Bu eser tarafından Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R35GM124868 altında ve Duke Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

1. Kur düzeni ve uyum
<ol>
	<li>Lazer yükleme ve kolimasyon izleme uyarma<ol>
		<li>Lazer optik tabloda bir ev inşa bağlama yoluyla yapıştırmayın. Montaj delikleri lazer baş ve optik tablo için montaj ile basit alüminyum plakadır. Lazer sıkıca istikrar ve ısı dağıtımı için metal bir takma iliştirilmesi gerekir. Dalga boyu belirli bir fluorophore uygun veya deneme için seçilmiş olsa bu iş için 488 nm katı hal lazer aydınlatma (şekil 1) için kullanın. Lazer dalga boyu öncelikle iki yansıtıcılar arasında dalga plaka belirlenir 2D-EOD çalışma aralığı uygun önemli bir faktördür (şekil 1: W2). 488 nm lazer etkili ortak Floresan Etiketler canlı hücre deneylerde olan yeşil veya sarı floresan protein (GFP/YFP), heyecanlandırmak.</li>
		<li>Lazer ışını yükseklik ve Dielektrik aynalar bir çift kullanarak yönünü ayarlamak (şekil 1: M). lazer ışını optik tabloya paralel olduğundan emin olun ve uygun yüksekliğe ayarlayın. Not: Yüksekliği mikroskop platformu dayalı seçilmelidir. Açıkça değil belirtilecektir rağmen bu yükseklik bu protokol için kullanılan tüm sonraki aynalar için sağlanmalıdır.</li>
		<li>Bir çift lens ile ışın collimate (şekil 1: L1 ve L2). Lensler odak uzunlukları 2D EOD diyafram tarafından kırpılan lazer nokta önlemek için dikkatle seçilmelidir. Kırpma 2D EOD geçtikten sonra değişiklik lazer ışını şekli ile belirgindir. Burada kolimasyon kalitesi çok önemli çünkü anomalileri tarafından sonraki lensler AMPLİFİKATÖRLÜ olacaktır ve herhangi bir sapma 2D-EOD saptırma performansı bozulacaktır. İdeal olarak, ışın demeti bir noktaya en az 20 m odaklanarak collimate.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bir iğne deliği yerleştirin (şekil 1: PH) ilk kolimasyon lens odak, uygun büyüklükte (şekil 1: L1).<ol>
		<li>Uygun ölçekli bir iğne deliği seçin. İğne deliği boyutu aşağıdaki hesaplama göre seçilebilir: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Lazer, dalga boyu λ nerede f ilk lens odak uzaklığı ise D giriş ışın çapı.</li>
		<li>İğne deliği ve sondaj ilk kolimasyon lens odak tam olarak yerleştirilebilir bir 3B Çevirme sahnede bağlarsınız.</li>
		<li>İğne deliği ve sondaj konumunu ayarlamak. Lazer güç metre sonra iğne deliği yerleştirin ve XYZ güç metre okuma en üst düzeye çıkarmak için iğne deliği konumu ayarlayın. Kırınım halkası gözlem yapılırsa, 2D-EOD önce yerleştirilen bir iris ile engelleyiniz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montajı Glan-Thompson polarize<ol>
		<li>Glan-Thompson polarize koymak (şekil 1: GP) sonra ikinci kolimasyon lens (şekil 1: L2) lazer ışını kutuplaşma temizlemek için. En fazla iletim ile yeti ölçme aygıtı bulmak için polarize döndürün.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EODs kurulumu<ol>
		<li>2 EODs kullanın (şekil 1: EOD1 &#38; EOD2) X ve Y yönde lazer saptırmak için. Lazer iletim yaw, zift ve her EOD yüksekliğini ayarlayarak en üst düzeye çıkarmak.</li>
		<li>İki EODs saygı ile her yansıtıcı kenarında üretici tarafından sağlanan hizalama işaretçisi kullanarak hizalayın.</li>
		<li>Bir sınama deseni EOD çıktısını denetlemek için 2D EOD denetleyicisine uygulamak. Bu da aşağıda açıklanan FPGA veya basit bir sinüs dalga bir işlev üreteci tarafından sağlanan üzerinden şövalyenin tur (Şekil 2) olabilir. En iyi performans için her yansıtıcı tarafından saptırma piezo nanopositioner X ya da Y yönünü paralel olmalıdır. Bu yönde iletim eksen yansıtıcılar açısal yönünü tarafından dikte edilir. 2D EOD hareket ettirmeden saptırma yönde döndürmek için piezo nanopositioner eksenleri saptırma eksenleri hizalamak için 2D EOD sonra bir güvercin prizma yerleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Yarım dalga plaka yükleme<ol>
		<li>Bir yarı-dalga tabak yerleştirin (şekil 1: W1) Glan-Thompson polarize arasında (şekil 1: GP) ve gelen lazer hizalamak için 2D EOD 2D EOD saptırma eksen ile polarizasyon ışınlayın. Uzun odak lens (300 mm) 2D-EOD sonra yerleştirin ve sCMOS fotoğraf makinesini de lazer odak yerleştirin. Daha sonra (Şekil 2) açıklanan şövalyenin Tur oluşturmak için 2D EOD açın. Bir eşit kare lazer dağıtım fotoğraf makinesinde gözlenen kadar yarım dalga plaka döndür.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Objektif çift ve geçiş objektif çift sokmaksızın bir kiriş montajı<ol>
		<li>Lensler bir çift koyun (şekil 1: L3 ve L4) sonra objektif lens arka diyafram doldurmak için ışın genişletmek için 2D EOD (şekil 1: OL) ve başka bir çift lens (şekil 1: L5 ve L6) için geçiş için mikroskop objektif odak düzlemi. ETİKET objektif bir sonraki adımda aralarında yüklü olarak lensler bu iki çift arasında yeterli yer bıraktığınızdan emin olun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dikroik filtre, 10/90 ışın bölücü, objektif, APD, objektif lens ve floresan emisyon filtre algılama yolu tamamlamak için odaklanarak yükleyin.<ol>
		<li>Dikroik filtre kurun (şekil 1: DC) lazer objektif lens doğru yansıtacak. Düz bir uzun lens tüp alt ve üst iki süsen kullanarak objektif lens Merkezi aracılığıyla gitmek için lazer hizalayın.</li>
		<li>10/90 ışın splitter kurun (şekil 1: BS) tarafından hangi % 10'u ışık görüntüleme için bir sCMOS kamera (aşağıda açıklanmıştır) ve takibi için APD için üzerinden geçer yüzde 90'ını yansıtır.</li>
		<li>APD hizalayın. Bir coverslip üzerine lazer tarafından objektif lens odak. Coverslip gelen yansıma tüm alt öğeleri de objektif odak bir coverslip koyarak ve APD okuma yoğunluğunu kontrol hizalamak için kullanın. Işın splitter sonra objektif odak APD kurun (şekil 1: L7) APD tarafından bir 3B Çevirme Sahne Alanı'nda izledi. Öyle ki amaç lazer yansımayı lens merkezinden gider objektif getirin.</li></ol></li></ol>APD pozisyon coverslip lazer yansıması dan yoğunluğu en üst düzeye çıkarmak için 3B konumlandırma ayarlayarak optimize edilebilir. Ne zaman bir hareket dedektörü konumu herhangi bir yönde yoğunluğu azalır en uygun konumda APD konumdur.
		<li>Longpass floresan emisyon filtre kurun (şekil 1: F) yansıyan ve dağınık ışık kaldırmak için ışın ayırıcı önce.</li>
	
	
	<li>Yükleme etiketi lens<ol>
		<li>ETİKET objektif lensler iki çift arasında yer ( şekil 1arasında: L4 ve L5) olarak daha önce bahsedilen ve gösterilen şekil 1. Öyle ki ışın dik merkezi etiketi lens aracılığıyla geçer yaw, pitch, yükseklik ve yatay pozisyon ayarlayın.</li>
	</ol>
	</li>

2. numune hazırlama.
<ol>
	<li>Sabit parçacık hazırlık<ol>
		<li>190 nm floresan boncuk için seyreltik ~ 5 × 108 boncuk/mL PBS içinde. Piezoelektrik sahne örnek sahibinin 400 µL boncuk çözüm coverslip ve bağlama üzerine ekleyin (Boncuk hacmi örnek tutucu üzerinde bağlıdır; burada kullanılan örnek sahibi odası çapı 18 mm olduğunu). Burada kullanılan boncuklar için PBS üzerinde coverslip yatırmak parçacıklar neden olur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ücretsiz hareketli parçacık hazırlık<ol>
		<li>110 nm floresan boncuk için seyreltik ~ 5 × 108 boncuk/mL DI su ile. 400 µL boncuk çözüm bir coverslip üzerine ekleyin ve piezoelektrik sahne örnek tutucu monte.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. izleme parametrelerini optimize edin
<ol>
	<li>Raster tarama sabit parçacıklar<ol>
		<li>Sabit parçacık örnek mikroskobunun koymak.</li>
		<li>Lazer, micropositioner denetleyicisi, piezo nanopositioner denetleyicisi, etiket objektif denetleyicisi ve EOD denetleyicisi üzerinde açın. Not sırası önemli değildir. Piezo nanopositioner kapalı döngüde çalışacak.</li>
		<li>Raster tarama 2D-bomba imha bir şövalyenin tur (Şekil 2) sürücüler, APD sayıları toplar, piezo sürücüler bir özel tarama yazılım programı (Şekil S3, yazılım yazarlar gelen istek üzerine mevcuttur), kullanarak XYZ örnek nanopositioner ve pozisyon hesaplama (Şekil S2) gerçekleştirir. Adım boyutudur 40 nm ve tarama aralığı olduğunu 2 µm.<ol>
			<li>Coverslip de objektif odak yerleştirmek için Floresans emisyon filtreyi kaldırmak ve lazer coverslip gelen yansıma micropositioner Z konumunu bir fonksiyonu olarak sinyal şiddeti en üst düzeye çıkarmak için kullanın. Odak düzlemi, örnek yerleştirdikten sonra Floresans emisyon filtre geri yerleştirin.</li>
			<li>Tarama programını açın. Tarama aralığı ve adım boyu 'Başlat', 'son' ve 'adım' sayıyı yazarak ayarlayın. Önce bir büyük tarama aralığı ve bir parçacık (örneğin, 10 x 10 µm Aralık 200 nm adım boyu ile) bulmak için adım boyu ayarlayın. Parçacık bulma sonra tarama aralığı daraltmak ve adım boyu (örneğin, 2 x 2 µm Aralık 100 nm adım boyu ile) azaltın. Floresan odak bulmak için 3D raster tarama gerçekleştirmek için 'Tarama' düğmesini tıklatın.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Ayrıca bkz: şekil 3) etiket objektif ayarları<ol>
		<li>ETİKET objektif kontrol yazılımı üzerinde'yi tıklatın. ', 'Güç' Bağlan' sırayla tıklatın.</li>
		<li>Tetikleyici sinyalleri çıktı aşaması değiştirmek için çıkış tetik modunu değiştirmek gereklidir. Önce 'Multiplane' dan 'RGB' moduna değiştirin ve sonra tekrar değiştir. Şimdi aşama olabilir (şekil 3b) değişti.</li>
		<li>Çıkış Faz 0 °, 90 ° ve 270 ° olarak ayarlayın. Faz uzayı kapsayan herhangi bir üç aşamada kullanılabilir ise, bu üç de ampirik çalışmaya bulunur (şekil 3 c).</li>
		<li>68,500 Hz frekans ayarı seçin.</li>
		<li>Uygun frekans bulmak için genellikle frekans arama aralığı değiştirmek gereklidir. ', 'Ayarı' İleri' seçeneğini tıklatın. Değişim ' Max. Freq(Hz)' sütun 0 70.000 Hz 71,500 Hz. Bu-ebilmek var olmak ayarlamak ne olursa olsun frekans aralığı uygundur. Tıklayın 'Kalibrasyon Kaydet', 'Exit kalibrasyon' (şekil 3d).</li>
		<li>Yeni bir ayar etkin kılmak için başka bir frekans (örneğin, 189,150 Hz) rezonans geçin ve sonra 68,500 Hz frekans ayarları geri (şekil 3e) değiştirdim.</li>
		<li>Genlik yavaş yavaş % 35'e değiştirin. 'Rezonans kilitle' tıklatın. Frekans kilitlendikten sonra 'Rezonans' (şekil 3e) kilidini aç'ı tıklatın. ETİKET objektif artık kullanıma hazırdır.</li>
		<li>F. tarama aralığını x, y giriş kalibre, tahmininde tahmini konumu şekil 4eiçinde gösterildiği gibi gerçek konumuna eşit hale getirmekte kullanılan parametrelerini değiştirmek için ve z ve o zaman tıkırtı 'Tarama' düğme taşımak için XYZ örnekte taramak için parçacık hareketli lazer nokta üzerinden. Lazer odak taranmış parçacık konumunu konum tahmini döngü (Şekil S1) tarafından belirlenen tahmini parçacık pozisyonla anlaşmalıdırlar. Tahmini konumu ve gerçek konumu (şekil 4 d) arasındaki ilişki (şekil 4f) tahmini konumu görüntülerden elde edilebilir. Pozisyonlar kabul etmiyorsanız, konum tahmini döngü (Şekil S1) kullanılan lazer pozisyon (ck) değerlerini ayarlamak.</li>
		<li>ETİKET objektif Hizala<ol>
			<li>ETİKET objektif denetleyicisi kapalıyken, raster (aşağıda açıklanmıştır) parçacık görüntüleri etiketi lens takmadan önce ve sonra yükleme etiketi objektif aynı görünmelidir alınan inceden inceye gözden geçirmek. Ardından, floresan parçacık Z yığın amacı konumu ve etiket lens (şekil 4) açısını ayarlamak için z nanopositioner ile hareket ettirerek tarama gerçekleştirin. Kalmayıncaya kadar hiçbir drift parçacık Albümdeki parçacık XY pozisyonu Z konumunu (şekil 4 d) bir fonksiyonu olarak herhangi bir değişiklik olduğunda elde Z yönünde boyunca XY düzlemde etiketi objektif konumunu ayarlamak. İzleme sistemi etiketi objektif hizalamasını sonra kullanıma hazırdır.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parçacık izlemek için sCMOS kamera kurulumu<ol>
		<li>Onlar izleniyorsa iken parçacıklar görselleştirmek için bir sCMOS kamera yükleyin. Sonra sadece tüm bileşenleri izleme sisteminin optimize ile yüklenip sCMOS yükleyin.</li></ol></li></ol>Sabit floresan parçacık örnek mikroskop üzerine yük ve objektif odak hacminde bir parçacık kilitlemek için izleme programını çalıştırın. Daha sonra 100 mm odak uzaklığı objektif yükleyin (şekil 1: L8) ve sCMOS. Böylece görüntü parçacık en küçük ve en parlak noktanın üzerine odaklanmıştır sCMOS pozisyonunu ayarlayýn.
	
	

4. serbestçe nano tanecikleri Difüzyon gerçek zamanlı 3D izleme
<ol>
	<li>Yerine 110 nm ücretsiz parçacık örnek üzerinde mikroskop hareket.</li>
	<li>Lazer, mikro-Pozisyoner denetleyicisi, piezo nanopositioner denetleyicisi, etiket objektif denetleyicisi ve EOD denetleyicisi açın. Piezo nanopositioner açık döngüde çalışacak. ETİKET lens yazılım adım 3.2 göre ayarlayın.</li>
	<li>Açın ve izleme yazılımı (yazarlar gelen istek üzerine mevcuttur) çalıştırın. Konumu, Bölüm 3'te bulunan en iyi duruma getirilmiş değerlerine tahmini parametreleri ayarlayın.</li>
	<li>Coverslip de objektif odak yerleştirmek için Floresans emisyon filtreyi kaldırmak ve lazer coverslip gelen yansıma micropositioner Z konumunu bir fonksiyonu olarak sinyal şiddeti en üst düzeye çıkarmak için kullanın. Coverslip bulduktan sonra lazer coverslip uzak ve çözüm içine odaklanmak için odak pozisyon 15 µm artırın. Floresans emisyon filtre geri yer.</li>
	<li>Dahili kontrol sabitler ayarlayın. Dahili kontrol sabitler düşük bir değer başlangıç ve salınım parçacığın konum dökümanları içinde görülebilir kadar yavaş yavaş artan ayarlayabilirsiniz. Salınımlarını gözlenen sonra dahili kontrol sabitler titreşimler neden değeri % 80'i için ayarlayın. Tipik değerleri 0.012 XY 'ayrılmaz kazanç' ve 'ayrılmaz kazanç' Z için 0,004 civarında olacak.</li>
	<li>İzleme eşikleri 'Parça eşik' ve 'Parça en az' ve 'Ara' ve 'Auto Track' tıklayarak izleme deneme başlayın. Eşik Sonlandırıcı takibi için biraz arka plan düzeyi daha yüksek ayarlanır ve izleme tetikleme için eşik yaklaşık iki kat arka plan daha yüksektir. Burada, izleme tetikleme için eşik 3 kHz ve yörünge sona erdirmek için eşik 1.5 kHz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells.">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure.">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).</li><li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Nanoscopy+of+Single+DNA+Molecules+by+Using+Stimulated+Emission+Depletion+(STED).">Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED).</a> Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).</li><li>Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy+of+a+fluorescent+protein-labeled+organelle+inside+a+living+cell.">Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).</li><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-resolution+3D+visualization+of+the+early+stages+of+cellular+uptake+of+peptide-coated+nanoparticles.">Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles.</a> Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+behavior+of+molecules+in+biological+systems:+breaking+the+3D+speed+barrier+with+3D+multi-resolution+microscopy.">Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy.</a> Faraday Discuss. 184, 359-379 (2015).</li><li>Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+sizing+of+nanoparticles+using+three-dimensional+single-particle+tracking.">Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).</li><li>Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+a+confocal+microscope+by+single+fluorescent+nanoparticles.">Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles.</a> Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).</li><li>Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+three+dimensional+tracking+of+a+single+nanoparticle+with+concurrent+spectroscopic+readouts.">Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).</li><li>Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved,+Confocal+Single-Molecule+Tracking+of+Individual+Organic+Dyes+and+Fluorescent+Proteins+in+Three+Dimensions.">Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions.</a> ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).</li><li>Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Three-Dimensional+Molecular+Tracking+in+Live+Cells.">Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells.</a> Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).</li><li>Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+individual+quantum+dots.">Three-dimensional tracking of individual quantum dots.</a> Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope.">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Characterization+of+the+Conformation+Fluctuations+of+Freely+Diffusing+DNA:+Beyond+Rouse+and+Zimm.">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li><li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking.">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li><li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution.">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li><li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Br&#228;uchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking.">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li><li>Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination.">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li><li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot.">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li><li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions.">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li><li>Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision.">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).</li><li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional,+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li><li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzan&#242;, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+multiple-particle+tracking+with+nanometric+precision+over+tunable+axial+ranges.">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li><li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynn&#229;, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes.">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606 (2017).</li><li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing.">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li><li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics.">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li><li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens.">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li><li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap.">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li><li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle.">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

3D tek parçacık yöntemleri izleme birçok çeşidi son yıllarda ortaya çıkan, yüksek hızlı 3D Difüzyon düşük foton sayısı hesaplı basit bir kurulum ile sağlam gerçek zamanlı izleme hala önemli biyolojik onun uygulamaya sınırlayan bir meydan okuma olsa da sorunları. 3D-DyPLoT yöntemi bu iletişim kuralı adreslerini bu sorunlar çeşitli yollarla nitelendirdi. İlk olarak, uyarma ve algılama yolları büyük ölçüde basit ve sağlam hizalama yapma diğer uygulamaları ile karşılaştırıldığında basitleştirilmiştir. İkinci olarak, hareketli lazer nokta ve konum tahmin algoritması kesin konum tahminleri için geribesleme geribildirim daha istikrarlı hale sağlamak. Üçüncü olarak, dinamik olarak hareketli lazer nokta etkili büyük algılama aralığı (1 x 1 x 4 µm) için hızlı hareket eden parçacıkların izlenmesini sağlar. Neden bu büyük Saptama alanında kritik olduğunu görmek için Piezoelektrik nanopositioner içsel tepki süresi dikkate almak önemlidir. Yüksek hızlı piezoelektrik aşamaları 1 kHz, 1 Bayan 1 ms, 4 µm2/s Difüzyon katsayısı ile 100 nm nanopartikül sırasına olmak yanıt zaman sınırlandırılması sırasına rezonanslar var, ortalama 90 nm kırınım-li ortasından diffüz mited algılama birimi. Bu sadece ortalama deplasman ve gerçekten rastgele hareket adımları çok bu odak cilt bırakarak ve geçerli yörünge bitiş parçacık önde gelen daha büyük sergileyecek. Durum, giderek daha büyük termal diffusive adımları takip kaybına yol nereye daha küçük parçacıklar için bile kötüdür. İçsel piezoelektrik sahne gecikme üstesinden gelmek ve genel sağlamlık izleme mekanizması artan büyük diffusive atlar parçacık pozisyonda kurtarmak izleme sistemi için etkili bir şekilde büyük algılama alanı sağlar. Son olarak, büyük tarama alanı kolayca yeni parçacıklar, hızlı bir şekilde elde edilebilir için ardışık yörüngeler ve derlenmiş büyük veri kümeleri için izin almak sistem sağlar.
Kullanıcı bazı önemli adımlar vardır tutmalı. İlk olarak, 2D-EOD ve etiket lens hizalamasını kritiktir. Her ikisi de en iyi hassasiyet elde etmek için hizalı gerekir. İkinci olarak, adım tarama sabit parçacık pozisyon tahmininde kullanılan parametreleri de ayarlanması gerekir (bkz. şekil 4). Tahmini parçacık pozisyon lazer tarama aralığı merkezine karşılık gelen parçacık konumuna uygun. Son olarak, geri bildirim integral sabitleri (Kben) dikkatle, küçük bir değerle başlayan ve salınım gözlenen kadar ramping sonra bu değeri yaklaşık % 80 kapalı destek şekilde ayarlanmış.
İstenen uygulamaya bağlı olarak akılda tutmak için 3D-DyPLoT hakkında bir kaç uyarılar vardır. En iyi duruma getirilmiş konum tahmini Albert ile kullanılmak üzere tasarlanmış olsa da, bu da doğru yönlü hareket uygundur. Ondan beri onun'sadece Gauss, gerçek parçacık pozisyon olarak kabul edilir pozisyonu belirsizlik algoritma doğrudan herhangi bir hareket türü için uygulanabilir. Nerede kalıcı lineer hareket bekleniyor durumlar için ek bir terim konum tahmin algoritması tahmin vadede eklenebilir ( Denklem 3 Tamamlayıcı bilgilerbakın).
2D-EOD ve etiket için parametreleri yelpazesi dikkatle 3D-DyPLoT ayarlarken dikkate alınmalıdır. Belirli 2D-EOD tarafından taranan şövalyenin tur için kullanılan depo gözü zaman önemlidir. İdeal bir senaryoda, şövalyenin tur etkili örnekleme sağlamak için etiket objektif dönemine senkronize edilebilir. Ancak, bu değişiklikleri gerilim içinde adım için 2D EOD tepki süresi dikkate almak önemlidir. Burada kullanılan birim için istenen noktaya ulaşamadan gerilim uygulandıktan sonra 2-3 µs tepki süresi vardır. 20 µs bin anda koleksiyon zaman yaklaşık % 10-15 bu. ETİKET objektif döneminde eşleşmesi azaltmak belgili tanımlık zaman ~ 14 µs 2D EOD gecikme zamanı bin zaman kısmını artırır. Bu tahminleri lazer konumu ve yanlış konumu yanlış değerleri için yol açar.
Başka bir dikkat edilmesi gereken deneyci için zamansal çözünürlük faktördür. Burada gösterilen veri 100 kHz veri hızı toplanan iken, son zamansal çözünürlük sonuçta hangi pozisyon ölçüm için veri kullanılır tanımlanır. Nanopositioner okuma parçacık pozisyon (şekil 6) kullanılırsa, zamansal çözünürlük dahili kontrol sabit değeri temel bağlıdır. Örneğin, şekil 6aiçinde-d, gösterilen dahili kontrol için Sahne 1 sırasına yanıttır şekil 6eiken-h, daha hızlı zamansal çözünürlük isterseniz sırasını 10 Bayan öyle için ms sonra konum tahmin algoritması sonucu foton foton foton sayısı oranı ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Örneğin, bir 10 kHz emisyon oranı 100 µs zamansal çözünürlük verir ve 100 kHz emisyon oranı 10 µs zamansal çözünürlük verir. Ayrıca, hassas takip beri bir <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq2.jpg"> ilişki41, kayma ve temporal hassas birleştiğinde. Sonuç olarak, sonda parlaklığını kayma ve temporal duyarlığı belirler.
Bu protokol için kurulum, düzen ve izleme yöntemini bir 2D-EOD ve dinamik olarak hızlı parçacık konum tahmini elde etmek için bir odaklı lazer nokta taşımak için etiket lens kullanan bir yüksek hızlı gerçek zamanlı 3D tek parçacık hizalamasını nitelendirdi. Sonra örnek hazırlama ve parametre optimizasyon yöntemleri tarif. 3D-DyPLoT hızlı hareket eden ve mütevazı diffusive parçacıklar yayan kilit için sağlam ve nispeten basit bir yöntem sağlar. Böylece görüntüleme modüller ile kombine kolayca herhangi bir varolan mikroskop stand yan-port eklenmesi için basit optik düzeni sağlar. Bu iletişim kuralıyla, RT-3D-SPT daha yaygın olarak üç boyutlu biyolojik süreçlerin daha fazla müfettişler tarafından hızlı, yönelik olarak uygulanan olabilir umuyoruz.

Gelişmiş görüntüleme teknikleri ortaya çıkması tüm yol aşağı moleküler seviyede hücresel olayların her zamankinden daha detaylı yapısını görmek için bir pencere açtı. Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)1,2,3, fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM)4,5,6,7 gibi yöntemleri , yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)8,9,10,11ve uyarılmış emisyonu tükenmesi mikroskobu (STED)12,13, 14 kadar yapısı ve fonksiyonu canlı hücre benzersiz detay sunmak için kırınım sınırını aşan gitti. Ancak, nasıl bu sistemlerinden davranır tam anlayış dinamik bilgi hem de yapısal bilgi gerektirir. Yukarıda listelenen süper çözünürlük yöntemleri Uzaysal çözünürlük ve zamansal çözünürlük, hangi ile dinamik süreçler probed zamansal hassas sınırlama arasında bir denge içerir. Sağlar yüksek uzaysal duyarlık ve zamansal çözünürlük RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20bir yöntem 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Burada, bir ayrım çizmek arasında geleneksel 3D-SPT30 ve RT-3D-SPT. geleneksel 3D-SPT sadece (ve ya kullanarak confocal mikroskop ya da bir epifluorescence mikroskobu alınan üç boyutlu görüntü verilerini bir saat serisi gerektirir «««verilir) doğru yapılandırma. Geleneksel 3D SPT içinde parçacık koordinatlarını veri toplama sonra parçacık her görüntü yığınında bulma ve art arda gelen birimler yerlerde birleştirerek oluşan bir yörünge oluşturmak için belirler. Bu yöntemler için nihai zamansal çözünürlük hacimsel görüntüleme hızı tarafından belirlenir. Kolayca saniye saniye onlarca ölçekte bu confocal mikroskoplar için. Neyin Aksiyel konum bilgileri elde edilebilir böylece optik yol manipüle, epifluorescence yöntemleri için zamansal çözünürlük fotoğraf makinesi Pozlama veya okuma zaman sınırlıdır. Bu epifluorescent yöntemler üzerinde eksenel bilgiler toplanabilir aralığında sınırlıdır, Fourier uçak aşamasında son ilerleme maskeleri rağmen tasarım ve adaptif optik uzanan bu aralıklar 10 µm veya daha fazla31,32 , 33 , 34.
Buna ek olarak, RT-3D-SPT bir 3D görüntü yığını edinme ve parçacıklar aslında sonra bulma dayanmaz. Bunun yerine, gerçek zamanlı konum bilgileri tek nokta dedektörleri ile elde edilir ve geri bildirim için etkili bir şekilde "kullanımı ile bir yüksek hızlı piezoelektrik sahne objektif lens odak hacmine parçacık kilit" uygulanır. Bu parçacığın konum sınırlı sürekli ölçümü sadece kaç fotonlar toplanabilir tarafından sağlar. Ayrıca, uzun aralıklarında hareket ederken bu yöntem parçacık spektral sorgulama sağlar. RT-3D-SPT etkin inşaat benzer-e doğru neyin parçacık sürekli probed ve büyük lazer gücü gerek kalmadan gerçek zamanlı veya optik ölçülen Nano nesneleri, kuvvet-Alerjik optik tuzak zorlar. Verilen bu RT-3D-SPT hızlı diffusive nesneleri (ilâ 20 µm2/s)25,29 düşük foton sayısı oranları20,29üç boyutlu olarak sürekli sorgulama için bir araç sağlar, 35, bunu sağlamak bir pencere içine hızlı veya geçici biyolojik süreçlerin hücre içi kargo taşımacılığı, ligand-reseptör bağlama ve tek virions ekstrasellüler dinamikleri gibi. Ancak, şu ana kadar RT-3D-SPT uygulanması bu teknoloji ilerlemek için çalışma grupları avuç sınırlı olmuştur.
Çeşitlidir RT-3D-SPT yöntemler tarafından gerekli optik düzen karmaşıklığı bir engeldir. En yöntemleri için optik görüş piezoelektrik bir sahne ile sağlanır. İçinde X, Y veya Z, dökümanları tek nokta dedektörleri üzerinden hata işlevleri için dönüştürülür ve de beslenen parçacık yapar küçük hareketleri olarak piezoelektrik nanopositioner için yüksek hızlı içinde açmak parçacığın hareketi, etkili bir şekilde karşı koymak için örnek taşır yerde objektif lens göreli kilitleme. X, küçük pozisyonel hareketleri ölçmek için Y ve Z, birden çok Dedektörler (4 veya 5 uygulama bağlı olarak)15,18,21 ya da birden çok uyarma noktalar (2-4, hangi daha düşük eğer uygulanabilir bir amplifikatör kilit-in X ayıklamak için kullanılır ve bir döner kullanarak Y konumunu lazer nokta)25,28 uygulanır. Bu birden fazla algılama ve emisyon noktalarından örtüşme sistemleri hizalayın ve korumak zor yapmak.
Burada, biz 3D-DyPLoT29denen bir basitleştirilmiş optik tasarımı ile yüksek hızlı hedefe kitlendik 3D-SPT yöntemi mevcut. 3D-DyPLoT dinamik olarak odaklı lazer nokta yüksek bir oranı (50 kHz XY, 70 kHz Z) objektif odak seste aracılığıyla taşımak için bir 2D EOD ve etiket objektif36,37,38 kullanır. Lazer odak konumu ve foton varış saati birleştiren parçacığın 3B konumlandırma hızla bile düşük foton sayısı oranları elde edilecek sağlar. 1 x 1 µm X-Y düzlemde bir kare boyutu ile bir şövalyenin Tur Model39 ' lazer odak 2D EOD sürücüler ve etiket objektif lazer odak aralığı 2-4 µm ile eksenel yönde hareket eder. 3D parçacık pozisyon bir en iyi duruma getirilmiş konum tahmin algoritması29,40 3D ile elde edilir. Çığ fotodiyot (APD), gerçek zamanlı parçacık pozisyonu hesaplama, piezoelektrik sahne geri bildirim ve veri kayıt sayma 3D dinamik olarak hareketli lazer nokta, foton kontrolünü bir alan programmable gate array (FPGA) yapılmaktadır.Bu iletişim kuralı, biz 3D-DyPLoT mikroskop optik uyum, kalibrasyon ile sabit parçacıklar, dahil olmak üzere adım adım inşa etmek nasıl açıklar ve nihayet parçacık izleme ücretsiz. Bir gösteri 110 nm floresan boncuk sürekli suda dakika bir anda için takip.
Burada açıklanan yöntemi nerede sürekli virüsler, nano tanecikleri ve veziküller gibi endosomes gibi düşük seviyelerde hafif, hızlı hareket eden floresan sonda izlemek için istenen herhangi bir uygulama için ideal bir seçim var. Önceki yöntemler aksine, yalnızca bir tek uyarma ve tek algılama yolu, hizalama ve bakım basit yapma işte. Ayrıca, kolayca düşük sinyal seviyeleri (aşağı 10 kHz), izleme özelliği bu yöntem düşük ışık uygulamaları29için ideal yapar iken hızlı parçacıklar, difüzyon kadar almak bu mikroskop büyük algılama alanı sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1075">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">2D Electro-optic Deflector&#160;</td>
			<td style="width:145px;">ConOptics</td>
			<td style="width:160px;">M310A</td>
			<td style="width:541px;">2 required</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Power supply for EOD</td>
			<td style="width:145px;">ConOptics</td>
			<td style="width:160px;">412</td>
			<td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TAG&#160; Lens</td>
			<td style="width:145px;">TAG Optics</td>
			<td style="width:160px;">TAG 2.0</td>
			<td>Used to deflect laser along axial direction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">XY piezoelectric nanopositioner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">Nano-PDQ275HS</td>
			<td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Z piezoelectric nanoposiitoner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">Nano-OP65HS</td>
			<td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Micropositioner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">MicroDrive</td>
			<td>Used to coarsely position sample and evaluate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Objective Lens</td>
			<td style="width:145px;">Zeiss</td>
			<td style="width:160px;">PlanApo</td>
			<td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:145px;">PCO</td>
			<td style="width:160px;">pco.edge 4.2</td>
			<td>Used to monitor the particle&#39;s position</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">APD</td>
			<td style="width:145px;">Excelitas</td>
			<td style="width:160px;">SPCM-ARQH-15</td>
			<td>Lower dark counts beneficial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Field programmable gate array</td>
			<td style="width:145px;">National Instruments</td>
			<td style="width:160px;">NI-7852r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Software</td>
			<td style="width:145px;">National Instruments</td>
			<td style="width:160px;">LabVIEW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tracking excitation laser</td>
			<td style="width:145px;">JDSU</td>
			<td style="width:160px;">FCD488-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-150-A-ML</td>
			<td>L1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Pinhole</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">P75S</td>
			<td>PH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Glan-Thompson Polarizer</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">GTH5-A</td>
			<td>GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Half-wave plate</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">WPH05M-488</td>
			<td>WP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-75-A-ML</td>
			<td>L3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-250-A-ML</td>
			<td>L4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Dichroic Mirror</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>DC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Fluorescence Emission Filter</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">D535/40m</td>
			<td>F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">10/90 beamsplitter</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">21012</td>
			<td>BS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">190 nm fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>FC02F/9942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">110 nm fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>FC02F/10617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Powermeter</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">CMOS</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">DCC1545M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Iris</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">SM1D12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td style="width:145px;">Mad City Labs</td>
			<td style="width:160px;">RM21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

Gerçek zamanlı üç boyutlu tek parçacık (RT-3D-SPT) izleme hücresel sistemlerinde hızlı, 3D işlemler ışık potansiyeline sahiptir. Her ne kadar son yıllarda çeşitli RT-3D-SPT yöntemler ileri koymak, yüksek hızlı izleme düşük foton sayısı oranları parçacıklar Difüzyon 3D bir meydan kalır. Ayrıca, RT-3D-SPT kurulumları genellikle biyolojik ilgili sorunların yaygın uygulama sınırlama uygulamak, zor ve karmaşık. Bu iletişim kuralı düşük foton sayısı hesaplı (aşağı 10 kHz) 3D dinamik foton yerelleştirme hangi parçacıklar (en fazla 20 µm2/s) yüksek diffusive hız ile izleyebilirsiniz izleme (3D-DyPLoT), adlı bir RT-3D-SPT sistemi sunar. Akort akustik degrade (TAG) objektif bir tek odaklı sürücü lazer nokta dinamik olarak 3D ve 3D-DyPLoT bir 2D elektro-optik saptırıcı (2D-EOD) istihdam. Bir en iyi duruma getirilmiş konum tahmin algoritması ile birlikte, 3D-DyPLoT yüksek izleme hız ve yüksek yerelleştirme hassasiyet ile tek parçacıklar üzerine kilitleyebilirsiniz. Tek uyarma ve tek algılama yol yerleşim nedeniyle, 3D-DyPLoT sağlam ve kurulumu kolay. Bu iletişim kuralı, 3D-DyPLoT adım adım inşa anlatılmaktadır. İlk olarak, optik düzen açıklanmıştır. Ardından, sistemi kalibre edilmiş ve 190 nm floresan boncuk piezoelektrik nanopositioner ile tarama raster tarafından optimize edilmiştir. Son olarak, gerçek zamanlı 3D yetenek izleme göstermek için 110 nm floresan boncuk suda izlenir.

Sabit parçacık (şekil 4) tarama ve izleme serbestçe akışkanın 110 nm floresan parçacık (şekil 5) Yukarıdaki protokol sonrası yapıldı. Parçacık tarama tarama, her bir noktada pozisyon aynı anda parçacığın hesaplama tahmini piezoelektrik nanopositioner ve depo gözü fotonlar hareket tarafından gerçekleştirildi. Bir kare bile yoğunluk (şekil 4a) tarama görüntü gösterir ve tahmini konumları parçacığın gerçek konumu x, 1 × 1 × 2 µm aralığında doğrusal bir ilişki göstermek y ve z yön (şekil 4b-f).
Gerçek zamanlı izleme göstermek için 110 nm floresan parçacıklar suda 3D-DyPLoT tarafından (şekil 5a, b) takip. Ortalama kare deplasman (MSD) analiz tipik bir doğrusal davranışı karakteristik Albert hareket (şekil 5 c) gösterir. 30 yörüngeleri MSD analizi gösterdi demek hidrodinamik çapı 110 nm, iyi anlaşma ile izlenen floresan nano tanecikleri (şekil 5 d) boyutu için üreticileri tayini. Ayrıca, film 1 gerçek zamanlı piezoelektrik nanopositioner sonuçlar gösterir ve sCMOS görüntüler bir serbestçe akışkanın 110 nm floresan parçacık 2 dk uzun yörüngesini için senkronize.
Yüksek hız ile izlemek mümkün olmanın yanı sıra, yavaş hareket eden parçacıkları ile yüksek hassasiyetli yerelleştirilebilir. Şekil 6a - d gösterir sabit parçacıkların aynı geri bildirim parametreleri olarak kullanılacak izleme, 17,6, 26,4 ve 53.4 duyarlığını gösterilen yüksek hız için kullanma 3D-DyPLoT sistemi uygulamaya nm x, Y ve Z, sırasıyla 10 foton sayısı oranı ile5. Şekil 6e - h geribildirim kontrolünde etkili hız hassasiyet için takas ve 6.5, 8.3 ve 10,5 duyarlığını sergilenmesi 10 katına azaltılmış duyarlık gösterir nm x, Y ve Z, anılan sıraya göre.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig1.jpg"> 
Şekil 1. 3D takip sistemi şematik. 2D EOD (EOD1 &#38; EOD2) ve etiket lens (TAG) saptırmak lazer XY ve Z yön boyunca sırasıyla. (APD) APD FPGA (FPGA) gönderilen Floresans fotonlar toplamak için kullanılır. FPGA pozisyonu hesaplama algoritması, foton sayma, 2D-EOD kontrolünü yanı sıra denetim ve okuma piezoelektrik nanopositioner (NSxy ve NZz) için kullanılır. Bu şekilde etiketli diğer bileşenleri: aynalar (M); lensler (L #); iğne deliği (PH); Glan-Thompson polarize (GP); yarım dalga plaka (W1); dikroik filtre (DC); objektif lens (OL, 100 X NA 1.49 =); Floresans emisyon filtre (F); ışın ayırıcı (BS); XY micropositioner sahne (MSxy); Z micropositioner sahne (MSZ'den). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/56711fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig2.jpg"> 
Şekil 2. Koordinatları 3B-DyPLoT içinde uygulanan şövalyenin tur için. Eksen 1 ve eksen 2 X veya Y ekseni boyunca 2D EOD doğru hizalaması tarafından uyumlaştırılması gerekmektedir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/56711fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig3.jpg"> 
Şekil 3. ETİKET objektif yazılım ayarları. Daha fazla bilgi için Bölüm 4.2 etiketi objektif ayarlarına bakın. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/56711fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig4.jpg"> 
Şekil 4. Parçacık tarama ve konum tahmini. (a) 190 nm floresan tarama görüntü boncuk 2D-EOD lazer bir 1 × 1 µm sürüş ile knight's tur desen kare. Floresan yoğunluğu renkle gösterilir. Birim: kHz. (b) x tahminik, 2D-bomba imha merkezine göre parçacığın konum mikrometre içinde inceden inceye gözden geçirmek. B, cve d renk tahmini konumu gösterir. Birim: µm. (c) tahmini yk mikrometre. (d) zk, etiket objektif Aksiyel Merkezi göre parçacığın konum tahmini mikrometre içinde tarama. (e) tahmini parçacık konum yk sahne bir fonksiyonu olarak pozisyon (c) tüm ızgara üzerinde ortalama. Not konum tahmin algoritması (yk) alınan tahmini parçacık pozisyon gerçek konumu ile kabul eder. (f) tahmini parçacık pozisyon zk sahne bir fonksiyonu olarak pozisyon (d) tüm ızgara üzerinde ortalama. 1 × 1 × 2 µm Aralık üzerinde parçacığın gerçek pozisyon doğrusal bir ilişki tahmini konumu gösteren X, Y ve Z yönünde. Not konum tahmin algoritması (zk) alınan tahmini parçacık pozisyon gerçek konumu ile kabul eder. X, Y, 1 × 1 × 2 µm Aralık üzerinde parçacığın gerçek pozisyon doğrusal bir ilişki tahmini konumu gösterir ve Z yönünde. Beyaz ölçek barlar (bir-c) temsil 500 nm ve siyah ölçek çubuğu (d) 2 µm. temsil eden <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/56711fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig5.jpg"> 
Şekil 5.110 nm floresan parçacıklar suda ıslatın ve 3D-DyPLOT izleme. bir serbestçe akışkanın 110 nm floresan nanopartikül su (bir) 3D yörünge. (b) (bir) içinde yörünge için zamanın bir fonksiyonu olarak floresan yoğunluğu. (c) (bir) içinde yörünge MSD. Mavi çizgili ölçülen MSD ise noktalı kırmızı çizgi en uygun doğrusal regresyon üzerinden çizgidir. ortalama bir hidrodinamik çap 110 gösterilen 30 yörüngeleri analizini (d) MSD nm, izlenen floresan nano tanecikleri iyi anlaşma boyutu ile. Parçacıklar çapını Stokes-Einstein ilişkisine kullanılarak hesaplanır. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/56711fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig6.jpg"> 
Şekil 6. Hassas izleme sabit parçacığın. (bir) A sabit parçacık 3D-DyPLoT farklı sayısı hesaplı tarafından takip edilir. Hassas x (b) 17,6 nm, (c) 26,4 nm içinde Y ve z (d) 53.4 nm'de 100 kHz bir emisyon oranı var. (ne zaman yavaş işlemlerin, geribildirim kontrol sondalamae) sabiti (Kben) hassas artırın-10 katına azaltılabilir. Bu azaltılmış geribildirim kontrol altında duyarlık (f) 6.5 nm x, (g) 8.3 nm içinde Y ve z (h) 10,5 nm'de 100 kHz bir emisyon oranı var. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/56711fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Rakam S1. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/fig_S1_position_estimation-01.pdf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Rakam S2. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/fig_s2_TAG_operation.pdf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Rakam S3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/fig_s3_software.pdf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı bilgiler. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/170802_software_description.pdf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking at JoVE.com

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

İnşaat ve gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme mikroskop izleme Nano floresan yetenekli probları yüksek diffusive hızları ve düşük foton sayısı oranları bu protokolü ayrıntıları.

Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Görüntüleme.  Duke University. İnşaat ve gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme mikroskop izleme Nano floresan yetenekli probları yüksek diffusive hızları ve düşük foton sayısı oranları bu protokolü ayrıntıları.

Video: A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Biyomühendislik

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Parçacık izleme Microrheology tarafından Biyofilmler Mekanik Özelliklerinin Yerinde Haritalama

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Biyoproseslerde Tek Hücreli Morfolojinin Gerçek Zamanlı Tayini İçin Mikroskopi

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). Electrochemically reduced graphene oxide acts as the conducting layer and polyaniline acts as a pH-sensitive layer. The pH-dependent conductivity of polyaniline occurs by doping of holes during protonation and by the dedoping of holes during deprotonation. We found that an ERGO-PA solid-state electrode was not functional as such in fermentation processes. The electrochemically active species that the bacteria produce during the fermentation process interfere with the electrode response. We successfully applied Nafion as a proton-conducting layer over ERGO-PA. The Nafion-coated electrodes (ERGO-PA-NA) show a good sensitivity of 1.71 &#937;/pH (pH 4 - 9) for chemiresistive sensor measurements. We tested the ERGO-PA-NA electrode in real-time in the fermentation of Lactococcus lactis. During the growth of L. lactis, the pH of the medium changed from pH 7.2 to pH 4.8 and the resistance of the ERGO-PA-NA solid-state electrode changed from 294.5 &#937; to 288.6 &#937; (5.9 &#937; per 2.4 pH unit). The pH response of the ERGO-PA-NA electrode compared with the response of a conventional glass-based pH electrode shows that reference-less solid-state microsensor arrays operate successfully in a microbiological fermentation.

Here, we report the protocol for the fabrication of a Nafion-coated, polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide chemiresistive micro pH sensor. This chemiresistor-based, solid-state micro pH sensor can detect pH changes in real-time during a Lactococcus lactis fermentation process.

Nafion kaplı imalatı, mikrobiyal fermantasyon sırasında gerçek zamanlı monitör pH grafen oksit/Polyaniline Chemiresistive sensör azaltılmış

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...