Bu çalışma Max Planck Kurumu (KMD, BD, AWM&#39;nin, TB, TBB, DJM ve WK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) ve bir doktora sonrası EMBO Uzun Vadeli tarafından finanse Excellence Frankfurt &quot;makromoleküler kompleksleri&quot; bir Kümesi tarafından desteklenen Bursu (VAMG).

Diferansiyel Santrifüj ile hücreler ya da dokulardan Mitokondri hazırlanması 1. Bu bölüm, çeşitli ökaryotik sağlam mitokondri izolasyonu için genel bir prosedürü anlatmaktadır. Tampon parçaları ve santrifüj hızları hassas, her doku için optimize edilmesi gerekir / türler okudu. <ol><li> Izotonik tampon hücreleri Ayrılma (örneğin, 250 mM sakaroz, 10 mM HEPES, pH 7.4) içinde bir cam boncuk öğütücüsü kullanılarak (mantar miselyumu), 28, enzimatik hücre duvarı (Saccharomyces cerevisiae) 29, bir bilyalı homojenleştirici sindirimi (tek cell ökaryotlar / kültür hücre / nematodlar) 30 veya blender (hayvan veya bitki dokuları) 31. </li><li> Düşük hızlı santrifüj (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika) ve ardından da müslin içinden süzme ile hücre kalıntıları uzaklaştırılmıştır. </li><li> 9000 xg, 4 ° C (yüksek hızda santrifüj ile yüzer madde ve topak mitokondri toplayın, 10 dakika). </li><li> Gerekli olduğu takdirde, mitokondrial fraksiyonu 32, ilave saflaştırma için izotonik yoğunluk basamaklı bir derece kullanın. </li></ol> Elektron Cryo-tomografi için Mitokondri 2. hazırlanması Aşağıdaki bölümde, cryo-ET için dondurulmuş hidratlanır örnekleri elde açıklamaktadır. Not: Bu yöntem ciddi deri yanıklarına neden olabilmektedir derece soğuk sıvı azot ve etan kullanılmasını da gerektirir. Koruyucu gözlük ve cryo-koruma eldiven giyilmelidir. Ayrıca yanıcı sıvı etan, davlumbaz içerisinde ele alınmalıdır. <ol><li> 250 mM Trehaloz, yaklaşık 5 mg / ml toplam protein konsantrasyonunda, pH 7.4 &#39;de 10 mM HEPES tamponu içerisinde yeniden süspanse topak mitokondri. </li><li> Glow-deşarj holey karbon EM ızgaraları, üreticinin talimatlarına göre bir vakum cihazı karbon tarafı yukarı. </li><li> Bir sıvı azot serin iç tarafı üzerine etan gazı akımının yönlendirilmesi ile etan birkaç mililitre sıvılaştırılmasıed alüminyum kap. </li><li> Mitokondriyal süspansiyon ile 1 ve hemen cımbız düzenlenen kızdırma deşarj EM ızgara 3 ul geçerlidir: protein A-konjuge altın yanlılık süspansiyon 1 karıştırın. </li><li> Bir vitrifikasyon cihaz örneğin, bir ev yapımı giyotin içinde cımbız yerleştirin. Filtre kağıdı bir kama ile (~ 5 saniye veya sıvı durduktan yayma kadar) ve hemen tetiği bırakmadan tarafından sıvı etan içine ızgara dalma aşırı sıvı kurulayın. </li><li> Sıvı azot içine sıvı etan ızgara aktarın. Taşıma sırasında, filtre kağıdı ile ızgara fazla etan çıkarın. Sıvı etan içine bir filtre kağıdı kama şeklindeki parçanın ucu ile. Sıvı etan yükseldikçe, hafifçe filtre kağıdı ızgara sürükler ancak sıvı ön altında tutun. Sıvı etan kılcal hareket ile ızgara çıkarılır ve tüm sıvı etan çıkarıldıktan sonra, hemen sıvı azot içine ızgara aktarılmaktadır. </li><li> , Izgara saklama kutusu içine vitrifiye ızgara yerleştirin, birnd uygun şekilde daha sonraki kullanım için sıvı azot altında depolayın. </li></ol> Tomografik Tilt Serisi 3. Kaydı Aşağıdaki bölümde kurmak ve bir post-kolon enerji filtre ve CCD kamera ile donatılmış bir Polara elektron mikroskobu ile bir mitokondrinin bir tomografik eğim dizi toplamak açıklamaktadır. Benzer protokolleri CCD veya doğrudan elektron dedektör kameralarla donatılmış tüm elektron cryo mikroskopları kullanılır. <ol><li> Mikroskop hizalayın <ol><li> Testi takın örnek, örneğin, grafit ve holey karbon film altın adalar. </li><li> Mikroskobun düşük doz sisteminde seçiniz arama modu. </li><li> Eucentric yüksekliğe örnek getirin. Numune tutucu eğildiğinde bu minimal xy hareket noktasıdır. , 0 ° eğimde ilgi noktasını ortalamak 20 ° sahne eğin ve z yüksekliğini değiştirerek noktasını yeniden ortalamak. 0 ° dönün ve yanal ofset minimize edilinceye kadar tekrarlayın. </li><li> Seçinizpozlama modu. Bir tomogram toplamak için istenen büyütme seçin (örneğin, piksel boyutunu numune nm dedektör ≈ 0.6 üzerinde 25,000X). </li><li> Küçük bir kondansatör diyaframı (50-70 mm) seçin ve ışın görüntüleme cihazı yerine sadece daha geniş ve 60 e bir piksel okuma verir, böylece bir nokta boyutu ve ışın yoğunluğunu seçmek - / piksel (CCD) veya 14 e - / piksel / sn (doğrudan elektron dedektörü, sayma modu). </li><li> Merkezi kondansatör diyafram. </li><li> Gauss odak örneğin minimal kontrast noktasını bulun. Sıfırlama mikroskop bulanıklaştırma okuma ve doğru mafsal noktalarını ve üreticinin talimatlarına göre rotasyon merkezi. </li><li> Tomogram kayıt için istenen flulaştırmayla olarak çevirin. NOT: Düşük odaksızlık (2-4 mikron) kontrast pahasına çözünürlüğü artar ise Yüksek odaksızlık (8 mikron), kontrastı artırır ama çözünürlüğü azaltır. </li><li> Boş bir çukurun üzerine, göre üreticinin yeni kazanç referans oluşturmak ve enerji filtresi hizalamatalimatları. </li><li> Arama ve pozlama modları hizalayın. Pozlama modunda, bir ilgi noktasını ortalamak ve arama moduna geçmek. Seç 1,500X büyütme (dedektör üzerinde numunenin 0.033 mm / piksel) ve (artmış kontrast için) 100 mikron odaksızlık. Görüntü kaydırma bobinleri kullanarak ortalamak için faiz arka noktaya getirmek. </li><li> / Piksel (CCD) veya ~ 8 - e - ışın görüntüleme cihazı yerine sadece daha geniş ve 20 e ~ piksel okuma verir böylece arama modunda, spot boyutu ve ışın yoğunluğunu ayarlayın / piksel / sn (doğrudan elektron dedektörü, ) modunu sayma. </li></ol></li><li> İyi bir Numune Alanı bulma <ol><li> Sıvı azot sıcaklığında elektron mikroskop içine donmuş hidratlanır mitokondri ile ızgara yerleştirin (EM üreticinin talimatlarına bakın). </li><li> Arama modunda, uygun buz kalınlığı ve örnek kalitesi alanları için ızgara arayın. Tomogram koleksiyon için uygunluğunu belirlemek umut verici alanlarından bir 6 saniye arama görüntüsünü alın. Both iç ve dış mitokondrial membran bu büyütme görünür olmalıdır. </li></ol></li><li> Bir Tomografik Tilt Serisi Kayıt <ol><li> İyi bir örnek alanı bulunduktan sonra 60 ° pozlama herhangi bir engel olmadan kullanılabilir maksimum eğim aralığı belirlemek veya ızgara çubukları veya buz parçaları ile odak alanı için ±, sahne yatırın. </li><li> / CCD veya 6-8 e piksel - - ​​benzer görünüm yakındaki bir buz dolu delik, böylece her kaydedilen görüntü 30-50 e bir elektron dozu var ışın yoğunluğu veya görüntü alma zamanı pozlama moduna geçmek ve ayarlayın / piksel / modu sayma, doğrudan elektron dedektörleri s. </li><li> 60 ° görüntünün o ile 0 ° edinilen 1 sn görüntü için ortalama elektron sayısının bölünmesiyle doz dağılımı oranını (I 0 / I 60) hesaplayın. Bu oran (tutma süresi = 1 / C eğim açısı arttığında görüntü başına sabit bir elektron sayılmasını sağlamak için gerekli maruz kalma süresinde artış demektiros (α) n burada (I 0 / I 60) = 2 n). Oranı da buz kalınlığı iyi bir göstergesi olarak hizmet vermektedir. Mitokondri İyi tomografi genellikle I 0 / I 60 = 2.3-2.6 ile kaydedilir. </li><li> Boş bir çukurun üzerine, pozlama modu 1 sn görüntü elde ve Å 2 başına elektron sayısını unutmayın. Dikkate doz dağılımı oranını alarak, belirli bir toplam elektron doz için kaydedilebilir resimlerin toplam sayısını hesaplamak (örneğin, &lt;40 e - yapı tayini için / Å 2 &amp; ~ 160 e - morfoloji için / Å 2). </li><li> Toplam eğim aralığı bölünmesi ile tomogram toplanması için uygun bir eğim aralığını belirlemek (örneğin, ± 60 °, 120 °) 3.3.4 hesaplanan görüntülerin toplam sayısına göre. </li></ol></li><li> Set up ve uygun otomatik veri toplama yazılımı 3 kullanılarak yukarıda belirlenen parametreler ile bir tomogram kayıt3, 34. Tilt dizi genellikle ± 20 ° başladı ve artan elektron doz tarafından tahrip düşük eğim görüntülerin bilgi içeriğini maksimize etmek için yüksek tilts ulaşmadan 0 ° geçmesi edilir. </li></ol> 4. Oluşturma ve Tomografi Ciltler Segmentasyon Bu bölüm mitokondri tomografik hacimleri eğim serisi ve hacimleri genel görüntüleme için mevcut ne üretilir açıklamaktadır. <ol><li> Uygun bir dizine tomografik tilt dizi kaydedebilirsiniz. Görüntü yığını oluşturmak ve mrc yığınlarının .dm3, .dm4 veya .tif dosyalarını dönüştürmek gibi dm2mrc veya tif2mrc (IMOD paket) gibi açık kaynak yazılım, uygun bir dosya biçimi, dönüştürün. mrc yığınları imod 35 tomografik yeniden yapılanma için gereklidir. Diğer paketler farklı biçimleri gerektirir. </li><li> (Görüntüleri hizalayın ve IMOD öğretici ayrıntılı adımları izleyerek bir tomogram oluşturmak <ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li> Imod ile dağıtılan doğrusal olmayan anizotropik difüzyon filtresi kullanılarak tomografisinde kontrastını arttırmak. Bu filtre membranlar ve bu ATP sentaz gibi membran-ilişkili parçacıklar için de çalışıyor. </li><li> Görselleştirme için, el ile kademeli tomogram, örneğin, ticari olarak temin edilebilir Amira programları kullanılarak. Iç ve dış zar tekabül eden vokseller atama ve bir yüzey oluşturur. Amira 36 için EM-paket eklenti tıkırtı seçeneğini kullanarak ATPsentaz parçacıkların konumunu işaretleyin. </li></ol> 5. Subtomogram ATP Sintazı dimerlerinin ortalamasının ve X-Ray Yapılarının Dizaynı Aşağıdaki bölümde ATPsentaz dimerlerinin subtomogram ortalamaları elde edilebilir anlatılmaktadır. <ol><li> Böyle &#39;Kapsamında girdi ve uygun bir yazılım paketi olarak işaretlenmiş parçacıklar kullanılarakElektron Tomografi &#39;programı için icle Tahmini, bir subtomogram ortalamasını hesaplamak. </li><li> Bir çözünürlük tahmini için, Fourier kabuk korelasyon 37 iki bağımsız olarak belirlenir subtomogram ortalamalarının karşılaştırılması. </li><li> Rijit gövde tarafından subtomogram ortalama içine mevcut, rıhtım bilinen X-ışını yapılar, ya elle uydurma veya programda Chimera 38 gibi otomatik sıralı yerleştirme rutinleri kullanıyorsanız. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada sunulan protokol ve mitokondri subtomogram ortalamasını ET-kriyo bir giriş sağlar, ancak esas itibariyle aynı prosedürü herhangi bir başka hücre bölmesi veya membrana uygulanabilir. Mümkün olan en iyi verileri elde etmek için, işlem sırasında kritik adımlar numune hazırlama, dalma dondurma işlemi ve veri toplama stratejisi vardır. Başarı için kritik olan örnek kalitesi, iyi görüntü kontrastı için büyük önem taşımaktadır uygun buz kalınlığının sağlanması için optimize edilmiş bir donma protokolü bağlıdır. En iyi veri elde etme stratejisi cihaz ve örnek bağlıdır. Optimize edilmesi Parametreler görüntü başına elektron doz, eğim düzeni ve bulanıklaştırma bulunmaktadır. İyi bir örnek iyi bir tomogram Kazanılması bütün işleme kolay adımları ve tatmin edici bir uç sonuç sağlar yapar. Cryo-ET subtomogram ortalama alma ve atom modeli montaj ile kombine protein kompleksleri inci nasıl düzenlenir ayrıntılarını sağlarEIR yerli hücresel ortamı. Bu teknik, örneğin solunum zinciri supercomplexes (1.7 MDA), ATP sentetaz dimerlerinden oluştuğunu gösterir (2x500 kDa), ya da çekirdek gözenek kompleks (~ 120 MDA) 8, 9, 17 gibi büyük bir zar protein kompleksleri, yapısını araştırmak için de aynı derecede uygundur. Dimer satırlar izolasyonu gerekli bir adımdır deterjan ekstraksiyon, bozulur çünkü satır içine ATPsentaz dimerlerinin organizasyonu, örneğin X-ışını kristalografisi, NMR veya tek-parçacık cryo-EM gibi yüksek çözünürlüklü teknikleri ile görülemez ve membran protein komplekslerinin saflaştırılması. Kristalarında sırtlarda dimerlerinin satır ATP sentaz düzenlemesi bütün türlerin mitokondri evrensel bir örgütlenme ilkesidir. Elektron nakil zincirinin proton pompalama kompleksleri, özel komplekse, I (NADH dehidrojenaz), ya da yan satır 8 zarı alanları bulunur9. Solunum zinciri Bu organizasyon mitokondriyal Bioenerji üzerinde derin bir etkisi vardır. Dimer satır bağlı dimer özel protein alt birimlerinin olmaması oluşturamazsa, Şekil 3 41&#39;de gösterilen maya mutant de görüldüğü gibi, hücreler daha uzun üretim süresi ve düşük hücresel uygunluk gösterirler. Mitokondriyal hastalıklarda artan ilgi ile, detaylı bir mitokondriyal ultrastrüktürünü ve işlevini yöneten moleküler temeli anlaşılması önem taşımaktadır. Elektron cryo tomografi nanometre ölçeğinde zar protein yüksek çözünürlüklü metodlarla tespit yapısı ve dağılımı ve bu proteinlerin düzenleme arasında bir bağlantı sağlar. Bu cryo-ET sağlığı ve hastalıkları, mitokondriyal yapısını ve işlevini anlamak için gerekli bir araç yapar. Cryo-ET de teknik ilerlemeler ve gelişmeler Protei konumunu belirlemek için protein etiketleme stratejileri içerirmakromoleküler kompleksleri n alt üniteleri veya hücrelerde daha küçük veya daha az farklı proteinlerin yeri (&lt;0.5 MDa). Ayrıca, tek parçacık analizi veya sarmal imarlı subtomogram ortalamasını birleştiren hibrid EM işleme yöntemleri, son zamanlarda protein yapılarını tespit ettik Å 42, 43 8 ~ için. Bu işleme yöntemleri şu anda iyi buz ayrılmış veya sarmal meclisleri oluşturmak ve şu anda mitokondri gibi kalabalık ortamlarda hücresel için geçerli değildir ve membranlar kristalarında olan saflaştırılmış proteinlerin, kısıtlanır. Veri toplama için yeni bilgisayar ve donanım araçları, otomatik tomogram satın izin görüntü kontrastını artırmak ve gereken toplam elektron dozu azaltmak için geliştirilmektedir. Kriyo-ET tek temel sınırlama elektron ışını ile radyasyon numuneye zarar verir. Bu, sadece çok düşük dozlarda elektron zayıf sinyal-t ile sonuçlanan bir tomografik eğim serinin her görüntüyü kaydetmek için kullanılan anlamına gelirO-gürültü sonuçta elde çözünürlüğünü sınırlar oranı. Bir yıl önce daha az piyasaya yeni doğrudan elektron dedektörleri, şu anda tek parçacık cryo-EM 44, 45 alanında devrim vardır. Bu yeni detektörler düşük elektron dozlarda daha yüksek kontrast ve daha iyi çözünürlük sağlar. Elektron cryo-tomografi için, bu aşırı radyasyon hasarı (bir CCD görüntü 5 doğrudan elektron dedektörü görüntüleri elektron dozunda eşdeğer) endişe olmadan alınabilir küçük adım boyutlarda hatta çift eksenli tomogramları ile Eğim dizi anlamına gelir. Bu dedektörler tarafından üretilen verilerin büyük miktarlarda üstesinden gerekecektir veri işleme, saklama ve işleme kendi zorlukları, oluşturun. Buna ek olarak, faz kontrastı arttırmak için ışık mikroskobu rutin olarak kullanılanlar gibi benzer prensipler ile çalışır faz plakaları şu anda, transmisyon elektron mikroskopisi 46, 4 için geliştirilmektedir7. Bu tomografi odaklanmak yakın toplanmış ve dolayısıyla daha yüksek çözünürlükte, aynı zamanda düşük çözünürlüklü koruyarak uyum ve tomografik hacimleri yorumlanması için gerekli özellikleri izin vermelidir. Birlikte ele alındığında, bu teknolojik gelişmeler büyük ölçüde cryo-ET tarafından ele alınabilir biyolojik sorular yelpazesini genişletmek olacaktır.

Mitokondri hücrenin güç evler. Kimyasal bağ enerji içine iç mitokondrial membran genelinde bir elektrokimyasal proton degrade dönüştürerek, mitokondriyal ATP sentaz hücresel süreçleri sürücüler ATP&#39;nin en üretir. Mitokondrial enerji dönüşümü arkasındaki mekanizmaları anlamak için, biz yerinde ATP sentaz yapısını belirlemek için, ve düzenlenmiş ve iç mitokondrial membran nasıl dağıldığını bulmak gerekir. Tüm karmaşık 4 mitokondrial ATP sentetaz bileşenleri 1-3 ve düşük çözünürlüklü haritalar çoğu yüksek çözünürlüklü yapılar mevcut olmakla birlikte, bu membran, işçi enzimin yapısını ve bir biçimini oluşturmaktır önemlidir. Iç mitokondrial membran ATP sentaz dağılımı yaygın olarak rastgele olduğu varsayılır, ancak 6 bu t değil belirtti 5 ve kendi ilk sonuçları erken olmuşturO durumda. Elektron taşıma zincirinin proton pompa her iki tarafında bulunduğu görülür iken sonradan bizim gruptan çalışmalar ve diğerleri 7, ATP sentaz iç mitokondrial membran kristalarında 8 sıkıca kavisli sırtlar boyunca dimerlerinin uzun sıralar halinde düzenlenmiş olduğunu doğruladı Sıralar 9. Bu düzenleme mitokondriyal enerji dönüşüm mekanizmalarının önemli etkileri vardır. Biz bu düzenlemeyi belirlemek için kullandık tekniği elektron cryo-tomografi (cryo-ET) &#39;dir. Cryo-ET şu anda moleküler çözünürlükte hücreler, hücre bölmeleri veya organellerin doğru üç boyutlu (3D) hacimlerini veren tek yöntemdir. Zarlar iyi kontrast görünür ve 3D tomografik hacimlerde iz kolay çünkü cryo-ET, biyolojik zarların büyük kompleksleri eğitim için uygundur. Diğer yöntemler, hücrelerin veya organell 3D yapısını incelemek içines moleküler detay vermeyin. Süper çözünürlük ışık mikroskobu 10, 11 pozisyon veya nm onlarca hassasiyetle ilgi proteinlere bağlı ışık yayan etiketler arasındaki mesafeleri ortaya çıkarmayı mükemmel, ama bu bile düşük çözünürlükte, proteinin kendi yapısını ortaya koymuyor . Plastik-gömülü biyolojik numunelerin elektron mikroskobu 13 taramalı seri bölümleri 12 ya da blok-yüz görüntüleme transmisyon elektron mikroskopisi, hücre hacimlerinin düşük çözünürlüklü manzaralar sunar ama aynı şekilde moleküler detay ortaya koymuyoruz. Atomik kuvvet mikroskobu 14 prensip moleküler hatta atomik çözünürlük sunuyor, ama sadece bir atomik düz, katı destek nesnelerin yüzeyinde olabilir. Son olarak, X-ışını tomografisi 15 ya da serbest elektron lazerleri yoğun X-ışını palslarının saçılma örneğin 16 m bütün hücrelerin veya organel olarak büyük, kompleks, aperiyodik nesne yapısını ortaya çıkarmak için pek mümkün değildiröngörülebilir gelecekte olecular çözünürlük. Böylece şu anda, nanometre çözünürlükte hücreleri veya organellerin 3D yapı çalışmaları için-ET cryo için hiçbir alternatif yoktur. Kriyo-ET, çekirdek gözenek kompleks 17, grip başak 18 kompleksleri de dahil olmak üzere zara bağlı protein düzeneklerinin yapısını ve şeklini incelenmesi için tercih edilen bir yöntem, ve kamçı motor proteinleri, 22, 23, aynı zamanda, tüm bakteri hücreleri 19 arasında organizasyon hücrelerde 20-23 ile HIV gibi patojenik virüslerin ve giriş. Cryo-ET aktin filamentler 24 veya axonemes 25 dahil ipliksi proteinler ve hücre içindeki etkileşimleri, görselleştirmek için paha biçilmezdir. Çözünürlüğü tekrar düzenli özellikler hacimler tek parçacık Image Pro bir tomografik birimin kesilmiş ve ortalaması alınır ve bu sayede subtomogram, 26, ortalama 2 nm ya da daha iyi arttırılabilircessing teknikleri. Cryo-ET transmisyon elektron mikroskobu (TEM) farklı tilt açıları alınan ince bir örneğinin (&lt;250nm) projeksiyon görüntüleri bir dizi satın içerir. Madde ile kuvvetli bir etkileşimi elektronlar, birden fazla dağılmış şekilde örnek ince olmalıdır. Çoklu saçılma yorumlamak çıkan görüntülerin zorlaştırır ve kontrastı azaltır. Seçilen örnek alanın Görüntüler her bir diğerine göre hizalanmış ve numunenin bir 3D hacmi üretme, uygun bir bilgisayar programı tarafından 3D uzaya yansıtılır. Görüntülerin hizalama dondurma öncesi numune ile karıştırılır altın yanlılık belirteçleri tarafından desteklenir. İdeal olarak 10 ya da daha fazla eşit dağıtılmış yanlılık belirteçler iyi bir uyum elde etmek için, her bir görüntü mevcut olmalıdır. Moleküler ayrıntı gözlemek için, numuneler dalma-dondurulmuş onların yerli hidrate durumunu korur sıvı etan, vardır. Bir sıvı içinde dondurulmasıetan kadar hızlı (~ 5 ° 10 ° C / sn) su kristalize ama vitrifiye, cam benzeri durumda kalır değil 27. Buz kristallerinin oluşması zarar verir ve hassas biyolojik yapıları. Biyolojik örnekler radyasyon hasarı muzdarip gibi, numune tahammül saçılma olaylarının toplam sayısı için bir sınır yoktur. Görüntüler böylece düşük doz modunda edinilen: ilgi alanı 1 e altında bir elektron doz düşük büyütme (1,500X) tespit edilir - / 2 nm (arama modu). Görüntü daha sonra faiz (odak modu) alanı kapalı, yüksek büyütmede odaklanmıştır. Bir görüntü elde edilir sadece, ilgi alanı yüksek bir elektron dozda (pozlama modu) ile ışınlanır. Burada, bir örnek olarak iç mitokondrial membran ATP sentaz dimerleri kullanarak toplama ve proses elektron cryo-tomografi için nasıl bir bakış sunacak. Aşağıdaki protokol cryo-ET için mitokondri nasıl hazırlanacağını anlatır, nasıl kurmakve belirli bir toplam elektron dozu ve nasıl ilgi alanındaki bir 3 boyutlu hacim elde etmek için tenteli serisi işlemek için olan bir eğim dizi toplamak. Işlem bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sucrose</td>
			<td style="width:235px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">4621.2</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trehalose</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">HEPES</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zymolase</td>
			<td style="width:235px;">biomol</td>
			<td style="width:119px;">Z1000.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Density gradient medium</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D1556 or P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Protein A gold</td>
			<td style="width:235px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">810.111</td>
			<td>10 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Ethane</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">P0502S02R0A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">I4150RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Consumables</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Filter paper</td>
			<td style="width:235px;">Whatman, GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">1004 090</td>
			<td>Nr 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tweezers</td>
			<td style="width:235px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">T506</td>
			<td>Non-magnetic, pattern #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">EM combined test grid</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">S142</td>
			<td>grapite and gold islands on holey carbon film</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Holey carbon grids</td>
			<td style="width:235px;">Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>R2/2 300 Cu mesh&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryo grid boxes</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">160-42</td>
			<td>Alternative home-made metal boxes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Potter</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender</td>
			<td style="width:235px;">Waring</td>
			<td style="width:119px;">8011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glass bead mill - bead beater</td>
			<td style="width:235px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:119px;">1107900-105</td>
			<td>Including 0.5 mm beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ball-bearing (Balch) homogeniser</td>
			<td style="width:235px;">isobiotec</td>
			<td style="width:119px;">H8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:235px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46915</td>
			<td>Sorvall RC6+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glow-discharge apparatus</td>
			<td style="width:235px;">Bal-Tec A.G.</td>
			<td style="width:119px;">CTA 010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Grid vitrification device</td>
			<td style="width:235px;">FEI, Gatan or Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Alternative home-made plunger</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:235px;">FEI or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Direct electron detector (CMOS)</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4k x 4k pixels, counted mode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Charge coupled device</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Energy filter</td>
			<td style="width:235px;">Gatan or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Software</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram processing software</td>
			<td style="width:235px;">FEI, UCSF or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Subtomogram averaging software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, or University of Basel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Tomogram visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, FEI, or University of Utah</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">visualisation software plugin</td>
			<td style="width:235px;">Goethe university</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Structure visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Numerical calculation software</td>
			<td style="width:235px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.mathworks.de/academia/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of atp synthase dimers in mitochondria by electron cryo-tomography

Elektron cryo tomografi gibi moleküler ayrıntılı olarak hücrelere, organel, zar veziküllerinin ya da virüsler gibi biyolojik örnekler, üç-boyutlu bir yapıya sahip görselleştirme yapısal biyolojide güçlü bir araçtır. Bunu elde etmek için, sulu bir örneği hızla bir yakın-yerli, dondurulmuş sulu halde de korur sıvı etan, içinde vitrifiye edildi. Elektron mikroskobu, tilt serisi 3D tomografi yeniden oluşturulmasını sağlayan sıvı azot sıcaklığında kaydedilir. Tomografik hacminin sinyal-gürültü oranı doğal düşüktür. Tanınabilir, yinelenen özellikleri, bireysel hacimler, kesip hizalanmış ve gürültüyü azaltmak için ortalama tarafından hangi subtomogram ortalamaya tarafından geliştirilmiş. Bu şekilde, 3 boyutlu elde edilebilir 2 nm ya da daha iyi bir çözünürlüğe sahip eşleştirir. 3D hacmine kullanılabilir yüksek çözünürlüklü yapıların bir uyum sonra kendi doğal ortamında protein kompleksleri atom modelleri üretiyor. Burada biz elektron cryo-tomograp kullanımı nasıl göstermekhy mitokondri büyük membran protein kompleksleri yerinde organizasyonu incelemek. Karmaşık rasgele sıraların her iki tarafında membran bölgeleri dağıtılır ise ATP sentez, iç membran krista derece eğimli uçları dışa boyunca dimerlerin sıralar halinde organize olduğunu bulmak. Subtomogram ortalama alma terimi ile krista zarı içinde mitokondriyal ATP sentetaz dimerinin bir yapı elde edilmiştir.

Mitokondri elektron cryo-tomografi açıkça (Şekil 2) organelinin 3D morfolojisini ortaya koymaktadır. Tomografik hacimde zarların manüel olarak bir mitokondride krista yapısını göstermektedir. Belirli bir protein bileşenleri eksikliği farklı maya nakavt soylarından mitokondri görüntüleme ile, krista morfolojisi bu proteinlerin etki değerlendirilebilir yoluyla elde. 3 ATP sentetaz alt-birimi E eksik maya kökü bir mitokondri göstermektedir. ATP sintaz kompleksinin bu bileşeni, mitokondriyal ATP sentaz dimerizasyonunun için gereklidir. Bu gövdeden mitokondri (Şekil 2), yabani tür mitokondri normal katmanlı krista yoktur ve bunun yerine, iç zar bölümlerine bir dizi içerir. Bu bölmeler, krista ya yoksun olan veya küçük balon şeklinde membran invajinasyonları (Şekil 3) içerir. Tomograms Bu durumda ATP sentaz dimerlerdeki iyi kontrast, geniş mitokondriyal protein kompleksleri ile, kolayca görülebilir (Şekil 4; Film 1). (; Film 2, Şekil 5) komplekslerinin yapıları subtomogram ortalamaya 2-3 nm çözünürlükte belirlenebilir. (; Film 3, Şekil 6), ortalama hacim zar içinde birbirlerine göre ve diğer protein kompleksleri bireysel komplekslerinin organizasyonu değerlendirmek amacıyla tomografisinde geri yerleştirilebilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> Elektron cryo-tomografisinin aşamalarını gösteren 1. Akış şeması Şekil. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> Yabanitip S. Cerevisiae&#39;den bir mitokondrinin Şekil 2. Morfoloji. Bir yabanitipte S. bir tomografik hacmi ile Orta dilim cerevisiae Mitokondri (solda) ve ilgili yüzey-render hacmi (sağ). Ancak, dış membranın segmente gri renkle gösterilir ve iç sınır hacimleri ve açık mavi zar krista edilir. Davies ve arkadaşları 8 uyarlanmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> Bir S 3. Mitokondri Şekil. Cerevisiae suşu için gerekli bir alt birimini eksikATP sentaz Dimerleştirme. Tomografik hacmi (solda) ve S bir mitokondrinin yüzey hale hacmi (sağ) eşlik aracılığıyla dilimleyin. ATPsentaz dimerizasyonundan için gerekli protein alt birimi E eksik cerevisiae suşu. Şekil 2 ile karşılaştırıldığında, mutant suşu olan mitokondri vahşi tipli mitokondri normal katmanlı krista yoksundur. Bunun yerine, herhangi bir Mitokondri ya da balon krista şeklindeki krista ya da birçok iç membran bölmeleri vardır. Böylece elektron cryo-tomografi delesyonlardır nedeniyle membran morfolojisi değişiklikleri vurgular. Davies ve arkadaşları 8 uyarlanmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figurmantar S. e 4. Mitokondri anserina. ipliksi mantar P. bir mitokondrinin tomografik hacmi (sol) ve (sağ) Ekteki yüzey render hacmi ile dilimleyin anserina. Bu tomografisinde, 10 nm&#39;lik bir partikül (sarı ok başları) sıraları, iç membran kristalarında derece eğimli membran sırtlar üzerinde yer alır (Film 1 e bakınız). Bu parçacıklar subtomogram ortalamaya ATPsentaz dimerler olarak tespit edilmiştir. Davies ve ark 9. Den <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> Mitokondriyal ATP sentaz Şekil 5. yapısı ve organizasyon. Side ve S&#39;den bir ATPsentaz dimerin elektron yoğunluğunu gösteren üstten görünümü c<html> erevisiae monte atom modelleri (solda) subtomogram ortalama alma ile belirlenmiştir. Satır (sağda) ATPsentaz dimerlerinin organizasyonunu gösteren mitokondriyal iç membran vezikül. Şekil ortalama sırasında hesaplanan koordinatları kullanarak, zar vesikül segmentli hacmi içine ATP sintaz dimerinin subtomogram ortalama konumlandırılmasıyla elde edilmiştir. Davies ve arkadaşları 8 uyarlanmıştır. Atom modelleri: F 1 / rotor-halkası [PDB: 2WPD] 39 (mavi ve mor); duyarlı kazandıran protein OSCP oligomycin [PDB: 2BO5] 40 (yeşil); periferik sapı fragmanı [PDB: 2CLY] N-terminal kalıntıları ile 1 [PDB: 2WSS] 2 (sarı ve kırmızı) (Film 2 bakınız). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Bir P. Şekil 6. İzole krista vezikül anserina Mitokondri. Dilimler P. krista vesikülün tomografik hacmi (sol) ve (sağ) Ekteki yüzey render birimdeki anserina. Zarından çıkıntı yapan protein yoğunlukları açık bir şekilde görülebilir. Subtomogram ortalamaya tanımlanan sarı ok uçları ile gösterilen yoğunlukları, ATPsentaz dimerlerdir. Yeşil ok uçları NADH dehidrojenaz gibi antikor etiketleme tarafından tespit yoğunlukları işaret (1 kompleksi; detayları 9 bakınız). Protein yoğunlukları bölümlendirilmesi (bakınız sıraların her iki tarafındaki zar bölgelerde yüksek kıvrımlı sırtlar boyunca krista sıraları oluşturarak (kırmızı ve sarı) ATP sintaz dimerleri ve NADH dehidrogenaz kompleksleri (yeşil) ile, kristalarında düzenlenmelerini göstermektedir Film 3). Davies ve ark 9&#39;dan.28 / 51228fig7highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. Bir P. Film 1. Elektron cryo-tomogram anserina Mitokondri. filmi ipliksi mantar P. bir mitokondri alınan tomografik hacmi ile art arda dilimler gösterir anserina. ATP sentaz satırlar sarı ok uçları ile gösterilir. Yüzey-render, bölümlenmiş hacmi 3D kristalarında yapısına göre ATP sentaz (sarı küreler) yerini gösterir. Dış zar, gri; iç sınır zar, saydam mavi; membranlar, opak mavi krista. Davies ve ark 9&#39;dan. Ayrıca Şekil 4 bakınız. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">Videoyu izlemek için burayı tıklayın.</a> S mitokondriyal ATP sentaz dimerinden Film 2. Subtomogram ortalama. Donatılmış atom modelleri ile cerevisiae&#39;de. Ortalama121 hacimler hesaplandı. Yoğunluk üç kontur düzeyde görüntülenir: 1s - örgü, 2s - açık gri ve 3s - koyu gri. Atom modelleri Chimera sıralı uygun rutin kullanılarak yoğunluğu içine monte edildi. Atom modelleri: F 1 / rotor-halkası [PDB: 2WPD] 39 (mavi ve mor); duyarlı kazandıran protein OSCP oligomycin [PDB: 2BO5] 40 (yeşil); periferik sapı fragmanı [PDB: 2CLY] N-terminal kalıntıları ile 1 [PDB: 2WSS]. 2 (sarı ve kırmızı) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">Videoyu izlemek için burayı tıklayın.</a> Davies ve arkadaşları 8 uyarlanmıştır. Ayrıca Şekil 5 bakınız. Bir P. Film 3. İzole kristalarında vezikül Mitokondri anserina. ardına dilimleri tomografik hacim ile parçalara ayrılmış yüzey işlenmiş hacim olarak takip etmektedir. Membranın çıkıntı yapan protein yoğunluklarıE açıkça görülebilir. Kırmızı ve sarı yoğunlukları ATPsentaz dimerlerdir. Yeşil yoğunlukları antikor etiketlemesi ile saptandığı haliyle NADH dehidrojenaz (karmaşık I) bileşikleridir. Davies ve ark 9&#39;dan. Ayrıca Şekil 6 bakınız. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">Videoyu izlemek için burayı tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography at JoVE.com

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

visualization-atp-synthase-dimers-mitochondria-electron-cryo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

29.6K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Biophysics.  Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar. 

Video: Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Biyoloji

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...