Bu çalışma, MM için, Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (HL086699 R01, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) tarafından desteklenmiştir. Bizim makale kısmen Carl Zeiss Microimaging LLC tarafından desteklenmektedir.

Reaktif oksijen türleri, canlı hücreleri oksidasyona duyarlı boyalar (1 &amp; 2) kullanarak veya plazmid sensörleri (3 ve 4) konfokal mikroskobi kullanarak ölçülebilir. 1. J774 hücrelerinde sitozolik ROS Görselleştirme <ol><li> 48 saat 35 mm yemekleri (Harvard Apparatus) cam alt J774.1 fare monosit kökenli makrofajlar (10 6 hücre / ml) büyütün </li><li> 6 saat 37 ° ° C.: TLR agonistleri (1 mcg / ml LPS-agonist TLR4; C)-TLR3 agonist 10μg/ml, Poli (2 mcg / ml, Lipo-teikoik asit-TLR2 agonist) ile meydan hücreleri Not: Makrofajlar benzer koşullar altında tedavi, ko-kültür modeli Ca 2 + seferberlik için kullanılmıştır . </li><li> Oksidasyon boya H 2 DCF-DA (Invitrogen) ECM 10 mcM bir final konsantrasyonu (Ekstrasellüler orta vermek için duyarlı: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 10 mM Na-HEPES, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH ekle 2 PO 4, 1.2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10mM glukoz ve% 2.0 dekstran, pH 7.4 Sigma elde edilen)% 2 BSA görselleştirme konfokal mikroskobu altında 20 dakika önce yemekler ve inkübe hücreleri içeren. </li><li> Boya yükledikten sonra, uygun bir görüntüleme sistemi, sıcaklık kontrollü bir sahne üzerine yerleştirilen hücrelerin görselleştirmek. DCF floresan 40x yağ hedefi 13 (Şekil 1A ve D) kullanarak 488 nm eksitasyon Argon iyon lazer kaynağı ile birleştiğinde, Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi kullanıyoruz. </li><li> ImageJ yazılımı (1.44), Ulusal Sağlık Enstitüleri (Rasband, WS, ImageJ Sağlık, Bethesda, Maryland, ABD,, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri serbestçe mevcut yazılım kullanarak görüntüleri analiz <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij /</a> , 1997-2009). </li></ol> 2. J774 hücreleri mROS Görselleştirme <ol><li> 48 saat 35 mm yemekleri (Harvard Apparatus) cam alt J774.1 fare monosit kökenli makrofajlar (10 6 hücre / ml) büyütün </li><li>MROS üretimine neden TLR ligandları ile hücreleri Challenge (2 mcg / ml, Lipo-teikoik asit-TLR2; 10μg/ml, Poli (I: C) TLR3; 1 mcg / ml LPS-TLR4) 6 saat 37 ° C. </li><li> 5 mcM yemekleri ve inkübe hücreleri az 30 dakika süreyle 37 ° C izin ECM% 2 BSA içeren bir nihai konsantrasyonu vermek için mitokondriyal süperoksit göstergesi MitoSOX Kırmızı (Invitrogen) MitoSOX Red yükleniyor. </li><li> Boya yükledikten sonra, hücreleri MitoSOX Red floresan 40x yağlı objektif (Şekil 1B ve E) kullanarak 561 nm uyarma Argon iyon lazer kaynağı ile Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi çift bir sıcaklık kontrollü sahne gözünüzde canlandırın. </li><li> Kontrol deneyleri için, boya yükleme eklemek PBS veya DMSO (negatif kontrol) veya 2μM Antimycin sonra A (mitokondrial süperoksit olarak jeneratör pozitif kontrol) hücrelere örnek görüntü 2.4 (Şekil 1C) açıklandığı gibi önce. </li><li> ImageJ yazılımı (1.44) kullanarak görüntüleri analiz edin. </li></ol> 3. Visualizatiistikrarlı Hyper-sito MPMVECs sitozolik ROS <ol><li> Biz pHyPer-sito (Evrogen) bir memeli ifade vektör kodlama sitoplazma ve H 2 O 2 14 özel duyular submicromolar konsantrasyon lokalize bir floresan sensörü Hyper kullanın. </li><li> PHyPer-sito elektroporasyon veya transfeksiyon reaktifler kullanarak vektör ile Transfect murin Pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri (MPMVECs). Biz BioRad Gene üreteci Elektroporatör sistemi 250V) (500 μF kullanarak elektroporasyon ile pHyPer-sito 10μg ile 10 x 10 6 hücre ve transfect kullanın. DMEM orta Kültür MPMVECs% 10 FBS, aminoasitlerin, endotelyal büyüme ek ve antibiyotikler ile desteklenmiş. Not: Aşağıda transfeksiyon, koloni gelişimini kolaylaştırmak için düşük yoğunluklu plaka hücreleri. </li><li> 500 mg / ml G418, 48 saat sonra transfeksiyon ile desteklenmiş tam bir kültür ortamı ile birlikte, orta değiştirin. H en yüksek yüzdeye sahip klonlar için Ekran<html> yPer pozitif hücreler ve Hyper pozitif hücreler (Şekil 2) sayısını artırmak geçiş Hyper olumlu klonlar. Not: Biz, son derece Hyper ifade stabil hücreleri için tek hücre ve ekran klonal seçimi için hücreler seri seyreltme kullanın. </li><li> % 0.2 jelatin kaplı lamelleri (80% izdiham) istikrarlı Hyper-sito MPMVECs büyütün. 6 saat 37 ° ° C: TLR ligandları (1 mcg / ml LPS-TLR4; C)-TLR3 10μg/ml, Poli (2 mcg / ml, Lipoteichoic asit-TLR2) Sonraki gün meydan hücreleri Tedavi edilmeyen hücrelerin kontrol olarak hizmet vermektedir. </li><li> Tedaviden sonra, lamelleri Attofluor hücre odası (Invitrogen) üzerine monte edin. Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) odaya ısındı ön 1ml ekle ve Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi, sıcaklık kontrollü bir sahnede odasına yerleştirin. Görselleştirin ve 40x yağlı objektif (Şekil 3A ve D) kullanılarak 488 nm eksitasyon görüntü floresan değişimi. </li><li> ImageJ yazılımı (1.44) (bkz. Bölüm 6) kullanarak görüntüleri analiz edin. </li></ol>istikrarlı Hyper-dMito MPMVECs mitokondriyal ROS itle &quot;&gt; 4 Görselleştirme <ol><li> Biz pHyPer dMito (Evrogen) H 2 O 2, özellikle mitokondri ve duyuları submicromolar konsantrasyon lokalize bir memeli ifade vektör kodlama mitokondri hedefli Hyper kullanın. </li><li> Transfect pHyPer-dMito MPMVECs ve istikrarlı Hyper-dMito MPMVECs bölümünde 3,2-3,3 açıklanan adımları izleyerek oluşturur. </li><li> % 0.2 jelatin kaplı lamelleri (80% izdiham) istikrarlı Hyper-dMito MPMVECs büyütün. </li><li> 6 saat 37 ° ° C: TLR ligandları (1 mcg / ml LPS-TLR4; C)-TLR3 10μg/ml, Poli (2 mcg / ml, Lipoteichoic asit-TLR2) Sonraki gün meydan hücreleri Tedavi edilmeyen hücreler negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. 2μM Antimycin A (mitokondrial süperoksit indükleyicisi pozitif kontrol) görselleştirmek için önce örnek ekleyin. </li><li> Tedaviden sonra, lamelleri Attofluor hücre odası (Invitrogen) üzerine monte edin. Odasına önceden ısıtılmış Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) 1ml ekleve Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi, sıcaklık kontrollü bir sahnede odasına koyun. Görselleştirin ve 40x yağlı objektif (Şekil 3B, C ve E) kullanarak 488 nm eksitasyon görüntü floresan değişimi. </li><li> ImageJ yazılımı (1.44) (bkz. Bölüm 6) kullanarak görüntüleri analiz edin. </li></ol> 5. Co-kültür modeli + Ca 2 tetiklenen parakrin türetilen ROS görünüm için endotel hücreleri sinyal Görselleştirme ve ölçümü için [Ca 2 +] i Ca 2 + hassas floresan boya fluo 04:00 (Invitrogen). <ol><li> % 0.2 jelatin kaplı 25mm cam lamelleri (80% izdiham) MPMVECs büyütün. </li><li> PM fluo-4 yükleme izin ECM 5 mcM fluo 04:00 (Invitrogen) son konsantrasyon ile,% 2 BSA ve% 0.003 pluronic asit içeren 30 dakika oda sıcaklığında lamelleri yetiştirilen hücreler inkübe edin. Yükledikten sonra, (ECM 0 içeren hücreler deneysel görüntüleme çözümü ile yıkayın.Sülfinpirazon içeren boya kaybı en aza indirmek için% 25 BSA). </li><li> Fluo-4, montaj lamelleri Attofluor hücre odası (Invitrogen) üzerine yerleştirdikten sonra. Odaya deneysel görüntüleme çözümü ısındı öncesi 800μl ekleyin ve Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi, sıcaklık kontrollü bir sahne üzerine yerleştirin. </li><li> % 2 BSA içeren ECM hücre tracker kırmızı CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) ile (6 saat LPS ile tedavi) farelerde - ayrı bir tüp etiket nonactivated veya aktive makrofajlar yabani tip ya da gp91 phox / veya izole ve% 0.003 pluronic asit. Deneysel görüntüleme çözümü 200μl hücreleri yıkayın ve tekrar süspansiyon. </li><li> Oda montaj fluo-4 yüklü PM MPMVECs etiketli makrofajlar ekleyin. </li><li> Fluo-04:00 ve hücre tracker kırmızı floresan respectivel için 488 ve 561 nm dalga boyunda eksitasyon ile Argon iyon lazer kaynağı ile Carl Zeiss LSM510 Meta konfokal görüntüleme sistemi kullanılarak 10-20 dakika süreyle yeşil ve kırmızı floresan her 3s kaydediny (Şekil 4 AC). Not: Alternatif olarak, J774.1 hücre hattı MPMVECs Ca 2 + seferberlik ortaya çıkarmak için kullanılan olabilir. </li><li> Analiz fluo-4 ImageJ yazılımı (1.44) (bkz. Bölüm 6) kullanılarak floresans yoğunluğunu değiştirir. </li></ol> 6. Veri analizi ImageJ yazılımını kullanarak Konfokal sistem veri analizi. Lsm dosya biçimi olarak elde edilen görüntü aktarma. ZEN 2009 ve ZEN 2010 yazılımı LSM 510 Meta konfokal mikroskop veya LSM ile sağlanan 710 multiphoton konfokal mikroskop sırasıyla. Lsm formatındaki dosyaları kaydeder. Bu yerli kullanmanızı öneririz. Lsm dosyaları görüntü analizi için orijinal kalitesi korunur. Bu dosya biçimi, doğrudan aşağıdaki adımları bir örnek tek bir görüntü kantitatif analiz, görüntü analiz programı Resim J. açılabilir. Hiçbir ek eklentileri bu veri analizi için gereklidir. <ol><li> Dosya&gt; Aç kullanarak J programında açın. Lsm veya TIFF dosyası </li><li> Sekmesini tıklayın IMAGE&gt; COLOR&gt; SPLIT KANALLAR ve yeşil ve DIC kanallar ayrıldı. Sonraki analiz için yeşil kanal görüntüyü kullanın. </li><li> Çift tıklayın ve &#39;Eliptik fırça seçimi &quot;sekmesini seçin ve 20 piksel değeri ayarlayın. </li><li> Hyper-sito görüntüler için, dairesel ölçüm alanını tanımlamak için tek bir hücre tıklatın. Daha sonra seçilen alanın yoğunluğunu ölçmek için &quot;M&quot; tuşuna basın. Değerleri, yeni bir sonuç penceresinde korunur. </li><li> Sonraki &quot;M&quot; tuşuna basarak ve ardından başka bir alan, farklı bir hücre seçmek için &quot;Shift&quot; tuşuna tıklayın tutarak. Şiddeti sonucu penceresinde kaydedilir. 50 farklı hücreler 4-5 adımları tekrarlayın. </li><li> Hiper d-mito görüntüler için, Oval fırça seçimi 10 piksel değeri ayarlayın. Ilgi Bölgesi (ROI), özellikle hücrelerin mitokondri de dahil olmak üzere elle izlenebilir. </li><li> &quot;M&quot; tuşuna basın, daha sonra mitokondri ve çevresinde freehand kullanarak, bölgede iz. 50 farklı hücreler 6-7 adımları tekrarlayın. </li><li> Bana kopyalayın<html> sonuç penceresinde bir Excel sayfasına veya arsa için herhangi bir yazılım ve yapıştırma bir değer. Biz, grafik gibi verileri çizmek için SigmaPlot veya GraphPad Prism kullanır. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 TLR ligandları ile mücadele üzerine sitozolik ve mitokondriyal ROS üretimi gösterir. Temsilci konfokal görüntüleri DCF (sitozolik) ve MitoSOX Kırmızı (mitokondri) floresan stimülasyon 6 saat sonra artış göstermektedir. Floresan değişiklikler kat değiştirmek gibi normalleştirilmiş ifade edildi. Şekil 2, istikrarlı Hyper-sito ve Hyper-dMito endotel hücreleri üretimi gösterir. Fare endotel hücreleri pHyPer-sito veya elektroporasyon yoluyla pHyPer dMito plazmid yapıları ile transfekte. Hücreler stabil bir şekilde ifade plazmid, iki hafta boyunca G418 ile seçildi. Seçimden sonra, seyreltilmiş hücreler 96 kuyucuğu ekilirler. Bireysel kolonileri izole edilmiş ve homojen bir ifade için görüntülü edildi. e_content &quot;&gt; Şekil 3 endotel sitozolik ve mitokondriyal H 2 O 2 seviyeleri ölçümü gösterir. Temsilcisi konfokal görüntüler Hyper-sito (sitozolik) ve Hyper-dMito (mitokondri) stimülasyon 6 saat sonra floresan artış olduğunu göstermektedir. Floresans şiddeti normalize edildi ve kat değişikliği olarak ifade edilmiştir. Şekil 4 türevi makrofaj-ROS bağlı endotel sitozolik Ca 2 + seferberlik değerlendirme gösterir. LPS-uyarılmış makrofajların, hücre içi Ca 2 ile önceden yüklenmiş olan pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri (PMVEC) üzerine eklenmiştir + ([Ca 2 +] i) göstergesi boya Fluo-4 . Vahşi tip LPS ile aktive makrofajlar Uygulama [Ca 2 +] uyarılmış i fonksiyonel NADPH oksidaz nakavt ile zayıflatılmış oldu PMVECs artış (gp91 phox / -). <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Visualizatimakrofaj hücresel ROS ve mitokondriyal süperoksit oluşturulur. J774.1 hücreleri TLR2, 3 ve 4 ligandları ile meydan okudu (2 mcg / ml, Lipoteichoic asit-TLR2; 10μg/ml, Poli (I: C) TLR3 1 mcg / ml LPS-TLR4) az 6 saat süreyle 37 ° C Tedavi hücreleri ile yüklü sonra (A) hücresel ROS göstergesi (H 2 DCF-DA, yeşil floresan) veya (B) mitokondriyal süperoksit göstergesi (MitoSOX Kırmızı, kırmızı floresan). (C) Antimycin A, mitokondriyal ROS üretimi için bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Floresan değişiklikleri konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. (D) ve (E) ortalama floresan değişimi kantitasyonu. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Endotel hücre sitozolik ve mitokondriyal ROS göstergeleri istikrarlı ifade üretme şematik. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Vendotel sitozolik ve mitokondriyal H 2 O 2 seviyeleri isualization stably (A) Hyper-sito ifade MPMVECs veya (B) Hyper-dMito TLR2, 3 ve 4 ligandlar (2 mcg / ml, Lipoteichoic asit-TLR2 meydan; 10μg / ml, Poli (I: C) TLR3; 37, 6 saat 1 mcg / ml LPS-TLR4) ° C (C) Antimycin A, mitokondriyal ROS üretimi için bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Tedaviden sonra, floresan değişiklikleri konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. (D) ve (E) ortalama floresan değişimi kantitasyonu. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. ROS bozulmuş endotel hücre Ca 2 + seferberlik temin Makrofaj türetilmiştir. (A), endotel hücreleri / makrofaj ko-kültür modeli çalışma şematik gösterimi. WT ve gp91phox boş fareler (Jackson Laboratory) hem de (B) Taze izole fare makrofajlar, 6 saat boyunca 1 mg / ml LPS ile aktive Macrophages hücre tracker Red (kırmızı) ile etiketli ve parakrin O 2 • değerlendirmek için Fluo-4 yüklü PMVECs (yeşil) üzerine eklenen - sinyalizasyon (C) WT farelerin izole LPS ile aktive makrofajlar büyük ve hızlı Ca 2 + seferberlik tetikleyen PMVECs içinde makrofajlar gp91phox boş farelere kıyasla. Makrofaj aktivasyon Doğrulama daha önce kanıtlanmıştır.

<ol>
	<li>Madesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+role+for+superoxide+in+InsP3+receptor-mediated+mitochondrial+dysfunction+and+endothelial+apoptosis.">Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).</li><li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function.">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).</li><li>Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+regulate+cellular+signaling+and+dictate+biological+outcomes.">Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes.</a> Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 .</li><li>Hawkins, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+activates+STIM1+and+alters+mitochondrial+homeostasis.">S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis.</a> J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).</li><li>Madesh, M., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC-dependent+permeabilization+of+the+outer+mitochondrial+membrane+by+superoxide+induces+rapid+and+massive+cytochrome+c+release.">VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release.</a> J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).</li><li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidants+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing.">Oxidants oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li><li>Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmful+molecular+mechanisms+in+sepsis.">Harmful molecular mechanisms in sepsis.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).</li><li>Sanlioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+induces+Rac1-dependent+reactive+oxygen+species+formation+and+coordinates+tumor+necrosis+factor-alpha+secretion+through+IKK+regulation+of+NF-kappa.">Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa.</a> 276, 30188-30198 (2001).</li><li>Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flux+in+endothelial+cells+via+the+chloride+channel-3+mediates+intracellular+signaling.">Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).</li><li>Vliet, A. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+in+lung+biology+and+pathology:+host+defense+enzymes+and+more.">NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more.</a> Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).</li><li>Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+defense+mechanisms.+The+production+by+leukocytes+of+superoxide,+a+potential+bactericidal+agent.">Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent.</a> J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).</li><li>Lambeth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX+enzymes+and+the+biology+of+reactive+oxygen.">NOX enzymes and the biology of reactive oxygen.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).</li><li>Mukhopadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).</li><li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish.">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459, 996-999 (2009).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+innate+immunity.">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada anlatılan yöntem hücreli canlılar ya oksidasyona hassas boyalar veya plazmid sensörleri kullanarak reaktif oksijen türlerinin hızlı ve kantitatif ölçüm sağlar. TLR agonistleri (Toll-benzeri reseptörler), hücre yüzeyinde bulunan TLR aracılığıyla hücrelerini uyarmak ve downstream sinyal yollar 15 tetikleyebilir bileşiklerdir . Protokolde, biz üç farklı TLR agonistleri yani, Lipo-teikoik asit-TLR2 agonist; Poli (I: C). TLR3 agonist; ROS ölçüm göstermek için bir model sistem olarak ROS neden LPS-TLR4 agonist . ROS ölçümü oksidanlar duyarlı boya kullanarak hızlı ve ROS türlerin çeşitliliği ölçmek için kullanılabilir. Plazmid tabanlı sensör Hyper H 2 O 2 seviyeleri seçerek algılar. H 2 O 2, daha istikrarlı oksidan ve aynı zamanda, istikrarlı bir hücre ortamda Hyper sito ve Hyper-dMito ROS hassas floresan boyalar fotoğraf özyükseltgenme avantajlıyız ekler.Hyper artefakt ROS üretimi neden olmaz ve çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullar altında farklı hücre bölümlerinde H 2 O 2 konsantrasyonunun hızlı değişikliklerin tespiti için kullanılabilir. Stably Hyper sensörleri ifade Hücreler H 2 O 2 düzeylerinin daha güvenilir ve doğru bir ölçüm sunan nüfusun klonal seçimi için kullanılır . Daha da önemlisi, bu yöntem aynı zamanda algılama ve kantitatif ölçüm Ca 2 + canlı hücreler gibi doğuştan gelen bağışıklık hücreleri gibi komşu hücrelerin parakrin elde edilen ROS tarafından tetiklenen seferberlik açıklar . Konfokal mikroskobu ile birlikte bu deneysel prosedür, özellikle iki farklı hücre tipleri söz konusu durumlarda hücre sinyal iletimi olayları uzay-zamansal önemli değişiklikleri ortaya çıkarmak için çok yararlı olabilir. Rağmen, bu yazıda ayrıntılı temsilcisi deneyler çalışılan etkileşimin türü sadece bir örnektir, bu tekniği kolayca olabilirbirden fazla canlı hücre türleri arasındaki hücresel etkileşimleri çalışmak için dapted.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Attofluor hücre bölmesi </td><td> Invitrogen </td><td> A7816 </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A8674 </td></tr><tr><td> DMEM düşük glukoz orta </td><td> Invitrogen </td><td> 10567-014 </td></tr><tr><td> Endotelyal büyüme faktörü takviyesi (EKG) </td><td> Taşradaki </td><td> 02-102 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 12662011 </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Invitrogen </td><td> 10131-027 </td></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1393 </td></tr><tr><td> H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> D-399 </td></tr><tr><td> LPS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L4516 </td></tr><tr><td> LTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2515 </td></tr><tr><td> MitoSOX Kırmızı </td><td> Invitrogen </td><td> M36008 </td></tr><tr><td> Opti-MEM İndirgenmiş Serum Orta </td><td> Invitrogen </td><td> 51985091 </td></tr><tr><td> Pen / Strep (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140163 </td></tr><tr><td> pHyPer-sito </td><td> Evrogen </td><td> FP941 </td></tr><tr><td> pHyPer-dMito </td><td> Evrogen </td><td> FP942 </td></tr><tr><td> Poli (I: C) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P0913 </td></tr><tr><td> Prism yazılımının 5.0 </td><td> GraphPad Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> SigmaPlot 11.0 </td><td> Systat yazılımı, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400054 </td></tr><tr><td> T-25 şişeler </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> T-75 şişeler </td><td> BD Falcon </td><td> 353136 </td></tr><tr><td> T 96-iyiC mikro iyi plaka </td><td> BD Falcon </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> Zen 2009 yazılımı </td><td> Carl Zeiss 510 Meta konfokal mikroskopi </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of vascular ca2+ signaling triggered by paracrine derived ros

Oksidatif stres, iskemi / reperfüzyon hasarı ve sepsis de dahil olmak üzere bir dizi patolojik durumların oluşmasında rol oynar. H 2 O 2 ve hidroksil radikalleri oksidatif stres kavramı O 2 • ROS (reaktif oksijen türleri), anormal oluşumunu ifade eder . Reaktif oksijen türleri, sinyal iletimi, hücre proliferasyonu ve hücre ölümü 1-6 da dahil olmak üzere çok sayıda hücresel süreçleri etkiler. ROS doğrudan damar ve organ hücreleri hasar potansiyeline sahiptir ve sonuçta ilk ROS aracılı doku hasarının bir amplifikasyon sonucu ikincil kimyasal reaksiyonlar ve genetik değişiklikler başlatabilir. Geri dönüşümsüz doku hasarı exacerbates amplifikasyon kaskadın temel bileşeni dolaşımdaki inflamatuar hücreler işe alma ve aktivasyon. Inflamasyon sırasında, inflamatuar hücreler, tümör nekroz faktörü-α (TNF) ve IL-1 gibi sitokinler üretirendotel hücreleri (EC) ve epitel hücreleri aktif hale getirmek ve daha fazla inflamatuvar yanıt 7 arttırır. Vasküler endotel disfonksiyonu, akut inflamasyon kurulmuş bir özelliktir. Makrofajlar belirsizdir mekanizmaları tarafından inflamasyon sırasında endotel işlev bozukluğuna katkıda bulunur. • - komşu hücreler patolojik sinyalizasyon 8 tetikler ve çeşitli pro-inflamatuvar sitokinler, O 2 ekstraselüler sürümde makrofaj aktivasyonu sonuçları. NADPH oksidaz hücre tiplerinin çoğu ROS en önemli ve birincil kaynak. Son zamanlarda, biz ve diğerleri 9,10 tarafından NADPH oksidaz tarafından üretilen ROS mitokondriyal ROS üretimi sırasında birçok fizyopatolojik koşullardaki neden olduğu gösterilmiştir . Bu nedenle mitokondriyal ROS üretimi sitozolik ROS ölçmek için ek olarak ölçüm eşit derecede önemlidir. Makrofajlar inflamasyon birincil rol oynar flavoprotein NADPH oksidaz enzimi tarafından ROS üretir. Bir kez aktivefagositik NADPH oksidaz bol miktarda O 2 • üretir ana savunma mekanizması 11,12 önemlidir. Parakrin-kökenli O 2 • rağmen - damar hastalıkları, Ca 2 de dahil olmak üzere parakrin ROS-kaynaklı hücre içi sinyal görselleştirme patogenezinde önemli bir rol oynar + seferberlik hala hipotezdir. - Biz, komşu endotel hücreleri için bir sinyal uyum sağlamak aktive makrofajlar, O 2 kaynağı • olarak kullanıldığı bir model geliştirdik. Komşu endotel hücreleri sinyal kalsiyum neden bu modeli kullanarak, makrofaj kaynaklı O 2 • göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS at JoVE.com

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Endotel Ca2 + sinyalizasyon parakrin türetilen ROS indüksiyon görüntülenmesi anlayışlar kazanmak için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, bir ko-kültür modeli vasküler endotelyal hücreler Ca2 + seferberlik tetikleyen parakrin elde edilen ROS ölçme yararlanır.

Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

visualization-vascular-ca2-signaling-triggered-paracrine-derived

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

15.4K Görüntüleme.  Temple University. Endotel Ca2 + sinyalizasyon parakrin türetilen ROS indüksiyon görüntülenmesi anlayışlar kazanmak için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, bir ko-kültür modeli vasküler endotelyal hücreler Ca2 + seferberlik tetikleyen parakrin elde edilen ROS ölçme yararlanır.

Video: Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Görüntüleme Ca Teknikleri 2 + İnsan Sperm sinyal

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Biyoloji

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup&gt; 2 +</supGörüntü Dizilerinde&gt; Sinyaller

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial malfunction in the diseased heart remains to be fully clarified. Recent compelling evidence demonstrates that changes in the myofilament Ca2+ sensitivity affect intracellular Ca2+ homeostasis and ion channel activities in cardiac myocytes, the essential mechanisms responsible for the cardiac action potential and contraction in healthy and diseased hearts. Indeed, activities of ion channels and transporters underlying cardiac action potentials (e.g., Na+, Ca2+ and K+ channels and the Na+-Ca2+ exchanger) and intracellular Ca2+ handling proteins (e.g., ryanodine receptors and Ca2+-ATPase in sarcoplasmic reticulum (SERCA2a) or phospholamban and its phosphorylation) are conventionally measured to evaluate the fundamental mechanisms of cardiac excitation-contraction (E-C) coupling. Both electrical activities in the membrane and intracellular Ca2+ changes are the trigger signals of E-C coupling, whereas myofilament is the functional unit of contraction and relaxation, and myofilament Ca2+ sensitivity is imperative in the implementation of myofibril performance. Nevertheless, few studies incorporate myofilament Ca2+ sensitivity into the functional analysis of the myocardium unless it is the focus of the study. Here, we describe a protocol that measures sarcomere shortening/re-lengthening and the intracellular Ca2+ level using Fura-2 AM (ratiometric detection) and evaluate the changes of myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from rat hearts. The main aim is to emphasize that myofilament Ca2+ sensitivity should be taken into consideration in E-C coupling for mechanistic analysis. Comprehensive investigation of ion channels, ion transporters, intracellular Ca2+ handling, and myofilament Ca2+ sensitivity that underlie myocyte contractility in healthy and diseased hearts will provide valuable information for designing more effective strategies of translational and therapeutic value.

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Myofilament Ca Değerlendirilmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Duyarlılık temelinde Kardiyak Uyarma-kasılma Kaplin

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

Vasküler Görselleştirme İçin Bir Yöntem Olarak DiI Perfüzyonu<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Paracrine or juxtacrine signaling mediates such interactions. The use of a conditioned medium and coculture studies are the most common methods to discriminate between these two types of interactions. However, the effect of localized high concentrations of secreted factors in the microenvironment during the paracrine interactions is not accurately recapitulated by conditioned medium and, thus, may lead to imprecise conclusions. To overcome this problem, we have devised a proximal culture method to study paracrine signaling. The two cell types are grown on either surface of a 10 &#181;m-thick polycarbonate membrane with 0.4 &#181;m pores. The pores allow the exchange of secreted factors and, at the same time, inhibit juxtacrine signaling. The cells can be collected and lysed at the endpoint to determine the effects of the paracrine signaling. In addition to allowing for localized concentration gradients of secreted factors, this method is amenable to experiments involving prolonged periods of culture, as well as the use of inhibitors. While we use this method to study the interactions between ovarian cancer cells and the mesothelial cells they encounter at the site of metastasis, it can be adapted to any two adherent cell types for researchers to study paracrine signaling in various fields, including tumor microenvironment, immunology, and development.

Paracrine and juxtacrine cellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Here, a proximal culture method is used to study paracrine signaling where the localized concentrations of the secreted factors are maintained while preventing direct cellular contact.

Parakrin hücreler arasında sinyal çalışmaya proksimal kültür yöntemi

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells downstream of pattern recognition receptors. Best studied are the Dectin-1 and Dectin-2 members of the C-type lectin-like receptor family that induce a SYK- and CARD9-dependent signaling cascade leading to NF-&#954;B activation, in a MALT1-dependent manner. By contrast, Toll-like receptors (TLR), such as TLR-4, propagate NF-&#954;B activation but signal via an MYD88/IRAK-dependent cascade. Nonetheless, whether MALT1 might contribute to TLR-4 signaling has remained unclear. Recent evidence with MLT-827, a potent and selective inhibitor of MALT1 paracaspase activity, indicates that TNF- production downstream of TLR-4 in human myeloid cells is independent of MALT1, as opposed to TNF- production downstream of Dectin-1, which is MALT1 dependent. Here, we addressed the selective involvement of MALT1 in pattern recognition sensing further, using a variety of human and mouse cellular preparations, and stimulation of Dectin-1, MINCLE or TLR-4 pathways. We also provided additional insights by exploring cytokines beyond TNF-, and by comparing MLT-827 to a SYK inhibitor (Cpd11) and to an IKK inhibitor (AFN700). Collectively, the data provided further evidence for the MALT1-dependency of C-type lectin-like receptor &#8212;signaling by contrast to TLR-signaling.

MALT1 regulates innate immunity but how this occurs remains ill-defined. We used the selective MALT1 paracaspase inhibitor MLT-827 to unravel the contribution of MALT1 to innate signaling downstream of Toll-like or C-type lectin-like receptors, demonstrating that MALT1 regulates the production of myeloid cytokines, and downstream of C-type lectin-like receptors, selectively.

Myeloid doğuştan gelen sinyal yolu düzenleme MALT1 Paracaspase etkinlik tarafından

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...