Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concede 2 R15 GM061539-02 (a BAS), 2 R15 NS40425-03 (para JEL), MH 66179 (com o Dr. Gary Banker da Oregon Health &amp; Science University / OHSU) e P30 NS061800 (o Dr. Sue Aicher de OHSU). Agradecemos Barbara Smoody para amplo suporte com a cultura de neurônios do hipocampo, e as Dras. Brian Long e James Abney para uma leitura crítica do manuscrito.

1. Exemplo de Preparação <ol><li> Preparar ADN que codifica para uma quimera photoconvertible ou fotoactivável alvo para DCV são, utilizando-se técnicas de biologia molecular convencionais. Nota: Uma possibilidade é o ADN que codifica um activador do plasminogénio tissular-Dendra2 quimera (tPA-Dendra2). Dendra2 é uma proteína photoconvertible que muda de verde para vermelho emissão após a exposição à luz ultravioleta 12. </li><li> Neurônios do hipocampo em cultura de alta performance # 1.5 tampa desliza para ~ 5-10 dias, seguindo protocolos padrão 13. </li><li> Transfectar desenvolvimento neurónios do hipocampo utilizando um reagente lipídico catiónico. Nota: A infecção viral mediada é mais eficaz para os neurónios maduros. Esta abordagem alternativa tem sido descrito em detalhe noutro local 14. <ol><li> Preparar um tubo de 1,5 ml contendo aproximadamente 1 ug de ADN e 250 ul de meio mínimo essencial (MEM) e um segundo tubo de 1,5 mL contendo 4 mL de reagente de lípido catiónico e 250 ulde MEM. </li><li> Incubar as soluções durante 5 min. </li><li> Combina-se as duas soluções e incuba-se a mistura resultante durante mais 30 min. </li><li> Durante a incubação, preparar um prato contendo alguns mililitros de meio de cultura aquecido a 37 ° C. </li><li> Gentilmente transferir lamínulas contendo neurônios para o prato contendo meio quente e adicione a mistura de transfecção. </li><li> Incline o prato delicadamente e, em seguida, colocá-lo em uma incubadora a 37 ° C por 90 min. </li><li> Retornar neurônios ao seu &quot;prato casa&quot; e esperar ~ 12-18 horas. </li></ol></li><li> Fixar as células durante 45 minutos em paraformaldeído a 4% / 4% de sacarose em tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) aquecido a 37 ° C. Nota: Em experimentos de palma, que é importante para conseguir uma boa preservação da ultra-estrutura, e os protocolos de fixação formaldeído padrão utilizados para imunofluorescência normalmente não são suficientes 15. Uma razão importante para a preservação estrutural pobres é insuficiente ftempo ixation porque fixação de formaldeído envolve a formação de aduto e reticulação de proteínas, e este último processo é bastante lento 16. A fixação de 45 min ajuda a mitigar este problema, sem perda induzida pela excessiva fixação detectável de fluorescência. </li><li> Cobertura Wash desliza ~ 10x com filtrada PBS. Nota: Isto reduz contaminantes fluorescentes. Amostras de imagem de forma relativamente rápida após a fixação. Nas células de armazenagem intermédia a 4 ° C em PBS, filtrado em um recipiente à prova de luz. </li><li> Lamínulas montagem contendo neurônios em uma câmara em filtrada PBS. Nota: A amostra tem de ser montado em um meio aquoso, tal como PBS, com índice de refracção mais baixo do que a do vidro, para implementar fluorescência total reflexão interna (TIRF) à base de iluminação. Iluminação baseadas em TIRF é muito útil porque apenas cobertura fluoróforos deslizamento proximal está animado, e há uma grande queda associada na fluorescência de fundo 17. </li></ol> 2. Aquisição de Imagem &lt;/ P&gt; <ol><li> Ligue o sistema de imagem super-resolução. <ol><li> Ligue a lâmpada de arco. </li><li> Virar o &quot;sistema / pc&quot; e interruptores &quot;componentes&quot; (no interruptor remoto de energia) para &quot;on&quot;. </li><li> Ligue o computador (após o posto de tablet / encaixe controle microscópio acende). Nota: A estação de base pode ser usado para controlar e monitorar muitos atributos dos óptica e caminho da luz, nomeadamente escolha de objetivo e foco. </li><li> Clique duas vezes no ícone do software e escolha a opção &quot;Sistema start&quot; na caixa de diálogo de login. </li></ol></li><li> Examine a amostra. <ol><li> Abra a parte frontal e painéis de acesso no topo da cabine de segurança laser. </li><li> Incline o braço de luz transmitida para acessar o palco e objetivos. </li><li> Coloque óleo no alfa Plan-Apochromat 100X abertura numérica / NA = 1,46 (TIRF) objetiva. Nota: A maior 63X NA objectivo pode ser utilizado em vez do 100X. </li><li> Monte a amostra no palco, e elevar ªe objetivo em direção à amostra. </li><li> Monitorar a posição da lente usando a função XYZ da estação de ancoragem. Pare quando a lente está no estádio de foco (por exemplo, z ~ 2,50 milímetros). </li><li> Totalmente fechar os painéis de acesso. Nota: Para ativar a segurança do laser. </li><li> Afinar o foco usando as oculares e os botões na guia localizar. Nota: A guia localizar fornece acesso aos botões que produzem iluminação baseados em lâmpada de arco e facilita a observação direta da amostra com as oculares. Da mesma forma, a guia aquisição fornece acesso a ferramentas que produzem iluminação a laser e facilita a captura da imagem pela câmera. <ol><li> Vá até a aba localizar, escolha &quot;Trans On&quot;. </li><li> Clique no símbolo de expansão ocular. Nota: Isso traz um esquema do caminho da luz. Atributos do caminho da luz pode ser alterada clicando esquerda ícones apropriados no esquema ou usando a tela sensível ao toque na docking station. Por exemplo, um filtroapropriada para visualização de emissão de Dendra2 pode ser escolhido usando o ícone refletor revólver. </li><li> Olhe pelas oculares, e trazer as células para o foco usando a estação de ancoragem como um guia. Nota: A amostra será muito pouco povoada com células fluorescentes porque neurônios do hipocampo são difíceis de transfecção, e, portanto, pode ser um pouco complicado de se concentrar com uma iluminação refletida. Se este for o caso, usam iluminação transmitida e a leitura Z da estação de base como um guia. </li><li> Alterne a luz &quot;Off&quot; depois de focar. </li></ol></li></ol></li><li> Identificar uma célula que é bastante brilhante, apresenta ponteada fluorescência, e tem uma morfologia clássico que é indicativo de uma boa saúde. <ol><li> Escolha a luz refletida eo filtro apropriado para a visualização de emissão verde Dendra2. </li><li> Digitalize a lamínula para células expressando quimeras Dendra2 utilizando luz baixa excitação intensidade. </li></ol></li><li> Mude para o ACQguia uisition. <ol><li> Use o &quot;gerente experimento&quot; para carregar uma configuração de aquisição PALM que adequadamente concebido ou modificado facilmente. Nota: Se tais experiências não existir, criar uma configuração experimental começar usando as seguintes configurações como um guia: sliders potência do laser: 405 nm (~ 0,01% para um laser mW 50); 488 nm (~ 3% de um laser de 100 mW); 561 nm (~ 40%, para um laser de 100 mW); Tempo de exposição: ~ 50 ms; Ganho Camera: ~ 200; Aquisição Multidimensional: séries temporais (ciclos = 30.000, interval = 0); Faixas: 488 nm com epi-iluminação, e 561 nm com iluminação baseada em TIRF (veja o passo 2.5.1); Objetivo: 100X (NA = 1,46); Deslizante ângulo TIRF: ângulo de incidência ~ 67-72 °; O tamanho do pixel: 100 nm; Campo de visão: TIRF (as escolhas alternativas produzir intensidades superiores a laser e são utilizados para fluoróforos que são mais difíceis de lixívia). </li><li> Clique em &quot;sim&quot; quando um menu pop-up aparece com uma consulta sobre a mudança em lasers. </li></ol></li><li> Traga a imagemda célula para o foco no plano da câmara. <ol><li> Escolha a 488 nm epi-iluminação pista laser. Nota: As faixas são configurações de feixe utilizados durante o exame. Aqui, os nomes das faixas são determinadas pelo comprimento de onda de excitação que produz a emissão que é passado para a câmara. Por exemplo, a faixa de 561 nm usa tanto o 405 e 561 linhas de laser nm, mas o cubo de filtro passa apenas emissão de photoconverted Dendra2 animado com 561 nm de luz para a câmera. </li><li> Foque a imagem da célula na câmara usando o botão de aquisição &quot;contínuo&quot;. </li></ol></li><li> Coletar uma imagem de campo amplo convencional. <ol><li> Use o botão &quot;Ajustar&quot;. </li><li> Salve a imagem, indo para o menu &quot;Arquivo&quot; e escolha &quot;Salvar / Salvar como.&quot; </li></ol></li><li> Configure a iluminação à base de TIRF. <ol><li> Escolha a faixa de 488 e mudar para &quot;TIRF&quot; utilizando o botão EPI / TIRF. </li><li> Escolha aquisição &quot;contínuo&quot;. </li><li> Ajuste tele TIRF baseada iluminação slider. Nota: TIRF é conseguido quando existe um escurecimento súbita de fundo E a amostra pode ser focada num plano 18. Se novas características tornam-se aparentes através focando-se na amostra, o ângulo de incidência é muito baixa, porque em TIRF existe apenas um plano de foco. </li><li> Duplo verificar o ângulo TIRF usando a faixa 561 com o laser de 405 nm &quot;off&quot;. </li><li> Ligue o laser de 405 nm de volta &quot;on&quot; antes de iniciar um experimento PALM. </li></ol></li><li> Coletar dados de palma. <ol><li> Hit &quot;start experimento.&quot; Nota: Se desejar, abra a aba &quot;opções de processamento on-line&quot; e marque &quot;PALM linha de processamento&quot; e &quot;Fit Gauss2D&quot; (antes do início do experimento) para monitorar a imagem PALM reconstruído durante a coleta de dados brutos. Isto irá facilitar a avaliação da qualidade dos dados e, consequentemente, o valor de continuar o processo de recolha de dados relativamente demorada. </li><li> Visualmentemonitorar fotoconversão. </li><li> Aumente a intensidade do laser de 405 nm (photoconverting) quando diminui fotoconversão Dendra2 (normalmente após a aquisição de ~ 10.000 imagens RAW). </li><li> Continue o experimento se fotoconversão aumenta. Caso contrário, parar o experimento (sem perda de dados) clicando no botão &quot;stop&quot; atual etapa. </li><li> Salve as imagens quando a coleta de dados seja concluída (após ~ 15 min). </li></ol></li></ol> 3. Processamento de Imagem, Exibição e Análise <ol><li> Na ausência de tratamento, processar imagens RAW online que foram salvos em disco. <ol><li> Clique na aba processamento, abra a guia método, e selecione &quot;PALM&quot;. </li><li> Escolha &quot;PALM&quot; novamente a partir dos quatro sub-opções. </li><li> Vá para o menu arquivo, abrir e visualizar o arquivo de interesse, e clique em &quot;selecionar&quot;. </li><li> Hit &quot;aplicar&quot;. Nota: Isto irá iniciar pico / constatação fluoróforo e pico localização com opti padrãoons. Se necessário, os picos também podem ser agrupados usando a guia &quot;PAL-grupo&quot;. Agrupamento atribui picos que aparecem em várias estruturas consecutivas a uma única molécula, se as coordenadas de pico são suficientemente semelhantes. Além disso, os dados podem ser corrigidos para desvio de amostra usando opção de alinhamento deriva baseado no modelo do software. </li></ol></li><li> Filtre componentes mal localizada e mal incluídos na amostra os dados localizados de pico. <ol><li> Descarte fluoróforos com precisões de localização, σ,&gt; 35 nm usando a função &quot;PAL-Filter&quot;. </li><li> Descarte fluoróforos em áreas onde a distância média entre os picos, d, é muito grande para resolver vesículas de diâmetro, D. <ol><li> Extraia a precisão média de localização, σ, a partir do histograma de precisão de localização. </li><li> Calcule o valor máximo aceitável para d baseado em σ, ea Criterion Shannon-Nyquist 19, tal como consagrado na resolução aproximação 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2-D) 2] 1/2. </li><li> Definir o limite do &quot;Remover discrepantes PALM&quot; ferramenta para eliminar picos cercados por menos de πD 2 / (4d 2) vizinhos dentro de um círculo de raio D / 2. </li></ol></li><li> Converta os dados PALM transformado em uma imagem PALM usando a função &quot;PAL-Rendering&quot;; veja a Figura 1. </li><li> Quantificar os tamanhos e separações, escolhendo a função &quot;Perfil&quot;. <ol><li> Verifique a linha de associado e opções de tabela, e desenhar uma linha ao longo da direção desejada na imagem. </li><li> Quantificar diâmetros, determinando medida da largura à meia máxima intensidade. </li><li> Quantificar separações determinando pico-a-pico espaçamentos de perfis de intensidade. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

PALM e técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução relacionados surgiram recentemente como um complemento valioso para as formas mais bem estabelecidos da microscopia óptica e microscopia eletrônica (EM) 22-24. Atributos positivos da PALM incluem a preparação da amostra relativamente simples e mínima perturbação da amostra. Em princípio, PALM também pode ser usado para estudar as células vivas. Provavelmente, o principal atributo negativo da Palm é a aquisição de dados demorada, o que dificulta significativamente estudos de processos dinâmicos mais rápida em células vivas. Além disso, PALM é relativamente novo, e, assim, apropriados, fluoróforos e protocolos para a preparação de amostras e para aquisição e análise de dados robustos não estão totalmente desenvolvidos e / ou documentado 3. Aqui nós descrevemos um protocolo que é adequado para uma única cor, estudos baseados em palma de vesículas em células fixas, de cultura. O protocolo também é um bom ponto de partida para o desenvolvimento da mesma formadirigidos, estudos PALM dual-cores. A eficácia do nosso protocolo é suportado por dois atributos-chave de nossos dados Palm. Em primeiro lugar, a distribuição dos pontos lacrimais na nossa PALM reconstruído, e widefield complementar, imagens é muito semelhante. A única diferença significativa na distribuição - ocasional resolução de puncta de difração limitada em vários puncta por PALM - reflete o realçada resolução de PALM e ainda ressalta a eficácia ea utilidade da técnica. Em segundo lugar, nossos resultados PALM estão em bom acordo, e / ou consistente, com outros resultados relevantes. Por exemplo, imagens de neurónios do hipocampo obtidos utilizando EM ocasionalmente revelar fatias através de DCV são, e o diâmetro DCV deduzido a partir das fatias é de aproximadamente 70-100 nm, 11. O acordo notável entre nossos dados e os dados PALM EM é reconfortante para ambas as abordagens. PALM ainda está sendo testado, e EM geralmente está sujeito a preocupações sobre a preparação necessária amostra dura. Da mesma forma,filmes limitada de difração de viver neurônios do hipocampo co-expressam quimeras verde e vermelho alvo para as DCV são sobrepostos mostram que puncta verde e vermelho sofrer comovimento persistente 25. A interpretação mais simples deste resultado - os sinais vermelho e verde surgem a partir do mesmo DCV - é consistente com a palma da mão, o que demonstra que puncta de difração limitada representam esmagadoramente as DCV são individuais. Uma interpretação menos direta de co-movimento - os sinais vermelho e verde surgem as DCV são agrupados - é em grande parte invalidada por PALM. O protocolo aqui descrito tem outras características positivas. Em particular, a preparação da amostra é relativamente simples e bastante semelhante ao adequado para a microscopia de fluorescência convencional, com duas notáveis ​​exceções: (1) vesículas devem ser marcadas com fluoróforos photoconvertible ou fotoactiváveis, e (2) células fixas são mais bem montados em meio aquoso. Este simplici relativaty reflecte o facto de que as experiências são curtas, e, assim, as amostras não precisa de ser marcada com grânulos fiduciais (para facilitar a correcção de desvio), o que pode ser complicado 26. Além disso, as vesículas são normalmente marcados com diversos fluoróforos; assim, alcançar densidade adequada rotulagem fluoróforo é simples. Em contraste, outras estruturas, o que pode ser bastante difícil 3. A aquisição de imagens também é relativamente simples. No entanto, PALM exige componentes eletrônicos e ópticos, que são caros e de vanguarda, pois os sinais da Palm são intrinsecamente muito fraco. Provavelmente os aspectos mais sofisticados de centro PALM em todo o processamento, análise e visualização de imagens de palma. Conforme destacado aqui, implementar estes aspectos da PALM requer uma compreensão de várias questões sutis, incluindo a relação entre a amostragem ea resolução, ea distinção entre a resolução e precisão de localização. Assim, em geral, PALM sSTUDOS invariavelmente são bastante complicado, mas isso é compensado pelo aprimoramento de resolução que é provável que seja significativo.

Um número de processos celulares dependem de tráfico de vesículas mediada preciso e eficiente de biomoléculas a destinos específicos subcelulares. Um exemplo proeminente é a montagem sináptica, que é precedida de longo alcance, a entrega mediada por vesículas sinápticas de eleitores a partir de sites de biogênese na soma neuronal para pré e pós-sinápticos locais potencialmente distais 1. A microscopia de fluorescência é um método poderoso e popular de estudar tráfico vesícula. Pontos fortes da técnica incluem a sua sensibilidade, especificidade e compatibilidade com imagens ao vivo 2. Infelizmente, até há relativamente pouco tempo, a técnica tem sofrido com uma grande fraqueza, resolução de difração limitada 2, o que dificulta os estudos de estruturas com dimensões menores do que ~ 250 nm. Recentemente, a resolução lateral em microscopia de fluorescência ultrapassou a barreira de difração com a introdução de super-resolução mi de fluorescênciatécnicas croscopy, como PALM 3. A resolução lateral do PALM, dezenas de nanômetros, é ideal para o estudo de vesículas, que têm dimensões que variam tipicamente de ~ 50-250 nm 4. Assim, é agora possível a utilização de fluorescência, com seus pontos fortes inumeráveis, para elucidar um espectro de atributos anteriormente inacessíveis de vesículas, incluindo alguns aspectos de seu tráfico para sites subcelulares específicos. PALM não é trivial de implementar, e estratégias bem sucedidas, muitas vezes deve ser adaptado para o tipo de sistema em estudo. Aqui nós descrevemos como implementar estudos palma da estruturas vesiculares, e demonstrar a eficácia da nossa abordagem para o caso de as DCV são em neurônios do hipocampo. Em particular, podemos usar PALM para tratar a hipótese de que o tráfico de DCV são de sinapses em neurónios do hipocampo é mediada por grupos DCV 5-8. Tráfico mediada pelo Cluster de vesículas de sinapses no desenvolvimento de neurons é uma possibilidade intrigante, pois pode facilitar a rápida estabilização sináptica e montagem 9,10. Os defensores do tráfico em cluster do DCV são citar o grande tamanho aparente de puncta fluorescente extrasynaptic abrigar carga DCV exógena como provas agrupamento 6. No entanto, estes pontos lacrimais aparecem em imagens geradas utilizando técnicas de microscopia de fluorescência limitada de difração, que não são adequados para os efeitos do tamanho de distinção decorrentes da difracção dos que resultem do agrupamento. Para resolver esse problema, foram coletadas fluorescência widefield convencional e imagens palma da neurônios que expressam quimeras direcionados para as DCV são. A análise destas imagens revelaram que&gt; 92% dos clusters DCV extrasynaptic putativos em imagens convencionais são resolvidos como 80 nm (individual porte DCV-) 11 puncta em imagens de palma. Assim, estes dados largamente invalida a hipótese de agrupamento aplicado a DCV são no desenvolvimento hippocaMpal neurônios.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Zeiss PALM</td>
			<td style="width:169px;">Carl Zeiss, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Elyra PS.1</td>
			<td style="width:572px;">With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:245px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:169px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:169px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sucrose</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">growth glass coverslips 18mm 1.5D</td>
			<td style="width:169px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0059095</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of neuronal dense-core vesicles

<html> A detecção de fluorescência fornece a base para muitas técnicas de microscopia amplamente utilizados e rápido avanço empregados em aplicações biológicas e médicas modernas. Forças de fluorescência incluem a sua sensibilidade, especificidade e compatibilidade com imagens ao vivo. Infelizmente, as formas convencionais de microscopia de fluorescência sofrem de uma grande fraqueza, a resolução de difração limitada no plano de imagem, o que dificulta os estudos de estruturas com dimensões menores do que ~ 250 nm. Recentemente, essa limitação foi superada com a introdução de técnicas de microscopia de fluorescência de super-resolução, como a microscopia localização fotoativados (PALM). Ao contrário de suas contrapartes convencionais, PALM pode produzir imagens com uma resolução lateral de dezenas de nanômetros. É, portanto, agora possível a utilização de fluorescência, com os seus pontos fortes inumeráveis, para elucidar um espectro de atributos anteriormente inacessíveis da estrutura celular e organização. _content &quot;&gt; Infelizmente, PALM não é trivial de implementar, e estratégias bem sucedidas, muitas vezes deve ser adaptado para o tipo de sistema em estudo. Neste artigo, vamos mostrar como implementar estudos PALM uma única cor de estruturas vesiculares, em neurônios cultivados fixos. PALM é ideal para o estudo de vesículas, que têm dimensões que variam tipicamente de ~ 50-250 nm. As principais etapas da nossa abordagem incluem a rotulagem de neurônios com photoconvertible (verde para vermelho) quimeras de carga vesícula, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia super-resolução e processamento de imagens RAW para produzir imagem PALM de alta resolução. Nós também demonstrar a eficácia da nossa abordagem, apresentando imagens excepcionalmente bem-resolvidos de vesículas densa-core (DCVS) em neurônios do hipocampo em cultura, que refutam a hipótese de que o tráfico de DCV são extrasynaptic é mediado em grande parte por grupos DCV.

A Figura 1 mostra um produto final de imagem e processamento. Nesta imagem PALM, coordenadas laterais fluorophores localizados são mostrados usando o modo de exibição centróide, ea imagem de super-resolução da DCV associado é mostrado usando o modo de exibição de Gauss. Figura 2A mostra widefield análogo e imagens palma da soma e processos proximais de oito dias em neurônio hipocampo vitro expressando tPA-Dendra2. Características importantes das imagens incluem o (1) extensa, one-to-one correspondência, e se sobrepõem, entre puncta nas imagens convencionais e de palma, (2) tamanho significativamente menor do puncta PALM, e (3) ocasional resolução de um único punctum widefield em vários puncta PALM. A Figura 2B mostra uma imagem PALM de DCV são ao longo de parte de um processo de um segundo neurônio hipocampo expressar tPA-Dendra2. Importantecaracterísticas desta imagem incluem o diâmetro (1) pequeno e aparência homogênea, do puncta, e (2) a observação frequente de puncta / agrupamentos DCV putativos intimamente apostos. A Figura 3 descreve um método quantitativo simples de determinar se duas ou mais as DCV são estão perto o suficiente para compor um cluster; em sistemas em que o agrupamento é predominante, os métodos mais sofisticados, baseados em funções de distribuição, pode ser utilizada para a quantificação 21. O método simples baseia-se na geração de perfis de linha de intensidades puncta (mostradas nos gráficos), que podem ser utilizados para quantificar a separação DCV e largura DCV. Se a separação for superior a largura significativamente (como discutido na legenda), as DCV são não fazer &quot;contato&quot;, enquanto que, se a separação é aproximadamente a mesma largura, as DCV são pode entrar em contato. Com base neste critério, as DCV são em painel A foram classificados como &quot;sem contato&quot;, enquanto aqueles no Painel B foram classificadas como em con<html> tato. Usando essa abordagem, vamos colocar um limite superior de ~ 8% no agrupamento associada ao contato de DCV são extrasynaptic no desenvolvimento de neurônios do hipocampo. Nosso tamanho DCV e dados de fragmentação estão resumidos na Tabela 1. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51394/51394fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51394/51394fig1.jpg" /> Figura 1. Sobreposição de uma imagem PALM Gaussian-renderizados de DCV (vermelho) e uma imagem PALM modo centróide-display mostrando coordenadas de fluoróforos photoconverted individuais (pontos brancos) contidos no DCV. O modo antigo exibe fluorophores prestados às funções de Gauss com larguras determinadas por suas precisões de localização, e este último apresenta fluoróforos / picos como pontos localizados em sua (x, y) as coordenadas. Barra = 0,1 um.t = &quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51394/51394fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51394/51394fig2.jpg" /> Figura 2. Overlay (A) de widefield somados (verde) e Palm (vermelho) imagens da soma e processos proximais de um neurônio do hipocampo em desenvolvimento expressando tPA-Dendra2. Regiões de sobreposição aparecem amarelo / laranja. Imagem PALM (B) de DCV são revestem uma sub-região de um processo de outra célula expressando tPA-Dendra2. Barras = 5 e 2 mM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51394/51394fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51394/51394fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51394/51394fig3.jpg" /> Figura 3. Sobreposições (<html> A e B) de widefield somados (verde) e PALM (vermelho) imagens de puncta em um neurônio do hipocampo em desenvolvimento expressando tPA-Dendra2. Em ambos os painéis, a imagem mostra um campo amplo único grande punctum, ao passo que a imagem associada PALM resolve este único punctum em duas puncta muito mais estreitos. Os gráficos mostram perfis de intensidade de forma análoga codificados por cor obtidos para o ponto lacrimal no painel A (gráfico da esquerda) e no painel B (gráfico da direita). Os perfis obtidos a partir da imagem PALM no painel A mostram que a puncta ter uma largura total a meia intensidade máxima que é de aproximadamente 40% do seu espaçamento pico-a-pico; assim, estes dois pontos lacrimais não estão em contacto e não foram classificados como um grupo putativo. Em contraste, os perfis obtidos a partir da imagem de palma no painel B mostra que o ponto lacrimal têm uma largura total a meia intensidade máxima que é essencialmente o mesmo que o espaçamento de pico-a-pico; assim, estes foram classificados como um grupo putativo. Barra = 0,2 um./ 51394fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <table><tbody><tr><td> Parâmetro </td><td> Resultado </td><td> Número de DCV são analisados </td></tr><tr><td> Limite superior sobre as DCV são agrupados </td><td> 7,9 ± 5,9% </td><td> 618 </td></tr><tr><td> DCV diâmetro médio </td><td> 77 ± 21 nm </td><td> 60 </td></tr></tbody></table> Tamanho da tabela 1. DCV e aglomerado resumo de dados.

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Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Nós descrevemos como implementar microscopia localização fotoativados (PALM) baseada em estudos de vesículas em fixos, neurônios cultivados. Os principais componentes do nosso protocolo incluem rotulagem vesículas com quimeras photoconvertible, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia de super-resolução e processamento das imagens em bruto para produzir uma imagem de super-resolução.

Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

super-resolution-imaging-of-neuronal-dense-core-vesicles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K visualizações.  Lewis & Clark College.  Nós descrevemos como implementar microscopia localização fotoativados (PALM) baseada em estudos de vesículas em fixos, neurônios cultivados. Os principais componentes do nosso protocolo incluem rotulagem vesículas com quimeras photoconvertible, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia de super-resolução e processamento das imagens em bruto para produzir uma imagem de super-resolução. 

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In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neurociência

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In vivo de imagens de Dauer específica Neuronal Remodelação em C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Estimulação elétrica transcraniana crônica e gravação Intracortical em ratos

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.

Abordagens Quantitativas para Pontuação in vivo Neuronal Aggregate e Extrusão organela em Grandes Vesículas Exofer em C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

Imagem de células vivas ROS durante o desenvolvimento neuronal

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...