Name: assessment of myofilament ca2+ sensitivity underlying cardiac excitation-contraction coupling
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling at JoVE.com

Bu araştırma Eğitim, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (2013068067) tarafından finanse Kore Ulusal Araştırma Vakfı (ÇKS) ile Temel Bilimler Araştırma Programı tarafından desteklenen; Eğitim, Bilim ve Teknoloji, Seul Ulusal Üniversitesi Hastanesi, Hipertansiyon Kore Derneği&#39;nin (2013), SK Telecom Araştırma Fonu Kore Bakanlığı Beyin Kore 21 Yüksek Lisans Programı tarafından (no. 3420130290) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC 31460265; NSFC 81260035).

protokol Sağlık BM Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uygundur (NIH Yayın No. 85-23, 1996 revize). Bu Seul Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (IACUC onayı No .: SNU-101213-1) tarafından onaylanmıştır. 1. Tampon Hazırlama (Tablo Malzemeleri ve Ekipmanları) <ol><li> MM (deney gününde taze yalıtım çözeltisi 300 ml hazırlayın: NaCl, 135; KCI, 5.4; MgCl2, 3.5; glukoz, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0.4, taurin, 20; pH 7.4 NaOH ile birlikte). </li><li> MM (deney gününde taze bir depolama solüsyonu 100 ml hazırlayın: NaCI 120; KCI 5,4; MgSO 4 5&#39;tir; CaCl2 0.2; sodyum piruvat 5&#39;tir; 5.5 glikoz, taurin 20, HEPES 10, manitol 29, pH 7.4 ) NaOH ile. </li><li> MM perfüzyon çözeltisi 1L (hazırlayın: NaCl, 141.4; KCI, 4; NaH 2 PO 4, 0.33; MGCL2, 1 &#39;dir; HEPES, 10; glukoz, 5.5; CaCl2, 1.8; manitol, 14.5; NaOH ile pH 7.4). </li><li> Izolasyon 25 ml kollajenaz (1 mg / ml), proteaz (0.1 mg / ml), sığır serum albümini (BSA, 1.67mg / ml) ve Ca 2 + (0.05 mM) ilave edilerek kolajenaz çözeltisi 30 ml 1 Hazırlama çözüm. </li><li> Yalıtım çözeltisi 16.7 ml (1 mg / ml), BSA (1.67 mg / ml) ve Ca + 2 (0.05 mM) kolajenaz ekleyerek kolajenaz çözeltisi 2 20 ml hazırlayın. </li><li> yalıtım çözeltisi 40 ml BSA 0.4 g eklenerek BSA çözeltisi 40 ml hazırlayın. 10 ml ve iki bardak içine 30 ml ayrı. : Ca BSA çözeltisi 2 + 30 ml ilave edilir, böylece BSA çözeltisi nihai Ca2 + konsantrasyon 1 mM&#39;dir. </li></ol> Sol Ventriküler (LV) miyositler İzolasyonunda 2. Hazırlık <ol><li> hazırlanması ve izolasyon odasına hayvan tesis temiz ulaşım kafeslerde 8-12 haftalık, erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanları aktarın. </li><li> H37 o C iki su banyoları yemek Not: Su için bir su banyosu kullanın - ceketli rezervuar ve Langendorff perfüzyon sistemi perfüzyon tüpleri. Tek miyositleri ayırmak amacıyla miyokard doku gövdelerine kışkırtmak diğer su banyosu kullanın. </li><li> Sırasıyla, 30 ml ve 20 ml hacim yapmak için 5 ml ve kolajenaz çözeltisi 1 ve 16.7 ml kolagenaz çözeltisi 2 25 ml (yaklaşık olmayan 2+) BSA çözeltisi 3.3 ml. </li><li> Langendorff perfüzyon sistemine sırasıyla (Şekil 1A) izolasyon çözeltisi (100 mi) ve sütun 1 (Col 1) ile sütun 2 kolajenaz çözeltisi 1 (30 mi) (Col 2) ekleyin. </li><li> Langendorff perfüzyon sistemine (Şekil 1A) oksijen birleştirme borusu yoluyla, Sütun 1 ve Col.2 yalıtım solüsyonu ve kolajenaz çözeltisi 1 oksijen. Benzer şekilde, oxygenate kollajenaz çözüm 2 ve üzeri% 100 O 2 ile sallayarak su banyosunda BSA çözeltisiOksijen bağlantı borusu. </li></ol> LV miyosit 3. İzolasyon <ol><li> Pentobarbital sodyum (30 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile SD sıçan anestezisi ve kıstırma ayak ve çekme yansıma eksikliği anestezi durumunu teyit. </li><li> Bir diseksiyon tepsisine sıçan taşıyın. yatar pozisyonda, bant ile vücudun kenarlarına dört ayağı sabitleyin. </li><li> kalbi zarar vermemeye sağlanması, göğüs açmak için cerrahi makas ile göğüs orta eksenel kesiler uygulayın. Bağlantı gemiler (örneğin, üst ve alt vena kava, pulmoner damarları ve aort) ve perikardiyal zarından 13 den kalbi incelemek için temiz makas başka bir çift kullanın. </li><li> Yeterli uzunlukta aort bir kısmını bırakın (5-8 mm), ince forseps ile aort kelepçe ve hızla 1 dakika (Şekil 1A) içinde Langendorff perfüzyon sistemi kanül monte edin. aorta üzerinde sıkıca dikiş ipliği 4/0 kravat. </li><li&gt; Sütun 1 vananın açma ve 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış ve oksijenli izolasyon solüsyonu (perfüzyon oranı: 12-14 ml / dak) ile izole kalbi serpmek. , Col 1 vanayı kapatınız Sütun 2 valfi açmak ve 8 kollajenaz çözüm 1 ile kalbi serpmek - 10 dk. </li><li> Aorta keserek sindirilmiş kalbi ayırın ve taze izolasyon solüsyonu (Şekil 1Bi) içeren balona forseps ile aort tutarak aktarın. Daha küçük parçalara (~ 22 mm, Şekil 1Bii) içine (septum dahil) LV serbest duvar en kesmek için ince makas ve forseps kullanın. </li><li> Önceden ısıtılmış ve oksijenli taze kolajenaz çözeltisi 2 (Şekil 1Biii) ihtiva eden bir şişe içine parçaları aktarın. 10 dakika süre ile çalkalanır. miyosit içeren kollajenaz çözüm 2 oksijen teslim tutun. </li><li> (BSA çözeltisi içeren - 2+ bir emme ampul ile damlatıcıları kullanarak 10 ml santrifüj tüpüne süspansiyon ve Ca ekleyin - miyosit TaşıHacim olarak 1: 1). 2 dakika süreyle 30 g Santrifüj ve süpernatant atın. BSA çözeltisi 5 ml miyosit pelet yeniden askıya. Santrifüj süpernatantı atmak ve. </li><li> Miyosit pelet dağılması ve oda sıcaklığında (Şekil 1Biv-VI) önceden oksijenli bir depolama solüsyonu 10 ml miyositleri tutun. </li><li> şişede kalan LV dokusu ile - prosedürleri (3.9 3.7 adımlar) tekrarlayın. LV dokusunun çoğu miyositler iyi bir verim elde etmek için kaybolana kadar tekrar - (3.9 3.7 adımlar) prosedürleri tekrarlayarak tutun: Not. </li><li> Deneylerin sonuna kadar oda sıcaklığında 6-8 saat süreyle depolama çözümü myositler tutun. </li></ol> Hücre içi Ca 2 Geçici ve miyosit daralma 4. Eşzamanlı Ölçümleri <ol><li> asetoksimetilester Fura-2 AM (2 mcM) ile yük LV miyositler. Not: Karanlık bir tüp (Şekil 1Bvii) yüklenen miyositler tüm yükleme prosedürleri ve deney gerçekleştirin. <ol><li> centr10 saniye boyunca 2000 x g&#39;de miyosit süspansiyonu (1 mi) ifuge. Süpernatantı atın ve düşük Ca 2 + konsantrasyonu (250 uM, Masa Malzemeleri ve Ekipmanları) ile Tyrode çözeltisi 1 ml miyosit pelet yeniden askıya. </li><li> Yavaşça miyosit süspansiyon, dispers, Fura-2AM ve poloksamer 407 (2 ul) ekleyin ve oda sıcaklığında karışımın tutulması - 15 dakika boyunca (20 ila 24 ° C) (Şekil 1Bvii). </li><li> Santrifüj Karışım 5 saniye için, yüzer tabaka atılır ve 500 uM Ca2 + içeren perfüzyon çözeltisi 1 ml miyosit pelet dağılır. 10 dakika sonra, 5 saniye için karışım santrifüj ve supernatant atın. </li><li> Taze perfüzyon çözeltisi (500 uM Ca2 +, 1 mi) ilave edilir ve, Fura-2AM tutulması - kayıtları için bu çözeltiye yüklenen miyosit pelet. </li></ol></li><li> LV miyosit kasılması ve hücre içi Ca ölçümü 2 + <ol><li> kaydetmeden önce, bir geçiyor perfüzyon tüpü doldurmakbir Tyrode çözeltisi ile su gömleği 36 o C önceden ısıtılmış </li><li> 8 dakika - 5 için ters bir floresan mikroskop odasının yüklenen LV miyosit süspansiyon - Bir Fura 2 AM birkaç damla koyun. Yavaş yavaş Tyrode çözeltisi (2.2 mL / dakika) serpmek. </li><li> alan stimülasyonu (2 Hz) başlatmak için dijital stimülatörü ön panelinde bulunan &quot;start&quot; düğmesine basın. Not: çıkış gerilimini (10 V, 5 msn süre) bölmenin her iki yanında yer alan platin teller üzerinden bölme miyosit uygulanır. <ol><li> stabil olduğu sözleşme Seç miyositler kayıt (hiper veya hipo-daralma göstererek olmayanlar). </li></ol></li><li> video tabanlı sarkomer algılama sisteminin yatay pozisyonda seçim miyosit ayarlayın ve sarkomer optimum görüntü elde etmek için mikroskop odağı ayarlayın. net sarkomer açıkça ortalamanın kadar gözlenir hangi alanda mor dikdörtgen kutu yerleştirinsarkomer uzunlukları (kırmızı tepe) bir tekil sivri bir tepe (Şekil 2A, alt resim) gösterir. </li><li> Alan stimülasyonu (Şekil 2A ve B) cevaben sarkomer uzunluğunun değişiklikleri kaydedin. Not: 1 içinde yüklü miyositleri kullanın - 2 saat. </li><li> Video tabanlı sarkomer algılama sistemine alan miyosit (Şekil 2A) boyutu böylece kameranın diyafram ayarlayın. 510 nm (satın alma frekansı 1000 Hz) 360 nm / 380 nm eksitasyon ve emisyon ile miyosit uyarır. Tutanak sarkomer kısalma ve alan uyarımı (Şekil 2B) ile Fura2 AM oranı. </li></ol></li></ol> Myofilament Ca 2+ Hassasiyet 5. Değerlendirme <ol><li> Ölçülen değer ile hem (- (20 izleri 10) ve aynı miyosit ve sarkomer uzunluğu vs Fura-2 oranı faz-düzlem döngü arsa sarkomer uzunlukları ve kararlı durumda 2 + transientler Ca ortalamas ve delta değişiklikleri; Şekil 2C). </li><li> Her arsa,% 50 rahatlama de Fura -2 oranı (EC 50, Şekil 2C) tanımlar. Döngü ve her müdahale EC 50 hem karşılaştırın. </li></ol>

<ol>
	<li>Bers, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+excitation-contraction+coupling.">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li><li>Eisner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+calcium+cycling+in+cardiac+muscle.">Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle.</a> Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).</li><li>Palmiter, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+regulating+the+myofilament+response+to+Ca2+:+implications+of+mutations+causal+for+familial+hypertrophic+cardiomyopathy.">Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy.</a> Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).</li><li>Missiaen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+intracellular+Ca2++homeostasis+and+disease.">Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease.</a> Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).</li><li>Trafford, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca+content+in+cardiac+ventricular+myocytes.">A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).</li><li>Berlin, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cytosolic+calcium+buffering+properties+of+single+rat+cardiac+myocytes.">Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes.</a> Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).</li><li>Robertson, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+time-course+of+Ca2++exchange+with+calmodulin,+troponin,+parvalbumin,+and+myosin+in+response+to+transient+increases+in+Ca2+.">The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+.</a> Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).</li><li>Schober, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofilament+Ca2++sensitization+increases+cytosolic+Ca2++binding+affinity,+alters+intracellular+Ca2++homeostasis,+and+causes+pause-dependent+Ca2+-triggered+arrhythmia.">Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia.</a> Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).</li><li>Briston, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balanced+changes+in+Ca+buffering+by+SERCA+and+troponin+contribute+to+Ca+handling+during+&#946;-adrenergic+stimulation+in+cardiac+myocytes.">Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during &#946;-adrenergic stimulation in cardiac myocytes.</a> Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).</li><li>Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+control+of+cardiac+myofilament+response+to+calcium+by+S-glutathionylation+at+specific+sites+of+myosin+binding+protein+C.">Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C.</a> Front Physiol. 4, 336 (2013).</li><li>Jin, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofilament+Ca2++desensitization+mediates+positive+lusitropic+effect+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+in+left+ventricular+myocytes+from+murine+hypertensive+heart.">Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+L-type+Ca2++channel+activity+by+neuronal+nitric+oxide+synthase+and+myofilament+Ca2++sensitivity+in+cardiac+myocytes+from+hypertensive+rat.">Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat.</a> Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).</li><li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li><li>Spurgeon, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+calcium+and+myofilaments+in+single+rat+cardiac+myocytes+achieve+a+dynamic+equilibrium+during+twitch+relaxation.">Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation.</a> J Physiol. 447, 83-102 (1992).</li><li>Preston, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+effects+of+the+DCM+mutant+Gly159Asp+troponin+C+in+skinned+muscle+fibres.">Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres.</a> Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).</li><li>Willott, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Troponin+that+cause+HCM,+DCM+AND+RCM:+what+can+we+learn+about+thin+filament+function?.">Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function?.</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).</li><li>Yasuda, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+study+contraction+characteristics+of+a+single+cardiac+myocyte+using+carbon+fibers.">A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).</li><li>Sears, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neuronal+nitric+oxide+synthase+isoform+regulates+myocardial+contraction+and+calcium+handling.">Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling.</a> Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).</li><li>Ashley, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+nitric+oxide+synthase+1+regulates+basal+and+beta-adrenergic+contractility+in+murine+ventricular+myocytes.">Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes.</a> Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).</li><li>Zhang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+phospholamban+phosphorylation+is+associated+with+impaired+relaxation+in+left+ventricular+myocytes+from+neuronal+NO+synthase-deficient+mice.">Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice.</a> Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).</li><li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium.">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li><li>Grynkiewicz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada, tek izole kardiyak miyosit içinde Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek için protokoller tanımlar ve bu elektrofizyolojik özellikleri yanında parametreyi, hücre içi Ca 2 + transientler ve Myofilament dinamiklerini ölçmek önemini vurgulamaktadır. bir ya da parametrelerin iki kayıtları kalp kasılma ve gevşeme altında yatan mekanizmaları izah olmayabilir olmasıdır. Miyosit daralma ve hücre içi Ca2 + profil ayrı ayrı 1 ölçmek geleneksel yöntemlerin aksine, mevcut yöntem aynı anda aynı kardiyak miyositler iki parametre incelenmektedir. Pek çok sayıda yöntem, genel olarak kas veya miyositler 15,16,17, örneğin, cidarlı miyositlerde eksojen Ca arasındaki etkileşimlerin incelenmesi + 2 ve sarkomerinde / hücre uzunluğu / gerginlik Myofilament Ca 2 + duyarlılığını değerlendirmek için kullanılır(Örneğin membran geçirgenliği saponin veya β-esin olarak deterjanlar ile tedavi). Uzunluklar kuvvet dönüştürücüler veya karbon elyafı) ile foto-diyot ve lazer ışını kırınım teknikleri ve gerilim ölçülür. Onlar Myofilament Ca 2+ duyarlılık nicel değerlendirmeler olanak çünkü bu teknikler yaygın kas çalışmalarında kullanılmaktadır. Ancak, plazma zarı ve hücre içi Ca2 + kullanım endojen iyon kanal aktiviteleri, bu Myofilament mekaniği başlatmak için gerekli olan, bu tekniklerde ihmal edilmiştir. Buna ek olarak, çalışma kapsamında kas şeritleri ya miyositler önceden gerilmiş belirli diyastolik uzunluğa, ve bu şartlar altında, ilk sarkomer uzunluğu (özellikle hastalık koşullarında ve uygulamalarla) miyositler gerçek diyastolik uzunluğundan farklı olabilir. Bu kapsamlı değerlendirmeleri mevcuttur sağlayan hücre organelleri ve böylece nispeten soğukkanlı olmaya devam akım ölçümü avantajı vurgulamaktadırmiyosit kontraktil fonksiyonun yapımı. Anlaşılır, miyositler (Ca 2 + -tolerating) ve Fura optimal yükleme kalitesi - 02:00 Myofilament Ca 2+ duyarlılık başarılı değerlendirilmesi için iki temel unsuru vardır. (Daha önce tarif edildiği gibi 18,19,20, toplam hücre% 60-80) Bu duruma göre, çeşitli modifikasyonlar uygulanabilir çubuk şekilli miyositleri elde etmek için protokol uygulanır. İlk olarak, Ca2 +, düşük bir dozda, sindirim işlemleri (örneğin, Ca2 + konsantrasyonu kolajenaz Çözeltilerin 50 uM ve depolama çözelti içinde 200 mm olan) içinde çözeltiler ilave edilir. İkinci olarak, sindirim sırasında BSA membran stabilitesini artırmak için kolajenaz çözeltilerine ilave edilir. Üçüncü olarak, çözümlerin çoğu fonksiyonel miyositlerin yüzdesi ve deneyler süresini (6-8 saat) geliştirir izolasyon sırasında oksijenli edilir. Dördüncü olarak, izole miyositler depolama çözümü c tutuluriçeren gruptur 200 uM Ca 2 +. Fura 2 am optimal yükleme elde etmek için, iki farklı Ca2 + konsantrasyonu (250 ve 500 uM) kullanılmıştır ve poloksamer 407 (2 ul,% 20 dimetil sülfoksid içinde hazırlanır) zarından, Fura-2AM geçirgenliğini arttırmak için eklenir ve miyositlerde stabilitesi. Tüm Ca 2 + göstergesi boyalar Ca + 2 tamponları 21 olduğu not edilmelidir. Bu nedenle, araştırmacılar aşırı tamponlama ve azaltılmış miyosit kasılma önlemek için Fura-2 AM yüksek bir konsantrasyon veya daha uzun bir inkübasyon kullanmaktan kaçınmalısınız. 2 yükleme rutin miyosit kalitesini ve yükleme durumunu tahmin etmek için önemli bir adımdır, hangi kontrol edilir - Fura olmadan miyosit daralma tavsiye edilir. Yükleme değişkenlik kaçınılmazdır. Nedenle, odasında miyositleri yakalanma sayısının öncesi ve benzer olup olmadığı, özellikle, miyosit kasılma değişkenliği kontrol etmek önemlidirFrangoulis yükleniyor. onlar miyositler ortalama durumunu temsil etmemektedir ve önyargılı sonuçları ve değerlendirmeler neden olabilir, çünkü hiper veya hipo-sözleşme miyositler analizi kaçınılmalıdır. Fura 2 oranında ölçülen değişikliklere, hücre içi Ca2 + seviyesi yansımaları yerine Ca 2 gerçek kimyasal konsantrasyonu olduğuna dikkat edilmelidir. Bu nedenle, burada tarif edilen yöntem Myofilament Ca 2 + duyarlılık gibi niteliksel değişiklikleri de yerine Ca 2 myofilaments gerçek hassasiyetini değerlendirir. Fura kalibrasyonu - hücre içi Ca2 + konsantrasyonu 2 sinyal bireysel miyositlerde güvenilir Ca 2 + konsantrasyonları elde etmek çözümdür. 2 AM (Ca, 0 ila 39 uM arasında değişen 2 + konsantrasyon), ve elde edilen Fura - - Kalibrasyon prosedürü Ca konsantrasyonları ile yükleme miyositleri gerektirir 2+ Fura konjüge edilmiş 2 oranları th hesaplanıre Aşağıdaki formül: [Ca2 +] i = Kd * (R - Rmin) / (Rmax - R) * F380max / F380min 21. Tür bir kalibrasyon prosedürü ile Ca + 2 konsantrasyonlarında toplanmış ortalama değerlerinin hesaplanması mümkündür. Ca 2+ göstergelerin yükleme tek bir hücre içinde yapılmaz miyositler ve kalibrasyon arasında değişken olduğundan, ancak, Ca 2 + konsantrasyonları doğru kazanılmış olabilir. F360 / F380 (bu çalışmada olduğu gibi) F340 / F380 yerine ölçülmüş ise (F360 Fura-2 floresan 22 isobestic dalga boyu olduğu için) Dahası, Fura 2 oranı daha az doğrudur. Bununla birlikte, yine de, özellikle myofilaments eş zamanlı hücre ortamında değişikliklerden sonra değiştirilebilir hastalıklı insan kupa, fizyolojik deneylerde Myofilament Ca 2 + duyarlılık gibi niteliksel değişiklikleri değerlendirmek için geçerli bir yöntemdir. (Bu yöntem, alternatif yöntemlerle birleştirilir önerilir şekilde detam Ca 2+ için myofilaments gerçek duyarlılığını analiz etmek) Tartışma bölümünde daha önce tarif. miyosit daralma çalışmada yöntemin diğer sınırlama yüksüz bir durumdur. Bu hafife veya Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri tahmin edebilir. Bu nedenle, doğru Myofilament Ca 2+ duyarlılığını değerlendirmek, analiz nitel ve nicel hem de değerlendirme için alternatif ölçümlerle yapılmalıdır. teknik, insan kardiyak hücresel redoks ortamı ve transkripsiyon sonrası modifikasyonlar değiştirilir örnekleri, Myofilament fonksiyonları birlikte değişiklikler ile sonuçlanır dahil olmak üzere sağlıklı ve hastalıklı kupa, miyokard fonksiyonunu tahmin etmek için de geçerlidir. Özellikle, iyon kanalları, hücre içi iyon homeostazisi ve myofilaments düzenleyici proteinler interaktif; Bu nedenle, tüm bu bileşenler Concer işlev(ekokardiyografi ölçüldüğünde, örneğin) t, in vivo olarak, kalp performansını belirlemek için. Sonuç olarak, Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır ve miyosit fonksiyonunun tam profilini elde etmek için kalp elektrofizyoloji ile birlikte, hücre içi Ca 2 + taşıma ve miyosit daralma bu parametreyi analiz önemini vurgulamaktadır. Myofilament Ca 2+ duyarlılığı hastalıklı kalp modellerini, bu parametrelerdeki değişimler yanı sıra çeşitli hücre içi sinyal yolları birbiriyle kullanarak mekanik çalışmalar rutin ölçülmelidir.

Kardiyak eksitasyon-kasılma (EC) bağlantı miyokard, yani kalbin 1,2 kasılma fonksiyonu mekanik özelliklerini analiz etmek için temel düzenidir. AK bağlantı sarkolemmal iyon kanallarının faaliyetleri ikincil membran depolarizasyon tarafından başlatılan (örneğin, yama-kelepçe teknikleri ile ölçülebilir voltaj kapılı Na + kanal). (Nanomolar gelen nM sitozolik Ca 2 + konsantrasyonunun artması ryanodin reseptörleri (RyRs) aracılığıyla voltaj bağımlı L-tipi sonraki aktivasyonu Ca 2 + kanal LTCCs aracılığıyla 2+ akını Ca toplu tetikler (LTCCs) ve Ca 2+ açıklaması, ) (uM) seviyesini mikromolar. Sitosolik Ca2 + böyle bir artış, ince filamanların troponin C (TNC) bağlanabilen Ca2 + teşvik eder ve ortaya çıkarır filament kompleks yapı değişiklikleri, aktin-miyosin etkileşimin kolaylaştırmak ve myocardi ulaşıral 3 daralma. Tersine, sitozolik Ca 2 + SR Ca 2 + -ATPase&#39;ın ile sarkoplazmik retikulum (SR) (SERCA2a) geri re-Alınan veya Na + / Ca 2+ eşanjör ve plazmalemmal yoluyla miyosit dışarı ekstrüde edilir Ca + 2 ATPaz 1,2. Sonuç olarak, sitozolik Ca düşüş 2+ aktin-miyozin ve miyosit rahatlama 1-3 ayrışmasından kaynaklanan özgün durumuna ince filamentler yapısal değişiklikleri başlatır. Çoğu memeli kalp hücrelerinin 1 sitosolik Ca2 + kaldırılması% 90 - Bu şemada, SERCA2a aktivitesi, genel olarak 70 oluşturmaktadır miyokardiyal gevşeme hızını belirlemek için kabul edilir. Vb LTCC, RYR ve SERCA2a, böyle anormal Ca 2 + işleme gibi hastalıklı kalp 1-4 bozulmuş kontraktilite ve dinlenmek için birincil mekanizma olarak kabul edilmiştir. 2+ toplam hücre içi Ca yaklaşık% 1 EC bağlantı hesaplarında haberci ve Ca 2+ çoğunluğu olarak işlev hücre içi Ca 2 + tamponlar 5,6 bağlıdır serbest sitozolik Ca 2 +. Bu durum, çeşitli Ca 2 + tamponlar, SR, örneğin, membran fosfolipidleri, ATP, fosfokreatin, kalmodulin, parvalbumin, myofibril TNC miyosin, SERCA2a ve calsequestrin kardiyak miyositlerde bol olduğu gerçeğidir. 5,6,7. Aralarında, SERCA2a ve TNC baskın Ca2 + tamponlar 5,6,7 vardır. Ayrıca, Ca 2 + onun tamponlar bağlanmasını seğirme sırasında dinamik bir süreçtir ve ek nedeni bağlayıcı Ca değişikliği 2+ (örneğin, 2+ Ca% 30-50 2+ transientler 7 TNC bağlanır ve Ca sırasında ondan ayırmak) kons 2+ hücre içi Ca değişiklikler de, sitoplazmada serbest Ca 2 + sonuçlarını &quot;serbest&quot;entration. Sonuç olarak, hücre içi Ca 2 + düzeyinin pertürbasyon kasılma disfonksiyonu ve aritmi 8,9 öncüleri olan anormal Myofilament hareketleri, neden olur. (Fizyolojik ve patolojik hem de) pek çok faktör Myofilament Ca 2 + tamponlama ve Myofilament Ca 2+ duyarlılığını 8-10 etkileyen Myofilament proteinlerin post-transkripsiyonel modifikasyonları, kaynakları olabilir. Son zamanlarda, bu Ca 2 + transientler, anormal Ca 2 + bırakma ve aritmiler 8 duraklamaya bağlı güçlendirilmesini tetikleme, Myofilament proteinleri mutasyonlar Ca 2 + bağlayıcı afinite ve hücre içi Ca2 + taşıma artış olduğu bildirilmiştir. Bu anlayış doğrultusunda, biz de yüksek sistolik ve diyastolik Ca 2 + düzeyleri ile ilişkili nöronal nitrik oksit sentaz up-regülasyonu sekonder hipertansif sıçan kalplerinde o Myofilament Ca 2 + duyarsızlaştırma göstermiştirSırayla, Ca 2 + bağımlı inaktivasyon 12 LTCC açığı artırmaktadır 11. Bu nedenle, Myofilament Ca 2+ duyarlılığı hücre içi Ca2 + homeostasis ve miyosit kasılma fonksiyonu bir &quot;aktif&quot; düzenleyicisidir. Bu Myofilament ve Ca arasındaki etkileşimleri analiz etmek için gerekli hale gelmiştir 2+ miyosit AK kavraması ve kalp fonksiyonlarının ayrıntılı bir araştırma için proteinleri ele. Burada, izole kardiyak miyositlerdeki Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri değerlendiren bir protokol açıklar. Hücre içi Ca 2 + profilinin kapsamlı bir analiz, Myofilament Ca 2+ duyarlılık ve daralma yeni mekanizmaları altında yatan miyokard mekaniği ortaya çıkarmak olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley rat</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 weeks</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Hanlim Pharmaceutical (Korea)</td><td>AHN901</td><td>Insurance code:645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td><td>Molecular Probes</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127 20% solution in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Water Bath</td><td>Chang Shin Scientific</td><td>Model: C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Softwae Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td>Experimental Builder</td><td>Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes</td></tr><tr><td>Myocyte Calcium &amp;amp; Contractility Recording System</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circulating Water Bath</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>Myocyte Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence &amp;amp; Video Detection</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence &amp;amp; System Interface</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>Excitation Light Source</td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>High intensity ARC Lamp Power supply</td><td>Cairn Reseach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter wheel controller</td><td>IonOptix</td><td>GB/MUS200</td><td></td></tr><tr><td>Digital Stimulator</td><td>Medical Systems Corportion</td><td>S-98 Mutimode</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Compositions of Experimental Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 135</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentration (mmol) 3.5</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentration (mmol) 20</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>Concentration (mmol) 0.4</td></tr><tr><td>Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0.2</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentration (mmol) 29</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentration (mmol) 20</td></tr><tr><td>Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 141.4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Concentration (mmol) 0.33</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 1.8&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentration (mmol) 1</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentration (mmol) 14.5</td></tr><tr><td>Collangenase Solution 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (30mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Concentration (mmol) 1.67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentration (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>Concentration (mmol) 0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0.05 mM</td></tr><tr><td>Collangenase Solution 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (20mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)</td><td></td><td></td><td>Concentration (mmol) 1.67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentration (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0.05 mM</td></tr><tr><td>BSA solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (40mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Concentration (mmol) 400 mg</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 1mM</td></tr></tbody></table>

assessment of myofilament ca2+ sensitivity underlying cardiac excitation-contraction coupling

Kalp yetmezliği ve kardiyak aritmi, dünya çapında mortalite ve morbidite nedenlerinin başında gelmektedir. Ancak, hastalıklı kalbinde patogenezi ve miyokard arıza mekanizması tam açıklığa kavuşturulması kalır. Son zorlayıcı kanıtlar Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikler kardiyak miyositler hücre içi Ca 2 + homeostazı ve iyon kanal faaliyetlerini etkileyen gösteriyor sağlıklı ve hastalıklı kalpleri kardiyak aksiyon potansiyeli ve daralma sorumlu temel mekanizmalar. Gerçekten de, (örneğin, Na +, Ca 2+ ve K + kanalları ve Na + -Ca 2+ değiştirici) ve hücre içi Ca 2 + taşıma proteinleri (örneğin., Ryanodin reseptörleri ve Ca kardiyak aksiyon potansiyelleri altında yatan iyon kanallarının faaliyetleri ve taşıyıcılar sarkoplazmik retikulum (SERCA2a) ya da fosfolamban&#39;ın ve fosforilasyon) 2 + ATPaz geleneksel katı değerlendirme için ölçülürKalp eksitasyon-kasılma (EC) bağlantının temel mekanizmaları yedik. Myofilament kasılma ve gevşeme fonksiyonel birimi ve Myofilament Ca 2 + duyarlılığı myofibril performans uygulanmasında zorunlu ise zarı ve hücre içi Ca + 2 değişiklikler iki elektriksel aktivitesindeki AT kuplaj başlatma sinyalleridir. Bu çalışmanın odak noktası olmadıkça Bununla birlikte, az sayıda çalışma miyokardın fonksiyonel analiz içine Myofilament Ca 2+ duyarlılığını içermektedir. Burada, sarkomer kısalma / yeniden uzaması ve Fura-2 AM (oranlı metrik algılama) ve sıçan kalpleri kardiyak miyozitlerde Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek kullanarak hücre içi Ca 2 + seviyesini ölçen bir protokol açıklar. Temel amacı Ca 2+ duyarlılık mekanik analiz için AK bağlantı dikkate alınması gerektiğini Myofilament vurgulamaktır. i kapsamlı bir soruşturmaöteleme ve terapötik değeri daha etkili stratejiler tasarlamak için değerli bilgiler sağlayacaktır sağlıklı ve hastalıklı kalplerde miyosit kontraktilite altında yatan kanalları, iyon taşıyıcılar, hücre içi Ca 2 + taşıma ve Myofilament Ca 2+ hassasiyeti üzerinde.

LV miyositler normal ve hipertansif sıçan kalpleri izole edilmiştir. Alan uyarılmasına tepki olarak açık bir şeritlerin (sarkomer temsil eder) ve sabit kasılmalarla çubuk şekilli miyositler uygun miyositler olarak kabul edilir ve kayıt (Şekil 2A) için seçilir. F ŞEKIL 2A&#39;da gösterilen örnekte, Fura 02:00 AG miyosit yatay konumlandırılmış ve miyosit kayıt alanı ve en az arka bölgenin en dahildir kaplayacak şekilde kameranın açıklık ayarlanır -yüklü. kayıt alanında, (kayıt programı aracılığıyla) tıklayıp bilgisayar ekranında bu kutuyu sürükleyerek mor kutunun boyutlarını ayarlayın. Ortalama sarkomer uzunluğu bir sivri kırmızı tepe gösterdiğinde, (Şekil 2A, alt resim) kaydetmeye başlayın. Sarkomer boyu ve hücre içi Ca2 + transie Hem<html> NTS (Fura-2 oranları) aynı miyositler (Şekil 3A) aynı anda kaydedilir. Sarkomer uzunluğu ve Ca 2+ geçici ortalama izleri Şekil 3B gösterilmiştir. Bireysel, diyastolik / sistolik sarkomer uzunlukları, zamanı (PT) zirve ve sarkomer kısalma genliği ve miyosit kasılma dinamiğini incelemek için ölçülür. % 50 gevşeme (TR 50) Zaman miyosit gevşemesine değerlendirmek için analiz edilir. Benzer şekilde, diyastolik ve sistolik Fura-2 oranı (Ca 2 + transientler), zaman Ca2 + geçici ve Ca zaman sabiti 2+ geçici çürüme (tau) ve miyosit kasılma ve gevşeme (Tablo değerlendirmek için analiz edilir (PT) zirve 1). Bu örnekte, Ca 2 + transientler genlikleri orta hipertansif sıçan LV miyositler artmıştır ve daralma orta (Şekil 3B ve Tablo 1) azalır. içerik &quot;fo: keep-together.within sayfa =&quot; 1 &quot;&gt; Ayrıca, Fura arasındaki ilişkiler - 2 oranı ve sarkomer uzunluğu (LV miyosit Myofilament Ca 2+ duyarlılığını gösteren) hem sahte ve hipertansif sıçanlarda çizilir ( . - Şekil 3C) Fura 2 miyosit gevşeme aşamasında sarkomer uzunluğu yörünge sitozol Ca 2+, Myofilament Ca 2 + bağlayıcı ve sarkomer uzunluğu 14 bir yarı-denge tanımlar, bu nedenle gevşeme fazı arasında iki karşılaştırılır grupları. hipertansif gruptan miyositlerde yörüngenin sağa kayma Ca2 + (Şekil 3C) karşı azalmış Myofilament tepki gösterir. Bu duruma göre, hücre içi Ca2 + konsantrasyonu artar yarım gevşeme (EC50) için gerekli olan (Şekil 3C) , hipertansiyon Myofilament Ca 2 + -desensitization atıfta. Sıçan kalp LV miyositleri izole etmek için 1. Prosedürler rakam. (A) aort yoluyla kanüle kalbine izolasyon çözümü serpmek için kullanılan Langendorff perfüzyon sistemi (içerlek, perfüzyon sistemine monte kalp büyütülmüş görüntüsü) (B) i - iii. Kollajenaz çözüm 1 ile sindirim sonra kalp ve kabı ve kap içinde AG doku parçalara (B) IV - VI.:. miyosit süspansiyon, depolama çözelti içinde kolajenaz çözeltisi 2, santrifüj işleminden sonra miyosit pelet ve yeniden süspansiyon haline miyosit pelet ilave edildikten sonra (B) VII: Kuluçka, LV inkübe Fura 2 am içinde miyositler - içeren izolasyon çözüm (2 uM Fura 02:00, 250 uM Ca 2 + 2 ul poloksamer 407 ile); washout, 500 uM Ca 2+ ile izolasyon çözümü ile LV miyositleri yıkayın; depolama, Fura-2 AM tutmak - yüklü AG miyositleri içinde500 mcM Ca 2 + içeren taze izolasyon çözüm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54057/54057fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54057/54057fig2.jpg" /> Sarkomer kısalma ve Fura-2 oranı (hücre içi Ca 2 + düzeyinin göstergesidir) Şekil 2. ölçülmesi. (A) sarkomerinde şeması, bir Fura-2 -yüklü LV miyosit bir görüntü ve ortalama sarkomer uzunluğu (kırmızı tepe) bilgisayarda görüntülenir. Alt panelde, siyah çizgi ilgi mor bölgesi içinde her yatay piksel hattı ortalamasıdır. mavi çizgi her bir ucunda sıfırlanmıştır aynı verilerdir. kırmızı çizgi FFT hesaplamıştır sinyal sayısını temsil Hızlı Fourier dönüşümü (FFT) güç spektrumu vardır. Bir keskin peak temiz sarkomer kayıt anlamına gelir. (B) sarkomer uzunluğu ve alan stimülasyonu (2 Hz) yanıt olarak Fura -2 oranının Eşzamanlı kayıtları. Aynı LV sarkomer uzunluğu vs Fura 2 oranında (C) Faz-düzlem arsa miyosit (bu parametrelerin gerçek uzunluğu hem / Fura 2 oranı ve delta değişiklikleri incelendiğinde unutmayın). AK 50 (% 50 gevşeme de Fura 2 oranı, okla gösterilen daire) gruplar arasında Myofilament Ca 2+ duyarlılık niteliksel bir fark var. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54057/54057fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54057/54057fig3.jpg" /> Şekil sham ve hipertansif sıçanlarda LV miyosit daralma analizi 3. Temsilcisi sonuçları. (A) sarkomer s Ham izlerihortening ve Fura - plasebo ve hipertansif sıçanların LV miyositlerde 2 oranı ölçümü (B) sarkomer uzunluğu ve Fura ortalama izleri -. 2 sinyaller. Iki grupta - 2 sarkomer uzunluğu genel oranı (bu parametrelerin 2 oranı ve delta değişiklikler hem gerçek uzunluğu ve Fura -) ortalama izleri analiz parametreler Tablo l&#39;de Fura 1. (C), faz-düzlemi grafikleri gösterilmektedir . Yörünge döngü sağa kaydırılır ve AK 50 Myofilament Ca 2 + duyarsızlaştırma düşündüren, hipertansiyon daha yüksek olma eğilimindedir. PT, zaman (sn) tepe; % 50 gevşeme (sn) zaman: .tr 50 - Tau, Ca 2 + geçici çürüme (sn) zaman sabiti (bir üstel fonksiyonu ile 2 oranında Fura düşüş safhasını takarak elde edilir). <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54057/54057eq1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54057/54057fig3large.jpg" target="_blank">Büyük halini görmek için buraya tıklayınız</a>bu rakamın. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> parametreler </td><td> sahte </td><td> Hipertansiyon </td></tr><tr><td rowspan="5"> Hücre içi Ca 2 + </td><td> Diastolik Ca 2+ </td><td> 1,189 </td><td> 1,124 </td></tr><tr><td> Sistolik Ca 2+ </td><td> 1.71 </td><td> 1,691 </td></tr><tr><td> Genlik (Δ oranı) </td><td> 0,521 </td><td> 0.567 </td></tr><tr><td> zirveye zamanı (PT, s) </td><td> 0.021 </td><td> 0.031 </td></tr><tr><td> Tau (ler) </td><td> 0.079 </td><td> 0.076 </td></tr><tr><td rowspan="7"> sarkomer </td><td> diastolik </td><td rowspan="2"> 1,758 </td><td rowspan="2"> 1.78 </td></tr><tr><td> sarkomer uzunluğu (mm) </td></tr><tr><td> sarkomer </td><td rowspan="2"> 0.122 </td><td rowspan="2"> 0.115 </td></tr><tr><td> Kısaltmak (16; uzunluk, aa) </td></tr><tr><td> zirveye zamanı (PT, s) </td><td> 0.064 </td><td> 0.055 </td></tr><tr><td> % 50 Zaman </td><td rowspan="2"> 0.032 </td><td rowspan="2"> 0.03 </td></tr><tr><td> Gevşeme (TR 50, s) </td></tr><tr><td> EC50 </td><td> [Ca2 +],% 50 sarkomer relengthening i (Fura-2 oran) </td><td> 0,2382 </td><td> 0,3224 </td></tr></tbody></table> Fura Tablo 1. Analiz - 2 oranı (hücre içi Ca2 +) ve sarkomer uzunluğu ölçümleri.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling at JoVE.com

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Myofilament Ca Değerlendirilmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Duyarlılık temelinde Kardiyak Uyarma-kasılma Kaplin

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

assessment-myofilament-ca2-sensitivity-underlying-cardiac-excitation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

9.4K Görüntüleme.  Seoul National University College of Medicine. This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts. 

Video: Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and geometric&#160;deformation. Our understanding of the internal relationships between these events has been limited because we can neither &#39;see&#39; inside the muscle nor precisely track the spatio-temporal nature of excitation-contraction dynamics. To resolve these problems, we have constructed a device that combines a suite of imaging modalities. Specifically, it integrates a brightfield microscope to measure local changes of sarcomere length and tissue strain, a fluorescence microscope to visualize the Ca2+ transient, and an optical coherence tomograph to capture the tissue&#39;s geometric&#160;changes throughout the time-course of a cardiac cycle. We present here the imaging infrastructure and associated data collection framework. Data are collected from isolated rod-like tissue structures known as trabeculae carneae. In our instrument, a pair of position-controlled platinum hooks hold each end of an ex vivo muscle sample while it is continuously superfused with nutrient-rich saline solution. The hooks are under independent control, permitting real-time control of muscle length and force. Lengthwise translation enables the piecewise scanning of the sample, overcoming limitations associated with the relative size of the microscope imaging window (540 &#181;m by 540 &#181;m) and the length of a typical trabecula (&#62;2000 &#181;m). Platinum electrodes at either end of the muscle chamber stimulate the trabecula at a user-defined rate. We exploit the stimulation signal as a trigger for synchronizing the data from each imaging window to reconstruct the entire sample twitching under steady-state conditions. Applying image-processing techniques to these brightfield imaging data provides tissue displacement and sarcomere length maps. Such a collection of data, when incorporated into an experiment-modeling pipeline, will provide a deeper understanding of muscle contractile homogeneity and heterogeneity in physiology and pathophysiology.

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

This protocol presents a collection of sarcomere, calcium, and macroscopic geometric&#160;data from an actively contracting cardiac trabecula ex vivo. These simultaneous measurements are made possible by the integration of three imaging modalities.

Kardiyak Trabeculae Ex Vivo'nun Eşzamanlı Brightfield, Floresan ve Optik Tutarlılık Tomografik Görüntülemesi

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

Biyomühendislik

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Biyoloji

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Tıp

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Farelerde Kardiyak inotropiyi Soruşturma İzole papiller Kaslar kontraktilite Ölçümleri

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury and/or remodeling. One approach for assessing these functional alterations utilizes unloaded shortening and Ca2+ transient analyses in primary adult cardiac myocytes. For this approach, adult myocytes are isolated by collagenase digestion, made Ca2+ tolerant, and then adhered to laminin-coated coverslips, followed by electrical pacing in serum-free media. The general protocol utilizes adult rat cardiac myocytes but can be readily adjusted for primary myocytes from other species. Functional alterations in myocytes from injured hearts can be compared to sham myocytes and/or to in vitro therapeutic treatments. The methodology includes the essential elements needed for myocyte pacing, along with the cell chamber and platform components. The detailed protocol for this approach incorporates the steps for measuring unloaded shortening by sarcomere length detection and cellular Ca2+ transients measured with the ratiometric indicator Fura-2 AM, as well as for raw data analysis.

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

A set of protocols are presented that describe the measurement of contractile function via sarcomere length detection along with calcium (Ca2+) transient measurement in isolated rat myocytes. The application of this approach for studies in animal models of heart failure is also included.

Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca2+ Geçicilerinin Analizi

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Doğal İskelet Kası Hücrelerinde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, including voltage-gated ion channels. This approach has been used primarily in heterologous expression systems to simultaneously measure membrane currents, the electrical manifestation of the channels&#39; activity, and fluorescence measurements, reporting local domain rearrangements. Functional site-directed fluorometry combines electrophysiology, molecular biology, chemistry, and fluorescence into a single wide-ranging technique that permits the study of real-time structural rearrangements and function through fluorescence and electrophysiology, respectively. Typically, this approach requires an engineered voltage-gated membrane channel that contains a cysteine that can be tested by a thiol-reactive fluorescent dye. Until recently, the thiol-reactive chemistry used for the site-directed fluorescent labeling of proteins was carried out exclusively in Xenopus oocytes and cell lines, restricting the scope of the approach to primary non-excitable cells. This report describes the applicability of functional site-directed fluorometry in adult skeletal muscle cells to study the early steps of excitation-contraction coupling, the process by which muscle fiber electrical depolarization is linked to the activation of muscle contraction. The present protocol describes the methodologies to design and transfect cysteine-engineered voltage-gated Ca2+ channels (CaV1.1) into muscle fibers of the flexor digitorum brevis of adult mice using in vivo electroporation and the subsequent steps required for functional site-directed fluorometry measurements. This approach can be adapted to study other ion channels and proteins. The use of functional site-directed fluorometry of mammalian muscle is particularly relevant to studying basic mechanisms of excitability.

Yazar Spotlight: İskelet Kası Uyarılabilirliğini İncelemek İçin Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri  

Functional site-directed fluorometry is a method to study protein domain motions in real time. Modification of this technique for its application in native cells now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+ channels in murine isolated skeletal muscle fibers.

İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

Myofilament Ca Değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kardiyak Trabeculae Ex Vivo'nun Eşzamanlı Brightfield, Floresan ve Optik Tutarlılık Tomografik Görüntülemesi

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

Farelerde Kardiyak inotropiyi Soruşturma İzole papiller Kaslar kontraktilite Ölçümleri

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama

Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca²⁺ Geçicilerinin Analizi

İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi

İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri