Bu çalışma, (BAS) 2 R15 GM061539-02 hibe (JEL) 2. R15 NS40425-03, MH 66179 (Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi / OHSU Dr Gary Banker) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen ve P30 edildi NS061800 (OHSU Dr Sue Aicher için). Biz hipokampalinden kültürü ile geniş destek için Barbara Smoody teşekkür ve Dr. Bu yazının bir eleştirel okuma Brian Uzun ve James Abney.

1.. Numune Hazırlama <ol><li> Standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak, DCVs hedeflenmiş bir photoconvertible veya foto-aktifleştirilebilen kimera kodlayan DNA hazırlayın. Not: Bir olasılık, DNA kodlayan bir doku plazminojen aktivatör-Dendra2 kimera (tPA-Dendra2). Dendra2 yeşilden morötesi ışığa maruz kalma üzerine, 12 kırmızı emisyon geçer photoconvertible bir proteindir. </li><li> Yüksek performanslı # 1.5 kapağında Kültür hipokampal nöronlar standart protokollere 13 aşağıdaki ~ 5-10 gün boyunca kayar. </li><li> Bir katyonik lipid tepkime maddesi kullanılarak hipokampal nöronlar geliştirilmesi transfer edin. Not: Viral aracılık ettiği enfeksiyon olgun nöronlar için daha etkilidir. Bu alternatif yaklaşım, başka bir yerde, 14 detaylı bir şekilde tarif edilmiştir. <ol><li> ~ 1 ug DNA ve minimum temel ortam (MEM) ve katyonik lipid tepkime maddesi 4 ul ve 250 ul ihtiva eden ikinci bir 1.5 ml tüp 250 ul ihtiva eden bir 1.5 ml tüpü hazırlayınMEM. </li><li> 5 dakika için çözümler inkübe edin. </li><li> Iki çözeltinin birleştirin ve fazladan bir 30 dakika boyunca inkübe edilen karışımın. </li><li> İnkübasyon sırasında, kültür ortamı birkaç ml ihtiva eden bir tabak 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı hazırlamak </li><li> Yavaşça sıcak ortamı içeren çanak nöron içeren kapak fişleri aktarmak ve transfeksiyon karışımı ekleyin. </li><li> Yavaşça çanak yatırın ve daha sonra 90 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin. </li><li> Kendi &quot;ev çanak&quot; nöronların dönün ve ~ 12-18 saat bekleyin. </li></ol></li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 4 paraformaldehid /% 4 sukroz içinde 45 dakika boyunca, hücreler (PBS, pH 7.4) 37 ° C&#39;ye ısıtıldı Not: PALM deneylerde, bu ultrastrüktürdeki iyi bir koruma elde etmek için önemlidir ve immünofloresan boyama için kullanılan standart formaldehit tespit protokoller genellikle 15 yeterli değildir. Zayıf yapısal korunması için bir önemli nedeni yetersiz fformaldehit tespit adukt oluşumunu ve protein çapraz bağlanmayı gerektirir, ve ikincisi süreç 16 oldukça yavaş ixation zamanı çünkü. Bir 45 dakika tespit Flüoresansın saptanabilir overfixation kaynaklı kaybı ile bu sorunu azaltmaya yardımcı olur. </li><li> Yıkama kapak süzülmüş PBS ile ~ 10x kayıyor. Not: Bu floresan kirleticileri azaltır. Görüntü örnekleri nispeten hızlı bir şekilde tespit sonrası. Bir ışık geçirmez bir kap içinde, filtre PBS içinde 4 ° C de ara depolamak hücrelerinde. </li><li> Süzülmüş, PBS içinde bir bölme ihtiva eden nöronların Dağı kapak slipleri. Not: Örnek camın daha düşük bir kırılma endeksi ile PBS gibi sulu bir ortamda, monte edilmelidir, toplam iç yansıma flüoresans (TIRF) bazlı aydınlatma uygulamak. Sadece kapak kayma-proksimal flüoroforlar heyecanlıyız çünkü TIRF-tabanlı aydınlatma çok yararlı olduğunu ve eşiğe 17 büyük ilişkili düşüş var. </li></ol> 2.. Image Acquisition &lt;/ P&gt; <ol><li> Süper çözünürlük görüntüleme sistemi açın. <ol><li> Ark lambasını açmak. </li><li> Için (güç uzaktan anahtarı) &quot;Sistem / pc&quot; ve &quot;bileşen&quot; anahtarları çevirin &quot;üzerine.&quot; </li><li> Bilgisayar (mikroskop kontrol tablet / docking istasyonu sonra yanar) açın. Not: Docking istasyonu optik ve ışık yolu birçok niteliğini, objektif ve odak özellikle seçim kontrol etmek ve izlemek için kullanılır. </li><li> Çift yazılım simgesini tıklatın ve oturum açma iletişim kutusunda &quot;start sistemi&quot; seçeneğini seçin. </li></ol></li><li> Örneği inceleyin. <ol><li> Lazer güvenlik kabini üzerinde ön ve üst erişim panellerini açın. </li><li> Sahne ve hedeflerini ulaşmak için iletilen ışık kolunu eğin. </li><li> Alfa Plan-Apochromat 100X sayısal açıklık üzerinde yağ koymak / NA 1.46 (TIRF) nesnel =. Not: A 63X yüksek NA amacı 100X yerine kullanılabilir. </li><li> Sahnede örnek montaj ve inci yükseltmeknumunenin doğru e objektif. </li><li> Docking istasyonunun XYZ fonksiyonunu kullanarak mercek konumunu izlemek. Lens odak Basketbol Sahası (örneğin, z ~ 2.50 mm) olduğu zaman durdurun. </li><li> Tam erişim panelleri kapatın. Not: lazer güvenlik meşgul etmek. </li><li> İnce ayar bulmak sekmesinde Okülerin ve düğmelerini kullanarak odağı. Not: bulmak sekmesi ark lambası-tabanlı aydınlatma üretmek ve Okülerin ile numunenin doğrudan gözlem kolaylaştıran düğmeler erişim sağlar. Benzer şekilde, satın alma sekmesi lazer tabanlı aydınlatma üretmek ve kamera tarafından görüntü yakalama kolaylaştırır araçlara erişim sağlar. <ol><li> Seçin, bulmak sekmesine gidin &quot;Trans On.&quot; </li><li> Oküler genişleme sembolünü tıklatın. Not: Bu ışık yolu bir şemasını getirir. Işık yolu Özellikler sol şematik uygun simgeleri tıklatarak veya docking istasyonunun üzerindeki dokunmatik ekran kullanılarak değiştirilebilir. Örneğin, bir filtreDendra2 gelen emisyon görüntüleme için uygun reflektör tabanca simgesini kullanarak seçilebilir. </li><li> Okülerler içine bak ve bir rehber olarak docking istasyonunu kullanarak odak noktası haline hücreleri getirmek. Not: hipokampal nöronlar transfect zordur, ve böylece yansıyan aydınlatma kullanarak odaklanmak için biraz zor olabilir, çünkü örnek çok seyrek floresan hücreleri ile doldurulur olacaktır. Bu durumda, bir rehber olarak iletilen aydınlatma ve yerleştirme istasyonunun z okuma kullanın. </li><li> Odaklama sonra &quot;Off&quot; ışık geçiş. </li></ol></li></ol></li><li> , Oldukça parlak noktasal floresan sergiler ve iyi bir sağlık göstergesidir klasik bir morfolojiye sahip bir hücre belirleyin. <ol><li> Yansıyan ışık ve Dendra2 yeşil emisyon görüntüleme için filtre uygun olanı seçin. </li><li> Düşük yoğunluklu uyarma ışık kullanarak Dendra2 kuruntulardan sentezleyen hücrelerin kapak kayma tarayın. </li></ol></li><li> ACQ geçinuisition sekmesi. <ol><li> Uygun tasarlanmış ya da kolayca değiştirilebilir bir PALM edinim yapılandırmayı yüklemek için &quot;deneme yöneticisini&quot; kullanın. Not: Lazer güç kaydırıcıları: yok böyle bir deney varsa, bir kılavuz olarak aşağıdaki ayarları kullanarak bir başlangıç ​​deneysel tasarım yapılandırmasından 405 nm (~ 50 mW lazer için% 0,01); 488 nm (~ 100 mW lazer için% 3); 561 nm (~ 100 mW lazer için 40%); Pozlama süresi: ~ 50 msn; Kamera kazanç: ~ 200; Çok boyutlu edinimi: zaman serisi (çevrim = 30.000, interval = 0); Tracks: epi-aydınlatma ile 488 nm ve TIRF-tabanlı aydınlatma (adım 2.5.1 bakınız) ile 561 nm; Amaç: 100X (NA 1,46 =); TIRF açı kaydırıcı: zaviyesi ~ 67-72 °; Piksel boyutu: 100 nm; Görüş alanı: TIRF (alternatif seçenekler yüksek lazer yoğunluklarını verim ve ağartmak için daha zor floroforlar için kullanılır). </li><li> Bir pop-up menü lazerler açıldıktan yaklaşık bir sorgu ile göründüğünde &quot;evet&quot; tıklayın. </li></ol></li><li> Görüntü getirinKamera düzlemde odak noktası haline hücre. <ol><li> 488 nm epi-aydınlatma lazer parçayı seçin. Not: Parçalar görüntüleme sırasında kullanılan ışın yapılandırmalar. Burada, parça adları kameraya geçirilen emisyon üretir uyarım dalga boyu ile belirlenir. Örneğin, 561 nm parça 405 ve 561 nm lazer çizgileri hem de kullanır, ancak filtre küp kameraya 561 nm ışık heyecanlı photoconverted Dendra2 sadece emisyon geçer. </li><li> &quot;Sürekli&quot; toplama düğmesini kullanarak kamera hücrenin görüntüsünü odaklanın. </li></ol></li><li> Geleneksel geniş açılı görüntü toplamak. <ol><li> &quot;Yakala&quot; düğmesini kullanın. </li><li> &quot;Dosya&quot; menüsünden gidiyor ve seçerek görüntüyü kurtarmak &quot;olarak kaydetmek / kaydedin.&quot; </li></ol></li><li> TIRF-tabanlı aydınlatma ayarlayın. <ol><li> 488 parça seçin ve EPI / TIRF düğmesini kullanarak &quot;TIRF&quot; geçmek. </li><li> &quot;Sürekli&quot; satın seçin. </li><li> T ayarlayınO TIRF-tabanlı aydınlatma kaymak. Not: Orada arka ani yitirmesidir VE numune BİR düzlemde 18 odaklı olabilir zaman TIRF elde edilir. Yeni özellikler numune içine odaklanarak yoluyla belirgin hale gelirse TIRF odak tek bir uçak olduğundan, geliş açısı çok düşük. </li><li> Çift 405 nm lazer ile 561 parçayı kullanarak TIRF açısını kontrol &quot;kapalı.&quot; </li><li> Bir PALM deney başlamadan önce &quot;on&quot; Geri 405 nm lazer çevirin. </li></ol></li><li> PALM verileri toplayın. <ol><li> &quot;Deney başlar.&quot; Hit Not: İstenirse, &quot;online işlem seçenekleri&quot; sekmesini açın ve ham veri toplama sırasında yeniden PALM görüntüyü izlemek için (deney başlamadan önce) &quot;online işlem PALM&quot; ve &quot;Fit Gauss2D&quot; kontrol edin. Bu, verilerin kalitesi ve nispeten zaman alan bir veri toplama işlemi devam böylece değerinin değerlendirilmesini kolaylaştıracaktır. </li><li> GörmeFotoçevrim monitör. </li><li> 405 nm (photoconverting) lazer yoğunluğunu artırın zaman Dendra2 Fotoçevrim azalıyor (genelde ~ 10.000 ham görüntülerin kazanılmasından sonra). </li><li> Fotoçevrim artar eğer denemelerimiz devam ediyor. Aksi takdirde, &quot;dur&quot; Geçerli adım düğmesine basarak (veri kaybı olmadan) Denemeyi durdurmak. </li><li> Veri toplama (~ 15 dakika sonra) tamamlandığında kaydedin. </li></ol></li></ol> 3.. Görüntü İşleme, Görüntü ve Analiz <ol><li> Diske kaydedildiği online işlem, süreç ham görüntülerin yokluğunda. <ol><li> , Işlem sekmesine tıklayın yöntem sekmesini açın ve &quot;PALM.&quot; </li><li> Dört suboptions tekrar &quot;PALM&quot; seçiniz. </li><li> Açık, dosya menüsüne gidin ve ilgi dosyasını görüntülemek ve hit &quot;seçeneğini seçin.&quot; </li><li> Hit &quot;uygulanır.&quot; Not: Bu varsayılan opti tepe / fluoroforun bulgu ve zirve lokalizasyonu başlatacaktırons. Gerekirse, zirveleri de &quot;PAL-Grubu&quot; sekmesi kullanılarak toplanabilir. Gruplama zirve koordinatlar yeterince benzer olup olmadığını tek bir molekülün birkaç ardışık kare görünür zirveleri atar. Buna ek olarak, veri yazılımın model tabanlı sürüklenme hizalama seçeneğini kullanarak örnek sürüklenme için düzeltilebilir. </li></ol></li><li> Tepe-lokalize veri kötü lokalize ve kötü örnek bileşenleri filtre. <ol><li> Yerelleştirme kesinleşmemiş ile floroforları atmak, σ,&gt; &quot;PAL-Filter&quot; aracını kullanarak 35 nm. </li><li> Zirveleri, d arasındaki ortalama mesafe, çap, D. kabarcıklarına çözmek için çok büyük olduğu alanlarda florosforlar atın <ol><li> Yerelleştirme hassas histogramdan, σ, ortalama yerelleştirme hassasiyet ayıklayın. </li><li> Σ dayalı d için kabul edilebilir maksimum değeri ve Shannon-Nyquist criteron 19 hesaplayın, çözünürlük yaklaşım 20 R somutlaşan gibi = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2. </li><li> Yarıçapı D / 2 bir daire içinde / (4d 2) πD 2 daha az çevrili zirveleri silmek için &quot;PALM aykırı Kaldır&quot; aracı komşular eşik ayarlayın. </li></ol></li><li> &quot;PAL-Rendering&quot; aracını kullanarak bir PALM görüntü içine işlenmiş PALM verileri dönüştürmek; Şekil 1&#39;e bakınız. </li><li> &quot;Profil&quot; fonksiyonunu seçerek boyutlarını ve ayrımları ölçmek. <ol><li> Ilişkili hat ve masa seçenekleri kontrol ve görüntüde istenilen yöne boyunca bir çizgi çizin. </li><li> Yarı-maksimum yoğunlukta tam genişlikler saptanmasıyla çapları ölçmek. </li><li> Yoğunluk profilleri tepe-tepe aralıkları belirleyerek ayrımları niceliğini. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components.">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li><li>Combs, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+a+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2010).</li><li>Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cell+structure+and+function+with+point-localization+superresolution+imaging.">Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging.</a> Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Bury, L. A., Sabo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+trafficking+of+synaptic+vesicle+and+active+zone+proteins+prior+to+synapse+formation.">Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation.</a> Neural Dev. 6, 24 (2011).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activity-dependent+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+from+axon+and+dendrite.">Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite.</a> J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).</li><li>Tao-Cheng, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+active+zone+and+synaptic+vesicle+proteins+in+a+preassembled+multi-vesicle+transport+aggregate.">Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate.</a> Neuroscience. 150, 575-584 (2007).</li><li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+the+presynaptic+active+zone:+a+characterization+of+an+active+zone+precursor+vesicle.">Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle.</a> Neuron. 29, 131-143 (2001).</li><li>Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+presynaptic+active+zones+from+cytoplasmic+transport+packets.">Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets.</a> Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).</li><li>Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+CNS+synaptogenesis.">Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis.</a> Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).</li><li>Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+29+kDa+intracellular+chloride+channel+p64H1+is+associated+with+large+dense-core+vesicles+in+rat+hippocampal+neurons.">A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> Biotechniques. 42, (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Scalettar, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindered+submicron+mobility+and+long-term+storage+of+presynaptic+dense-core+granules+revealed+by+single-particle+tracking.">Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking.</a> Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat Methods. 6, 21-23 (2009).</li><li>Helander, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+binding+in+brain+and+kidney:+A+kinetic+study+of+fixation.">Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation.</a> Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+calibration+of+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+systems.">Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems.</a> Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).</li><li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+in+the+presence+of+noise.">Communication in the presence of noise.</a> Proc IRE. 37, 10-21 (1949).</li><li>Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh+resolution+imaging+of+biomolecules+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).</li><li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis.">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat Methods. 8, 969-975 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Zhong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+localization+microscopy+(PALM):+an+optical+technique+for+achieving+~10-nm+resolution.">Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li><li>Lochner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+copackaging+and+cotransport+yields+postsynaptic+colocalization+of+neuromodulators+associated+with+synaptic+plasticity.">Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity.</a> Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).</li><li>Geisler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drift+estimation+for+single+marker+switching+based+imaging+schemes.">Drift estimation for single marker switching based imaging schemes.</a> Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

PALM ve ilgili süper çözünürlüklü floresan mikroskopi teknikleri son zamanlarda optik ve elektron mikroskopi (EM) 22-24 daha iyi yerleşmiş biçimlerine değerli bir tamamlayıcısı olarak ortaya çıkmıştır. PALM olumlu nitelikleri nispeten basit örnek hazırlama ve minimal örnek sarsımına içerir. İlke olarak, aynı zamanda oturma PALM hücreleri incelemek için kullanılabilir. Muhtemelen PALM temel olumsuz özelliği belirgin canlı hücreler daha hızlı dinamik süreçlerin çalışmalarını engellemektedir zaman alıcı veri toplama, olduğunu. Buna ek olarak, PALM nispeten yeni olduğunu ve bu nedenle uygun, sağlam flüoroforlar ve numune hazırlama ve veri toplama ve analiz için protokolleri tam olarak gelişmiş ve / veya 3 belgelenmiş değildir. Burada sabit, kültür hücrelerinde kesecikler tek renk, PALM-temelli çalışmalar için uygun bir protokol tanımlanmıştır. Protokol da benzer şekilde geliştirilmesi için iyi bir başlangıç ​​noktasıdıryönlendirilmiş, çift renkli PALM çalışmaları. Bizim protokol etkinliği bizim PALM verilerin iki temel nitelikleri tarafından desteklenmektedir. Birincisi, bizim yeniden PALM, ve tamamlayıcı Widefield, görüntülerde punktumlarda dağılımı çok benzer. Dağılımında önemli bir fark - PALM tarafından birden puncta içine kırınım-sınırlı punktumlarda arada çözünürlük - PALM belirgin gelişmiş çözünürlük yansıtır ve daha fazla tekniğin etkinliğini ve yarar altını çiziyor. İkincisi, bizim PALM sonuçlar diğer ilgili sonuçları ile tutarlı iyi bir uyum içindedir, ve / veya. Örneğin, EM kullanılarak elde edilen hippokampal nöronların görsel DCVs zaman dilimleri boyunca ortaya ve dilim çıkarsanan DCV çap ~ 70-100 nm 11&#39;dir. Bizim PALM veri ve EM veri arasındaki dikkat çekici anlaşma her iki yaklaşım için güven vericidir. PALM hala test ediliyor, ve EM genellikle gerekli sert numune hazırlama konusunda kaygılar tabidir. Benzer şekilde,DCVs hedefleyen yeşil ve kırmızı kuruntulardan coexpressing hipokampal nöronların yaşam kırınım-sınırlı filmler örtüşen, yeşil ve kırmızı puncta kalıcı comovement 25 tabi olduğunu göstermektedir. Bu sonucun en basit yorumu - kırmızı ve yeşil sinyaller aynı DCV kaynaklanan - kırınım-sınırlı puncta ezici bireysel DCVs temsil ettiğini gösterir PALM ile uyumludur. Comovement bir az basit yorumlama - kırmızı ve yeşil sinyaller kümelenmiş DCVs kaynaklanabilecek - büyük ölçüde PALM tarafından geçersiz. Burada açıklanan protokol, diğer olumlu özellikleri vardır. (1) kesecikler photoconvertible veya fotoaktıfleştırılebılır floroforlar ile etiketlenmiş olması gerekir, ve (2) sabit hücreler iyi sulu ortamda monte edilmiştir: Özellikle, numune hazırlama, nispeten basit ve iki önemli istisna ile, geleneksel floresan mikroskopi için bu uygun oldukça benzer. Bu göreceli Simplicity deneyler kısa ve böylece numuneler 26 zor olabilir ki, (sürüklenme düzeltme kolaylaştırmak için) referans boncuklar ile etiketlenmiş olması gerekmez gerçeğini yansıtmaktadır. Buna ek olarak, veziküller genellikle birçok floroforlar ile etiketlenmiş; Bu şekilde, yeterli bir florofor işaretleme yoğunluğu elde basittir. Buna karşılık, diğer yapılar için, bu 3 oldukça zor olabilir. Görüntü edinimi de oldukça basittir. Ancak, PALM PALM sinyaller özünde çok zayıf çünkü pahalı ve ileri elektronik ve optik bileşenleri gerektirir. Muhtemelen en gelişmiş işleme, analiz ve PALM görüntülerin ekranın etrafında PALM merkezi yönleri. Burada vurgulandığı gibi, PALM bu yönlerini uygulanması çözünürlük ve yerelleştirme hassasiyet arasında örnekleme çözünürlük arasındaki ilişki ve ayrım dahil olmak üzere birçok ince konularda bir anlayış gerektirir. Bu nedenle, genel olarak, s PALMtudies her zaman oldukça karmaşık, ama bu önemli olması muhtemeldir çözünürlük iyileştirmesi dengelenir.

Hücresel süreçlerin bir dizi özel subsellüler noktaya biyomoleküllerin doğru ve verimli vezikül aracılı kaçakçılığı bağlıdır. Bir önemli örnek potansiyel distal pre-ve postsinaptik sitelere 1 nöronal soma içinde biyotekvinin sitelerinden sinaptik bileşenlerin uzun menzilli, vezikül aracılı teslimat öncesinde, hangi sinaptik montaj olduğunu. Floresan mikroskopi vezikül kaçakçılığı okuyan güçlü ve popüler bir yöntemdir. Tekniği güçlü, duyarlılık, özgüllük, ve canlı görüntüleme 2 ile uyumluluğu gibi. Ne yazık ki, yakın zamana kadar, teknik ~ 250 nm daha küçük boyutlara sahip yapıların çalışmalarını engellemektedir önemli bir zayıflık, kırınım-sınırlı çözünürlük 2, zarar gördü. Son zamanlarda, floresan mikroskobu lateral çözünürlük süper çözünürlüklü floresan mi getirilmesi ile kırılma engelini aştıBöyle PALM 3 gibi croscopy teknikleri. PALM yanal çözünürlüğü, nanometre on, ideal olarak genelde ~ 50-250 nm 4 arasında değişen boyutlara sahip veziküller, çalışma için uygundur. Bu, belirli bir hücre içi sitelerine ticareti bazı yönlerini de dahil olmak üzere, daha önce veziküllerin erişilemez özellikleri, bir spektrum aydınlatmak için, sayısız güçlü olan, floresan kullanmak artık mümkün olmaktadır. PALM uygulamak için önemsiz değildir ve başarılı stratejiler genellikle çalışmanın altında sisteminin türüne uygun olmalıdır. Burada veziküler yapıların PALM çalışmaları nasıl tanımlamak, ve biz hipokampal nöronlarda DCVs durumunda bizim yaklaşımın etkinliğini göstermek. Özellikle, biz hipokampal nöronlar sinaps hipotezi DCVs bu ticaretiyle mücadele için PALM kullanmak AEOV kümeleri 5-8 aracılık eder. N gelişmekte sinaps veziküllerin Küme aracılı ticaretibu hızlı sinaptik istikrar ve montaj 9,10 kolaylaştırabilir çünkü eurons ilginç bir olasılıktır. DCVs kümelenmiş kaçakçılığı savunucuları kümeleme 6 destekleyen kanıt olarak eksojen AEOV kargo barındıran extrasynaptic floresan punktumlarda büyük görünen boyutunu öngörmektedirler. Ancak, bu puncta kümeleme kaynaklanan olanlardan difraksiyonuyla kaynaklanan ayırt edici boyutu etkilerine uygun değildir kırınım-sınırlı floresan mikroskopi teknikleri kullanılarak oluşturulan görüntülerde. Bu sorunu çözmek için, biz konvansiyonel widefield floresan ve DCVs hedefleyen kuruntulardan ifade hipokampalinden PALM görüntülerini topladı. Bu görüntülerin analiz konvansiyonel görüntülerde varsayılan extrasynaptic AEOV kümelerin&gt; 92% 80 nm PALM görüntüleri (bireysel DCV-ölçekli) 11 puncta olarak çözülmesi olduğunu ortaya çıkardı. Hippoca gelişmekte DCVs uygulanan Bu nedenle, bu veriler, büyük ölçüde kümelenme hipotezi geçersizMPAL nöronlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Zeiss PALM</td>
			<td style="width:169px;">Carl Zeiss, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Elyra PS.1</td>
			<td style="width:572px;">With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:245px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:169px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:169px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sucrose</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">growth glass coverslips 18mm 1.5D</td>
			<td style="width:169px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0059095</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of neuronal dense-core vesicles

<html> Floresan tespiti, modern biyolojik ve tıbbi uygulamalarda kullanılan birçok yaygın olarak kullanılan ve hızla ilerleyen mikroskopi teknikleri için temel sağlar. Floresan güçlü, duyarlılık, özgüllük, ve canlı görüntüleme ile uyumluluk içerir. Ne yazık ki, floresan mikroskopi geleneksel formları ~ 250 nm daha küçük boyutlara sahip yapıların çalışmalarını engellemektedir görüntüleme düzlemde önemli bir zayıflık, kırınım-sınırlı çözünürlük, muzdarip. Son zamanlarda, bu tür sınırlama fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) olarak süper çözünürlüklü floresan mikroskopi teknikleri, tanıtımı ile aşılmıştır. Geleneksel muadillerine aksine, PALM nanometre onlarca yanal çözünürlükte görüntüler üretebilir. Bu hücresel yapı ve organizasyon önce ulaşılmaz özellikleri bir spektrum aydınlatmak için, sayısız güçlü olan, floresan kullanmak artık mümkün olmaktadır. _content &quot;&gt; Maalesef, PALM uygulamak için önemsiz değildir ve başarılı stratejiler genellikle çalışmanın altında sisteminin türüne uygun olmalıdır. Bu yazıda, sabit, kültürlü nöronlar veziküler yapıların tek renk PALM çalışmaları nasıl uygulanacağını göstermektedir. PALM ideal 50-250 nm ~ dan. yaklaşımımızda Temel adımlar şunlardır tipik aralığı boyutları veziküllerden çalışmaya uygun bir ile seyrek örneklenmiş ham görüntüleri toplama, photoconvertible (kırmızı yeşil) vezikül kargo kimeralardır nöronları etiketleme süper çözünürlük mikroskopi sistemi ve yüksek çözünürlüklü PALM görüntü üretmek için ham görüntü işleme. Biz de çürütmek, hangi kültüre hipokampal nöronlar yoğun çekirdekli kesecikler derece iyi çözüme görüntüleri (DCVs) sunarak bizim yaklaşımın etkinliğini göstermek DCVs arasında extrasynaptic kaçakçılığı AEOV kümeleri büyük ölçüde aracılık ettiğini hipotezi.

Şekil 1, görüntüleme ve işlem bir son ürünü göstermektedir. Bu PALM görüntüde, lokalize Flüoroforlann yanal koordinatları sentroidinin görüntü modunu kullanarak gösterilir ve ilişkili DCV süper çözünürlüklü görüntü Gauss görüntüleme modu kullanılarak gösterilir. Şekil 2A benzer geniş açılı ve tPA-Dendra2 vitro ifade eden hipokampal nöron içinde sekiz gün soma ve proksimal süreçlerin PALM görüntüleri gösterir. Görüntülerin önemli özellikleri, geleneksel ve PALM görüntülerde puncta arasında (1) geniş, bire bir haberleşme ve örtüşme arasında, PALM puncta (2) önemli ölçüde daha küçük boyutlu ve (3) ara sıra çözünürlüğü Birden PALM puncta içine tek widefield punktum. Şekil 2B, tPA-Dendra2 eksprese eden bir ikinci hipokampal nöronun bir işlemin bir kısmı boyunca DCVs bir PALM görüntüsünü gösterir. ÖnemliBu görüntünün özellikleri (1) küçük bir çapa ve homojen bir görünüm, puncta bölgesinin yakından kapatılan puncta / putatif DCV kümelerinin (2) kesintili bir gözlem içerir. Şekil 3, iki veya daha fazla DCVs bir küme oluşturan yeterince yakın olmadığını belirleyen basit bir kantitatif bir yöntem özetliyor; Kümelenme yaygın olduğu sistemlerde, dağılım fonksiyonları göre daha gelişmiş yöntemler, miktar 21 için kullanılabilir. Basit bir yöntem DCV ayırma ve DCV genişliğini ölçmek için kullanılabilir (grafiklerde gösterildiği gibi) puncta yoğunlukları, hat profillerinin dayanmaktadır. Ayrılması önemli ölçüde (efsane tartışıldığı gibi) genişliğini aşarsa ayrılık yaklaşık genişlik olarak aynı ise, DCVs temas olabilir, oysa DCVs &quot;temas&quot; yok. Bu kritere dayanarak, Panel A DCVs &quot;değil temas&quot; olarak sınıflandırıldı Panel B&#39;de bu con olarak sınıflandırıldı ise<html> inceliğini. Bu yaklaşımı kullanarak, hipokampal nöronların gelişmekte extrasynaptic DCVs temas ilişkili kümelenme konusunda ~% 8 bir üst sınır koydu. Bizim DCV boyut ve küme verileri Tablo 1&#39;de özetlenmiştir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51394/51394fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51394/51394fig1.jpg" /> Şekil 1. Bir DCV (kırmızı) bir Gauss-render PALM görüntünün Yerleşimi ve DCV içerdiği bireysel photoconverted floroforlar (beyaz noktalar) koordinatlarını gösteren bir sentroid-ekran modu PALM görüntü. Eski modu ile Gauss fonksiyonları render florosforlar görüntüler kendi yerelleştirme kesinleşmemiş tarafından belirlenen genişlikleri ve (x, y) lokalize nokta olarak son görüntüler flüoroforlar / zirveleri koordinatları. Bar = 0.1 um.t = &quot;_blank&quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51394/51394fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51394/51394fig2.jpg" /> Şekil 2,. Yerleşimi toplanır Widefield (yeşil) ve tPA-Dendra2 eksprese eden bir geliştirme hipokampal nöronun soma ve proksimal süreçlerin PALM (kırmızı) görüntülerin (A). Örtüşme bölgeler sarı / turuncu bir görünür. TPA-Dendra2 eksprese eden başka bir hücre içinde bir işlemin bir alt bölgeyi astar DCVs PALM görüntüsü (B). Barlar = 5 ve 2 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51394/51394fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51394/51394fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51394/51394fig3.jpg" /> Şekil 3.. Bindirme (<html> Ilişkili PALM görüntü bu tek punctum&#39;unu giderir ise şöyle özetledi Widefield (yeşil) ve PALM (kırmızı) tPA-Dendra2 ifade gelişmekte hipokampal nöron punktumlarda görüntüleri A ve B). Her iki panelde de, widefield görüntü, tek bir büyük punctum&#39;unu gösterir İki çok dar puncta içine. Grafikler Panel A (sol grafik) ve panel B (sağ grafik) olarak puncta için elde benzer renk kodlu yoğunluk profilleri göstermektedir. , Puncta olduğunu ~ onların tepe-tepe aralığı% 40 yarı maksimal yoğunlukta tam genişliğe sahip bir gösteri panelinde PALM görüntüden elde edilen profiller Bu şekilde, bu iki puncta temas halinde değildir ve farazi bir küme olarak sınıflandırılmış değildi. Bunun aksine, puncta esasen tepe-tepe aralığı ile aynı yarı maksimal yoğunlukta tam bir genişliğe sahip panel B göstermek PALM görüntüden elde edilen profiller; Bu nedenle, bu varsayımsal bir küme olarak sınıflandırıldı. Bar = 0.2 um./ 51394fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <table><tbody><tr><td> Parametre </td><td> Sonuç </td><td> Analiz DCVs sayısı </td></tr><tr><td> Kümelenmiş DCVs Upper-bağlı </td><td> 7.9 ± 5.9% </td><td> 618 </td></tr><tr><td> DCV çapı demek </td><td> 77 ± 21 nm </td><td> 60 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. AEOV boyutu ve küme veri özeti.

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles at JoVE.com

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Biz fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM)-tabanlı sabit, kültürlü nöronlar kesecikler çalışmaları nasıl uygulanacağını açıklar. Bizim protokol anahtar bileşenleri süper çözünürlüklü mikroskopi sistemi ile seyrek örneklenmiş ham görüntüleri toplamak ve bir süper-çözünürlük görüntü üretmek için ham görüntüleri işlerken photoconvertible kimeralar ile etiketleme veziküller içerir.

Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

super-resolution-imaging-of-neuronal-dense-core-vesicles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K Görüntüleme.  Lewis & Clark College.  Biz fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM)-tabanlı sabit, kültürlü nöronlar kesecikler çalışmaları nasıl uygulanacağını açıklar. Bizim protokol anahtar bileşenleri süper çözünürlüklü mikroskopi sistemi ile seyrek örneklenmiş ham görüntüleri toplamak ve bir süper-çözünürlük görüntü üretmek için ham görüntüleri işlerken photoconvertible kimeralar ile etiketleme veziküller içerir. 

Video: Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Nörobilim

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Kronik Transkraniyal elektriksel stimülasyon ve Sıçanlarda Intracortical kayıt

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.

C. elegans'ta Büyük Ekofher Veziküllerde İnvivo Nöronal Agrega ve Organel Ekstrüzyon Puanlama da Kantitatif Yaklaşımlar

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Davranış ve Uyaran Yanıtları Sırasında Yetişkin Drosophila melanogaster'ı Tüm Beyin Görüntülemeye Hazırlama

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

Nöronal Gelişim Sırasında ROS Canlı Hücre Görüntüleme

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...