğunda, difüzyon katsayısı için çözünen molekülleri ile karşılaştırıldığında yavaş ve BM-photobleached SSTR3 molekülleri nüfusu photobleached alanına geri hareket silier drift olduğu zaman iki dakikadan uzun olacak bir Sigara önemsiz faktör. Photobleaching uygun düzeyde ulaşmak zordur ve arka plan Floresans yüksek düzeyde hala varsa, bir açılı aydınlatma lazer üstündeki ve altındaki heyecanlı fluorescently etiketli tek molekülleri azaltmak için kullanılabilir uçak görüntüleme. Bu arka plan azaltmak ve yakalanan her molekülünü sinyal-gürültü oranı geliştirmek.
Özetle, hız mikroskobu kolayca geleneksel mikroskobu kurulumları üzerinde Ayrıca bir lazer aydınlatma kaynağı, ilişkili aynalar ve yüksek hızlı CCD kamera tarafından uygulanması yapabiliyor. Diğer benzer teknikler üzerinde ana gelişme arka plan Floresans büyük ölçüde azaltan eğimli lazer ve 2D tek molekül 3D mekansal olasılık yoğunluk harita yeniden yapılandırır 2D 3D dönüştürme algoritması vardır Mekanlar. Bir biyolojik açıdan hiçbir ilave faiz dışında bir fluorophore Birleşik protein etiketleme gereklidir. Bu özellikleri hız mikroskobu yüksek tek molekülleri izlemek izin kronolojik zamanmekansal (5-10 nm, 0,4-2 ms) çözünürlük rotasyonel simetrik yapıları ile bir alt mikrometre biyo-kavite veya biyo-kanal üzerinden trafik gibi. 3D olasılık yoğunluğu dönüştürme algoritması ile birleştiğinde, tagged proteinlerin 3D ulaşım yolları boşluğu veya kanal yoluyla belirlenebilir. Bu tekniğin uygulanması daha önce 3D ulaşım yolları protein ve RNA'ların NPC ile ayırt etmek için kullanılmış ve işte, bir transmembran protein, SSTR3 ve sitozolik protein, IFT20, 3D taşıma TZ elde göstermektedir birincil kirpikler. 3D-fırtına gibi diğer süper çözümleme teknikleri almış x, y, z pozisyonlar için optik yolundaki tek molekül PSF konumunu üstünde veya altında bağlı olarak asimetrik bir bozulma oluşturan silindirik bir lens yerleştirerek tek molekülleri odak düzlemi28. Başka bir önceden emisyon PSF genişliğini azaltmak ve böylece çözünürlük daha da artırmak için sanal iğne deliği teknolojiyi uygulamak olasıdır. Yukarıdaki teknikleri hız mikroskobu üzerinde oldukça kolayca uygulanabilir. Genel olarak, aynı anda taşıma Kinetik tek molekül düzeyde ve 3D harita Inter - veya intra-organel moleküler kaçakçılığı için süper yüksek çözünürlüklü kronolojik zamanmekansal taşıma yollar belirlemede benzersiz bir yaklaşım hızı mikroskobu sağlar canlı hücre sistemleri belirli koşullar altında.

Ernst Abbe tarafından 1873 yılında belirtilen beri konvansiyonel ışık mikroskobu çözünürlüğe objektif1,2ışık kırınım nedeniyle sınırlı yaklaşık 200 nm olduğuna inanılan. Şu anda, süper çözümleme ışık mikroskobu teknikleri bu sınırlama kırmak ve alt kırınım (< 200 nm) çözünürlük ile dinamik görüntü yakalama sağlar. Teknikleri, genellikle iki geniş kategoriye ayrılır: uyarılmış alt kırınım Aydınlatma Cilt fluorophores doğrusal olmayan optik tepki nedeniyle örnekleri3' te; oluşturmak emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi dayalı yaklaşımlar ve photoactivated ışık mikroskobu (PALM) ve Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)-fluorophores cisimlerin yerelleştirilmesine ve bu cisimlerin yeniden oluşturmak için Matematiksel işlevler kullanmak süper çözümleme teknikleri dayalı süper çözünürlük görüntüleri4,5oluşturmak için. Şu anda, nispeten basit optik Kur nedeniyle PALM ve fırtına geniş yalnızca küçük bir alt kümesine fluorophores biyolojik hazırlanması uzun bir videonun her çerçevede etkinleştirerek istihdam edilmektedir. Bu daha doğru yerelleştirme için floresan spot, 2D Gauss montaj tarafından noktaya yayılmış işlevi (PSF) olarak adlandırdığı video her çerçevede fluorescently etiketli proteinlerin sağlar. Her fluorescently etiketli molekül 2D konumunu sonra biyolojik hazırlık1,2süper çözünürlük görüntü üretmek için tek bir görüntüleme uçağa bindirilen. Bu tek molekül yerelleştirme sırasında mikroskobu süper çözünürlük yaklaşımlar kesinlikle nasıl görüntüleme biyolojik örneklerin gerçekleştirilen devrim, hala aşılması gereken sorunlar vardır. Örneğin, fırtına ve PALM onların en iyi uzamsal çözünürlük sonra biyolojik örneklerin fiksasyonu elde etmek ve böylece fluorescently etiketli proteinler, statik bir temsili olan elektron mikroskobu benzer bir kısıtlamasıdır mevcut. Ayrıca, canlı hücrelerdeki her fluorescently etiketli protein için yüksek Uzaysal çözünürlük elde etmek için örnekleri protein dynamics yakalamak mümkün değildir çok uzun framerate yansıması gerekir. Bu nedenle, bu ana teknik engellerin üstesinden gelmek gereklidir.
Çok hızlı hareket eden protein veya RNA'ların canlı hücrelerde algılamak için uygundur yüksek bir kronolojik zamanmekansal çözünürlük elde etmek için biz süper çözünürlük hızı mikroskobu bizim laboratuvar (şekil 1)6,7', gelişen 8. hız mikroskobu birkaç önemli teknik gelişmeler bizi küçük moleküllerin nucleocytoplasmic taşıma başarılı bir şekilde izlemek daha önce etkinleştirdiyseniz, proteinler, mRNA ve virüs-den geçerek yerli nükleer gözenek kompleksleri (NPCs)6, 7 , 8. kısaca, hız mikroskobu, aşağıdaki özellikleri hızlı hareket eden oluştururlar alt mikrometre rotasyonel simetrik yapıları NPCs ve birincil kirpikler gibi canlı hücrelerdeki üzerinden izlemek için kullanılan: (1) bir eğimli veya bir Dikey aydınlatma PSF odak düzlemi (şekil 1); küçük kırınım-limit hacmindeki içinde tek moleküllerin uyarma sağlar (2) eğimli PSF büyük ölçüde odak floresan önlemek ve böylece sinyal-gürültü oranı geliştirmek. (3) 100-500 kW optik yoğunluk / cm2 aydınlatma PSF'hızlı algılama hızı (> 500 Hz) ile tek fluorophores üzerinden tahsil edilecek fotonlar binlerce sağlar. (4) hızlı algılama hızı da büyük ölçüde azaltır tek molekül kayma yerelleştirme hata (< 10 nm) moleküler Difüzyon önemli faktörlerden biri olduğu için canlı hücrelerde, floresan molekülleri hareket kayma yörüngeleri belirlemede molekülleri hareket etmek için tek molekül yerelleştirme kusurları neden. (5) well-established 2D 3D dönüştürme algoritmaları molekülleri NPC veya birincil cilium 3D mekansal olasılık yoğunluk haritalar ulaşım yollarının sağlamamıza olanak sağlar. Bu bizim dönüştürme işlemi Kartezyen ve silindirik koordinasyon sistemi arasında bir 3D mekansal olasılık yoğunluk 3D yerine harita tek molekül izleme (Şekil 2) oluşturmak için kullanılan dikkat çekicidir. Daha önce elektron mikroskobu veri-si olmak kâşif NPC9,10 ve11 birincil cilium hem de rotasyonel simetrik bir yapıya sahip. Prensip olarak, rasgele NPC veya birincil cilium aracılığıyla hareketli moleküllerin Difüzyon rotasyonel simetrik dağıtımları da olmalıdır. Şekil 2' de gösterildiği gibi rastgele silindir içinde moleküllerin Difüzyon yüksek bir dizi bu kesit görünümü, rotasyonel simetrik dağıtımları daha fazla bir yaklaşık Tekdüzen kaynaklanan NPC oluşturmak kayma Dağıtım iki komşu yüzük (Şekil 2E) arasında çok küçük her alt bölge içerisinde. Bu tekdüze dağılım silindirik sistemdeki θ boyuttaki kayma dağıtım sabittir yol açar. Sonra 3D koordinatları (R, X, θ)-ebilmek var olmak kolaylaştırmak-2B koordinatları (R, X, Sabit) olmak. Aslında, bizim dönüştürme işlemi Kartezyen ve silindirik sistemleri arasındaki 2D (R, X, Sabit) 2D (X, Y) etmektir. Sürekli θ, Şekil 2Emekansal yoğunluk p başvurduğu, ADenklem kullanılarak hesaplanır<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq1.jpg">.
Sonuçta, tek molekül izleme geniş uygulama Biyolojik araştırma vardır, böylece, bu teknikleri bir bolluk belirli biyolojik nişler12,13,14doldurmak için geliştirilecek doğaldır. Böyle hız mikroskobu ile durumdur. Daha önce bir 3B dönüştürme algoritması ile birleştiğinde, moleküller NPCs, alt diffraction ölçekli ve rotasyonel simetrik biyolojik yapısı6üzerinden transit, 3D ulaşım yolları çözmek için bu teknik geliştirilmiştir. Bu yazıda, birincil kirpikler mükemmel model organelleri de olduğu gösterilmiştir. Birincil kirpikler en memeli hücreleri15,16,17yüzeyinden Project'in silindirik, anten gibi organellerin (~ 125 nm RADIUS) vardır. Onlar dış sinyalleri alma ve genellikle büyüme ve metabolizma15,16ile ilgili hücre içi bir yanıt gönderme için sorumludur. Bu nedenle, yapısal proteinlerin akı, geri dönüşüm transmembran reseptörler ve hücre içi haberci iletimini birincil kirpikler önemli sorumlulukları vardır. Dönemde birincil kirpikler ve hücre beden arasındaki geçiş bölgesi veya TZ, hangi aracılığıyla bu protein taşıma11,18,19ortaya çıkması gereken bir kritik seçicilik engel vardır, 20. TZ gating işleve ek olarak, en az iki taşıma işlemi, intraflagellar taşıma ve pasif difüzyon, protein bu bölge16,21, üzerinden hareket sorumlu olduğu düşünülür 22. bir insan sağlığı açısından birincil kirpikler kaybı ve aşağı akım sinyal sonraki deregülasyon birçok kanser özelliğidir. Buna ek olarak, Bardet-Biedl sendromu ve Polikistik böbrek hastalığı, gibi birçok genetik hastalıkların arızalı protein taşıma23ile ilişkilidir. Alt kırınım boyutu sınırı ve seçici protein taşıma TZ aracılığıyla karmaşık süreci birincil kirpikler için bu tekniği ilk hedef olun. Bu yöntemleri yazıda, biz silier transmembran protein, somatostatin reseptörü 3 (SSTR3) izleme gösterecektir24dışarıdan Alexa Fluor 647 ve bir bileşeni olan bir yuvarlak GFP molekül ile etiketli LFT, IFT2025, taşır,.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="618">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:123px;">25 cm2 tissue culture dish</td>
			<td style="width:204px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">VV-01936-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">15140122</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">10438018</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">DMEM</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">10566-016</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">OPTIMEM</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">31985062</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Trypsin</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">25300054</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P3813-1PAK</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Transit LT1</td>
			<td style="width:204px;">Mirus</td>
			<td style="width:101px;">MIR 2300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">35 mm glass bottom dish</td>
			<td style="width:204px;">MatTek</td>
			<td style="width:101px;">P35GCOL-0-14-C</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">AlexaFluor 647-conjugated streptavidin</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">S21374</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Biotin</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B4501-100MG</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">633 nm He-Ne laser</td>
			<td style="width:204px;">Melles Griot</td>
			<td style="width:101px;">25-LHP-928-249</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">561 nm solid state laser</td>
			<td style="width:204px;">Coherent</td>
			<td style="width:101px;">OBIS 561-50 LS</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">488 nm solid state laser</td>
			<td style="width:204px;">Coherent</td>
			<td style="width:101px;">1185053</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:204px;">Olympus</td>
			<td style="width:101px;">IX81</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:123px;">1.4-NA 100&#215; oil-immersion apochromatic objective</td>
			<td style="width:204px;">Olympus</td>
			<td style="width:101px;">UPLSAPO 100&#215;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:123px;">On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera</td>
			<td style="width:204px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:101px;">Cascade 128+</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">Dichroic filter</td>
			<td style="width:204px;">Semrock</td>
			<td style="width:101px;">Di01- R405/488/561/635-25x36</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">Emission filter</td>
			<td style="width:204px;">Semrock</td>
			<td style="width:101px;">NF01-405/488/561/635-25X5.0</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Slidebook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">digital microscopy software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of high-speed super-resolution speed microscopy in live primary cilium

Birincil cilium bir Mikrotubul tabanlı çıkıntı yüzeyi birçok ökaryotik hücre ve proteinlerin benzersiz bir tamamlayıcı bu işlev eleştirel hücre hareketliliği ve sinyal içerir. Kirpikler kendi protein sentezleme aciz olduğundan, 200'e yakın benzersiz silier proteinler sitozol ve birincil kirpikler ticareti gerekir. Ancak, hala taşıma yolları bu proteinler arasında şu an mevcut olan sınırlamaları nedeniyle canlı birincil kirpikler için üç boyutlu (3D) yerlerini eşlemek için teknik bir sorun olduğunu teknikleri. Meydan fethetmek için son zamanlarda biz geliştirdik ve tek-noktaya kenar-uyarma alt kırınım (hız) mikroskopi, taşıma yolları için 3D uzaysal konumunu belirlemek için olarak adlandırdığı bir yüksek hızlı sanal 3D süper çözünürlük mikroskobu istihdam hem sitozolik ve birincil kirpikler canlı hücre membran proteinlerinin. Bu makalede, biz hız mikroskobu, silier protein Floresans protein etiketli, gerçek zamanlı tek molekül izleme canlı cilium bireysel proteinlerin ve başarı ifade hücreleri hazırlanması ayrıntılı kurulum gösterecektir 3D mekansal olasılık yoğunluk haritaları silier proteinler için ulaşım yollarının.

HIZ mikroskobu, Alexa647 için bir ~ 15 nm dış bağlayıcı tarafından bağlı SSTR3 taşıma güzergahı çalışmaya TZ birincil kirpikler, performans elde edilen veriler bu bölümde gösterilmiştir (şekil 3A). Bu, 3B dönüştürme algoritması doğrulama çift amaçlı hizmet vermektedir. Etiket birincil cilium ve bu nedenle, 3D aktarım yol dış yüzeyinin bu konumda bir yüksek yoğunluklu aktarım yol ortaya çıkarmak sadece Alexa647 gerekir. NIH 3T3 stabil NPHP3-mCherry, TZ ifade AP-SSTR3-GFP ile transfected ve streptavidin Birleşik Alexa647 ile yukarıdaki protokolüne göre inkübe gerekir. Geniş alan görüntüleme mCherry etiket GFP hücrede istenilen SSTR3 yapı dile getirdi emin olmak için kullanılırken TZ yerelleştirmek için kullanılır. Ayrıca, geniş alan görüntüleme 633 nm aydınlatma kullanarak Alexa647 etiket hücre düzgün BirA plazmid dile getirdi ve medyadan yeterli biotin absorbe onaylamak gereklidir. Teşekkürler görünür cilium arka plan floresan (şekil 3B) farklı karakterizedir. Streptavidin Birleşik Alexa647 sahip AP-SSTR3-GFP yapı verimli etiketlerine göre sadece bu koşullar altında ortaya çıkabilir. Alexa647 tarafından birincil cilium seçici etiketlerine göre olumlu onay alındıktan sonra photobleaching ve TZ 633 nm lazer ile tek noktadan aydınlatma görüntülenmeyecektir tek molekülleri sağlayacaktır. Önce veri analizi, geniş alan aydınlatma tek molekül videoda superimposing yararlı doğrulama adım (şekil 3C) olduğunu. Örneğin, lazer düzgün değil hizalanmışsa, TZ ile birlikte yerelleştirmek için tek hiçbir molekülleri görünür. Bir öncesi veri analiz doğrulama adım yeterli bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için TZ yoğunlukta tek molekül video (şekil 3E) uzunluğu üzerinde kontrol etmektir. Bu tip çözümlemeler ImageJ 'z ekseni profil Çiz' işlevini kullanarak hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Şekil 3F Peaks'e TZ adlı tek bir molekül görünümü bir sinyal-gürültü ~ 5.0 ile karşılık gelir. Bu grafik de yeterli photobleaching tek molekülleri iyi ayrılmış sıklığını tarafından kanıtlanan oluştu sağlanması yeteneğine sahiptir. Şekil 3 G < 0,5 düşük sinyal-gürültü oranı gösterir. Bir açıklama lazer TZ doğrudan uyumlu değildir olacaktır. Başka bir nedenle lazer aydınlatma gücü çok düşük olabilir. Her iki açıklamalar içinde düşük uyarma neden ve bu nedenle, düşük emisyon TZ adlı fluorophores. Bu kontroller yapıldıktan sonra 2D Gauss uygun tek moleküllerin TZ (şekil 3H) içinde onların yörüngeleri üretecek. Birçok yörüngeleri superimposing TZ (şekil 3ben) ilgi etiketli protein aktarım yol üretecek. 2D Gauss uygun dedektörü, x, piksel değerlerine karşılık gelen bu yana y tek molekül veri TZ ve birincil kirpikler daha fazla ilgi'nın yerelleştirme (şekil 3J protein göstermek için geniş alan görüntü ile birleştirilebilir ).
IFT20 LFT karmaşık, mikrotübüller birincil kirpikler25içinde boyunca kargo taşıyan bir bileşenidir. Arl13b-mCherry, yaygın olarak kullanılan silier marker protein birincil kirpikler19etiketlemek için kullanıldı. Geniş alanlı epi-floresan mikroskopi Arl13b-mCherry ve IFT20-GFP ifade birincil cilium görüntü için kullanılan ve bireysel IFT20-GFP proteinler arasında birincil kirpikler sonra GFP, bir ön-photobleaching izlemek için hız mikroskopi için açık Floresans hız mikroskobu (şekil 4A-4 C) aydınlatma alanında tek molekül düzeyine kadar.
Sonunda, tek molekül IFT20-GFP yerleri yüzlerce < 16 nm uyguladıkları yerelleştirme duyarlığını ile canlı hücre (şekil 4D) birincil cilium elde edilebilir. Simülasyonumuza göre 250 tek bir RADIUS ile molekül yerlerini 95 nm güvenilir 3D aktarım yol (şekil 5) oluşturmak için yeterli oldu. IFT20-GFP aktarım yol son bir tespit tek molekül IFT20-GFP Mekanlar on kirpikler (şekil 4E) toplanan binlerce temel alır. Birincil kirpikler dönme simetri ile bir yapıya sahip beri 2D 3D dönüştürme algoritması için 2D öngörülen verilerine uygulanan. İlginçtir, yalnızca tek bir yüksek yoğunluklu bölgeye ~ 60-nm genişliğe sahip ~ 95 doruğa IFT20 3D mekansal olasılık yoğunluk haritaların belirtilen birincil kirpikler (şekil 4E) RADIUS boyunca nm. Bu yüksek yoğunluklu bölgenin büyük olasılıkla axonemal mikrotübüller LFT rota (şekil 4F) görüldüğü yer ile anlaşma ile birlikte yerelleştirir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56475/56475fig1.jpg"> Resim 1 . HIZ mikroskobu Basitleştirilmiş şematik. Dikey (1 yolu) veya bir eğimli (2 yolu) noktası yayıldı işlevi odak düzlemi tek fluorophore molekülleri aydınlatmak için kullanılır. "d" amaç merkezinden geçen dikey aydınlatma lazer ışını ve amacı kenarında aydınlatma lazer odaklanarak elde açılı aydınlatma arasındaki uzaklığı gösterir. İki veya daha fazla lazerler bir açma-kapama uyarma moduna sahip optik bir helikopter tarafından düzenlenir NPC veya birincil cilium üzerinden transit tek molekülleri izlemek için kullanılır. En az on daha uzun bir photobleaching süre hedeflenen molekülleri fluorophore etiketinde kapatma zamanı. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56475/56475fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56475/56475fig2.jpg"> Resim 2 . 3D dönüştürme işlemi için 2B grafik gösteri. Şemaları 2D 3D dönüştürme algoritması molekülleri, örneğin, göstermek durumunda, ve merkezi Lümen (A-F) veya bir tüp periferik bölgesinde (G-M) yaygın. (A) rastgele bir tüp içinde moleküllerin difüzyon, ideal 3D kayma yerler bir silindirik koordinasyon sistemi (R, X, θ) koordine. HIZI, sadece 3D yoğunluğu harita 2D kayma konumlardan sonuçta hesaplanır. Ancak, bu ister 2D veya 3D uzamsal konumu bilinen 3D yoğunluğu harita eşdeğer olduğunu göstermek için idealize edilmiş bir durumdur. (B) bir 3D moleküler yerlerde 2B düzleme bir Kartezyen koordinasyon sistemi (X, Y, Z) mikroskopi görüntüleme tarafından öngörülen. (C) bir çok ince dilim (Δx) a silindir boyut x kesim. (D) C gösterilen dilim 3D kayma yerlerde dar bir 2D bölgesinde tahmin. (E) C. içinde gösterilen ince dilim bütün yerlerde kesit görünümü Bu konumların alt bölgeler arasında eş merkezli halkalardan gruplandırılabilir. Yüksek-numarası rastgele dağıtılmış molekülleri silindir ve kesim çok ince dilim, mekansal yoğunluk yerlerde verilen (pben) her bölgedeki alt (SI) arasında iki komşu yüzük rotasyonel simetrik ve düzgün olacak. Bu konumları daha fazla Y Boyut 1 D tahmin. Mekanlar Y boyuttaki bir histogram ile j sütunları kümelenmiş. Her sütunda (Aj) toplam sayısı eşittir <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq2.jpg"> </img>, hangi deneysel olarak ölçülebilir (F) gösterildiği gibi. (G-M) Yukarıdaki gibi benzer, dönüştürme işleminin bir tüp periferik bir bölge içinde Difüzyon moleküller için sunulur. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56475/56475fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56475/56475fig3.jpg"> Şekil 3 . 3D kayma aktarım yol SSTR3 için üzerindeki konumunu hız mikroskobu tarafından eşlenen canlı birincil kirpikler. (A) GFP öğesini SSTR3 NPHP4-mCherry tarafından işaretlenmiş TZ üzerinden izleme için uygulanan hız mikroskobu grafik gösterimi. (B) NPHP4-mCherry (kırmızı), AP-SSTR3-GFP (yeşil), dışarıdan AP-SSTR3-GFP (beyaz) etiketlemek için kullanılan Alexa647 Epifluorescence görüntü ve son Birleştirilen görüntüyü. Ölçek çubuğu: 2 µm. (C) bir tek Alexa 647 etiketli AP-SSTR3-dört kare (2 ms/çerçeve) noktası aydınlatma alanı üzerinden geçen GFP (beyaz) izleme. Ölçek çubuğu: NPHP4-mCherry (kırmızı) ve AP-SSTR3-GFP (yeşil) epifluorescence görüntü üzerinde üst üste 2 µm. (D) tek molekül yörünge (beyaz) (c). Ölçek çubuğu: 2 µm. (E) beyaz çizgili kare olayları tek nokta aydınlatma alanı merkezli TZ. Ölçek çubuğu: 2 µm. (F) foton sayısı vs çerçeve grafik tek bir molekül ile bir yüksek sinyal gürültü oranı arka plan Floresans tarafından bölünmüş tek molekül maksimum Floresans bölerek video için numara. (G) foton sayısı vs tek bir molekül düşük sinyal gürültü oranı ile video için sayı grafiği çerçeve. (H) yörünge (e) ve (D) her çerçevede 2D Gauss montaj tarafından lokalize ve 2D Gauss montaj tarafından da lokalize TZ, doğru bir grafik gösterimi üzerinde üst üste. 2D Gauss montaj işlemi bir Gauss işlev ilgi (AOI) tek molekül'ın PSF.(I) 2D süper çözünürlük kayma dağılımını 220 bireysel kapsayan bir alan yoğunluğu profilinin X ve Y boyutlara uygun Alexa Fluor 647 etiketli AP-SSTR3-GFP Mekanlar tek bir birincil cilium toplanan. (J) NPHP4-mCherry (kırmızı) ve AP-SSTR3-GFP (yeşil) epifluorescence görüntü üzerinde üst üste süper çözünürlük tek molekül konumlardan (I). Ölçek çubuğu: elde 2 µm. (K) bir 2D 3D dönüştürme algoritması tarafından Alexa Fluor 647 etiketli AP-SSTR3-GFP R boyuttaki birincil kirpikler üzerinde kayma olasılık yoğunluk dağılımı. Gauss işlev uydurma, Alexa Fluor 647 etiketli AP-SSTR3-öncelikle, 131±3 nm yarıçaplı silier membran ile tam bir yarım en (FWHM) 24±1 nm fazla genişlikte yer alan GFP temel. (L) kesit görünümü birincil kirpikler Alexa Fluor 647 etiketli AP-SSTR3-GFP mekansal olasılık yoğunluk dağılımı (yeşil bulut). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56475/56475fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56475/56475fig4.jpg"> Şekil 4 . 3D uzaysal konumunu aktarım yol IFT20 için canlı birincil kirpikler hız mikroskobu tarafından eşlenen içinde. (A-C) Arl13b-mCherry (A) ve IFT20-GFP (B) bir NIH3T3 hücre ve birleştirilmiş (C) ortak ifade temsilcisi görüntüsü. Daire (mavi) olan kenarları IFT20-GFP Floresans hücre beden ve parlak alan aydınlatma tarafından belirlenir (değil bir hücre tarafında (beyaz kesik çizgiler) tek-noktaya aydınlatma hız mikroskobu birincil cilium üzerinde konumunu büyüdü gösterir gösterilen). Ölçek çubuğu: 10 µm. (D) 2D süper çözünürlük kayma dağıtım 286 bireysel IFT20-GFP yerlerden toplanan tek bir birincil cilium. (E) 3B dönüştürme algoritması için bir 2D tarafından IFT20-GFP mekansal olasılık yoğunluk dağılımı R boyuttaki birincil kirpikler içinde elde edilir. Gauss işlev uygun üzerinde bağlı olarak, IFT20-GFP öncelikle bulun 95±1 nm yarıçaplı 56±5 nm yarım maksimumda (FWHM) tam genişliğe sahip. (F) kesit görünümü mekansal olasılık yoğunluk dağılımı (yeşil bulutlar) IFT20-GFP birincil kirpikler, H. ölçek çubuğu şematik ile overlaid içinde: 100 nm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56475/56475fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56475/56475fig5.jpg"> Şekil 5 . Simülasyon 2D tek molekül yerleri 2D 3D dönüştürme algoritmaları için güvenilir 3D mekansal olasılık yoğunluk Haritası oluşturma için en az sayıda tahmin etmek için kullanıldı. (A) tek molekül Mekanlar oluşturmayı hesaplama açısından oluşturulan rasgele örnek 95 merkezli Radyal yoğunluğu normal dağılımından 100 nm (bizim deneylerde tespit IFT20 birincil aktarım yol karşılık gelen). Yerelleştirme hassas 16 nm örnek yanında her tek molekül konum için simüle bir normal dağılım σ ile gelen 16 = nm. Gösterildiği gibi Şekil 2C, çok ince dilim (Δx) X boyutu için dönüştürme algoritmaları kullanılır ve bu nedenle X boyutu hesaplama açısından oluşturulan 2D tek molekül yerlerde gösterilmemiştir. (B) dönüştürme Y-boyutlu proje verilerini ve 3D R-boyutlu yoğunluk arasında beş farklı simüle veri kümesi için (her 100 puan) 3D R-boyutlu yoğunlukları, çubuk grafikler oluşturur. Yukarıdaki sayı hata uygun en yüksek pozisyon ± var. (C-D) 250 tek molekül konumlara bağlı simülasyon sonuçları. (E-F) 500 tek molekül konumlara bağlı simülasyon sonuçları. (G-I) 3D yoğunluğu histogramlar 100, 250 ve 500 puan simülasyonlar üzerinden sırasıyla ortalama. Ortalama en yüksek pozisyon ± standart sapma sayıdır zirve yukarıda ederken hata çubukları çubuk grafik depo gözü zirvelere değişkenlik temsil eder. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56475/56475fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium at JoVE.com

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Son zamanlarda ulaşım yolları çeşitli proteinlerin canlı hücrelerdeki birincil kirpikler içinde translocating için üç boyutlu (3D) kayma yerlerini eşleştirilmiş. Burada deneysel kurulum, biyolojik örneklerin işlem ve veri analizleri yaklaşım yeni görüntüleme 3D süper çözünürlük floresan için uygulanan bu kağıt ayrıntıları birincil kirpikler yaşıyorum.

Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

application-high-speed-super-resolution-speed-microscopy-live-primary

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Cells and their Components

SCIENTISTS IN ACTION

8.2K Görüntüleme.  Temple University. Son zamanlarda ulaşım yolları çeşitli proteinlerin canlı hücrelerdeki birincil kirpikler içinde translocating için üç boyutlu (3D) kayma yerlerini eşleştirilmiş. Burada deneysel kurulum, biyolojik örneklerin işlem ve veri analizleri yaklaşım yeni görüntüleme 3D süper çözünürlük floresan için uygulanan bu kağıt ayrıntıları birincil kirpikler yaşıyorum.

Video: Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery system. Passive pumping is the phenomenon by which surface tension induced pressure differences drive fluid movement in closed channels. The automated fluid delivery system consists of a set of voltage controlled valves with micro-nozzles connected to a fluid reservoir and a control system. These voltage controlled valves offer a volumetrically precise way to deliver fluid droplets to the inlet of a microfluidic device in a high frequency manner. Based on the  dimensions demonstrated in the current study example, the system is capable of flowing 4 milliliters per minute (through a 2.2mm by 260um cross-sectional channel). Based on these same channel dimensions, fluid exchange of a point inside the channel can be achieved in as little as eight milliseconds. It is observed that there is interplay between momentum of the system (imparted by a combination of the droplets created by the valves and the fluid velocity in the channel), and the surface tension of the liquid. Where momentum provides velocity to the fluid flow (or vice-versa), equilibration of surface tension at the inlet provides a sudden stop to any flow. This sudden stop allows the user to control the flow characteristics of the channel and opens the door for a variety of biological applications, ranging anywhere from reagent delivery to drug-cell studies. It is also observed that when nozzles are aimed at the inlet at shallow angles, the droplet momentum can cause additional interesting fluid phenomena, such as mixing of multiple droplets in the inlet.

A novel microfluidic system has been developed using the phenomenon of passive pumping and a user controlled fluid delivery system. This microfluidic system has the potential to be used in a wide variety of biological applications given its low cost, ease of use, volumetric precision, high speed, repeatability and automation.

Mikroakışkan Cihazlar Pasif pompalanması için Yüksek Hızlı Damlacık tabanlı Dağıtım Sistemi

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Biyoloji

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...