Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.

Etik açıklama: Alan örnekleme ve hayvan denekleri prosedürleri Nottingham Trent Üniversitesi&#39;nde Animal, Kır ve Çevre Bilimi (ARES) Okulu tarafından onaylanmıştır. Dışkı Örneklerinde 1. Koleksiyonu NOT: Dışkı örnekleri ve metanol tutarken eldiven giyilmelidir. Bir hayvan gibi de giyilmelidir bir laboratuvar önlüğü gibi zoonotik hastalık, koruyucu giysiler muzdarip olabileceğini güçlü bir şüphe varsa. <ol><li> dışkılama aşağıdaki (birkaç saat için dakika içinde) en kısa sürede dışkı örnekleri toplamak ve örnek bir torbaya koyun. yaklaşık 10 g toplam ağırlığa sahip bir defecated numunenin üç ila beş Alt-numûnelerin al. zaman ve toplama, bireysel kimlik tarihi ile çanta Etiket ve analize kadar -20 ° C&#39;de örnek dondurmak. </li><li> tüm örnekleri dondurmak, hatayı en aza indirmek için -20 ° C kadar çalışma tamamlandığında sonra tek bir toplu olarak analiz için bir araya örnekleri toplamak. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Dışkı Hormon Ekstraksiyon <ol><li> Oda sıcaklığında çözülmeye dışkı örnekleri bırakın. </li><li> Numuneler el ile kendi örnek torba içinde her numune karıştırılarak homojenize emin olun. </li><li> Her bir numune, ağırlığa tekne bir mikro 0.50 dışkı maddesi (g 0.003 ±) ağırlığında için daha sonra bir 8 ml bir cam şişeye dışkı aktarın. Her bir numune için yeni bir ağırlık teknesi kullanın ve her bir numune arasında% 30 metanol ile cımbız temizleyin. </li><li> 5% 90 ml metanol ile, dışkı maddesinin 0.5 g &#39;ını: su, ve oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıda O / N sallayın. </li><li> Ertesi sabah, örnek karıştırın ve daha sonra 600 g&#39;de 20 dakika boyunca santrifüj. </li><li> 37 ° C lik bir sıcaklığa ayarlanmış bir su banyosu içinde rafa 16 x 125 mm cam tüpe 2 ve yerine metanol fraksiyonu süzün. Bir çeker ocak içinde hava ile kuruyana kadar buharlaştırın. ekstraksiyon şişeyi yıkayın ve bertaraf için bir klinik atık torbasına kalan dışkı pelet yerleştirin. </li><li> % 100 1 ml metanol dışkı özü yeniden askıya ve 12 x 75 mm2 bir polipropilen tüpü içine transfer. Hemen analiz edilinceye kadar -20 ° C&#39;de kap saklayın. </li></ol> 3. Hormon Analizleri <ol><li> poliklonal kortikosteron CJM006 antiserum kullanarak bir enzim bağlantılı-immunoassay (EIA) ile analizi yürütmek. NOT:. İkinci ÇED (Kortizol R4866 antiserum test edilmiştir, fakat bu (Bölüm 4.1 bakınız) poliklonal kortikosteron CJM006 antiserum ve kortizol R4866 antiserum ve ilgili HRP en CJ Munro, California Üniversitesi tarafından sağlanan biyokimyasal doğrulama adımı gerçekleştirmek için başarısız, Davis, CA </li><li> 1 ile antiserumun seyreltilir: kaplama tamponu (0.05 M NaHCO3, pH 9.6) &#39;de 15,000 tekrar pipet ve 50 ul bir pipet kullanarak, / göz 50 ul, 96 oyuklu bir mikrotitre plakası yükleyin. Bir plaka kapatıcı ile örtün ve plaka, 4 ° C&#39;de O / N inkübe edin. (N, spesifik olmayan bağlayıcı gözenekler temsil kaplanmamış iki kuyu boşSB). </li><li> Kullanımdan hemen önce, bir otomatik mikrotitre plaka yıkayıcısı (0.15 M NaCl,% 0.05 Tween 20 yıkama çözeltisi) kullanılarak, mikro ölçüm levhaları, beş kez yıkayın. </li><li> 1000 ug / - NSB en için oyuk başına 50 ul ve &#39;sıfır&#39; kuyu [EIA tampon maddesi (0.1 M napo 4, 0.149 M NaCl,% 0.1 sığır serum albümini, pH 7.0) içinde, sadece] standartları (kortikosteron, 3.9 plakaları yük kuyu) veya uygun 01:20 ÇED tamponu seyreltilmiş dışkı özü numuneleri (,) bölüm 4.1&#39;e bakınız. Standartlar ve sıfır sırasıyla üç kez ve dört nüsha olarak çalıştırılmalıdır. Sulandırılmış dışkı özü örnekleri ve NSB en nüsha halinde çalıştırılmalıdır. </li><li> 70.000: 50 ul / oyuk ile 1 EIA tamponu içinde seyreltilmiş etiket yaban turpu peroksidaz bağı ᵻ hemen takip etmektedir. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca karanlıkta mikrotitre inkübe edin. </li><li> 100 ul ile karanlıkta, oda sıcaklığında plakalar yıkama çözeltisi ile 5 kez mikrotitre plakalar, yıkama ve inkübe / welRT substrat [0.4 mM 2,2&#39;-azino-di- (3-etilbenztiyazolin-sülfonik asit) diamonyum tuzu, 1.6 mM H2O 2, 0.05 M sitrat, pH 4.0] l. kullanımdan hemen önce alt-tabakanın hazırlanması. </li><li> mikrotitre plakaları okumak için 405 nm bir dalga boyunda bir spectrophometer kullanın. Sıfır kuyu optik yoğunluk ile 1.0 0.8 ulaştığında levha kuluçka tamamlandıktan olarak kabul edilir. </li><li> Tekrarlanabilirlik sağlamak için, yaklaşık% 30 (EIA standardı),% 50 (biyolojik numune örneğin, yerli at dışkı ekstresinin havuz) ve% 70 (EIA standardı) bağlamak için ÇED tamponunda seyreltilmiş kontrolleri [ÇED standartları ya da biyolojik bir örnek kullanınız ] sırasıyla &lt;% 10 değişim ve &lt;% 15 oranında bir içi ve inter-analiz katsayılarını göstermek için. </li></ol> 4. Enzim Linked-immunoassay: Çalışma Tür ve Sex Doğrulama <ol><li> Biyokimyasal Doğrulama (Paralellik) <ol><li> ÇED tampon kullanarak, toplanmış fekal ekstra bir seri seyreltme gerçekleştirmekct, ideal olarak birkaç bireylerden şüphelenilen yüksek ve düşük hormon konsantrasyonu örneklerinden alınan (aralık: temiz, 1: 8192: 2 ile 1) ve 3. bölümde açıklandığı gibi ÇED çalıştırın. NOT: Dışkı özler seri seyreltme standart eğri ve lineer regresyon sonuçlarına bir deplasman eğrisi paralel verim BIR paralellik sağlanmıştır kabul edilir R2&gt; 0.90, bir yamaç&gt; 0.50 ve p &lt;0.05 göstermektedir. Standart eğri üzerinde% 50 civarında bağlayan seri seyreltilmiş dışkı özü tüm dışkı özler çalıştırmak için ideal bir seyreltme düşünülmelidir (örneğin, 1:20). lineer regresyon sonuçları R2&gt; 0.90 ve p &lt;0.05 göstermek zaman tahlil üzerinde düşünülen hiçbir girişim yoktur. </li></ol></li><li> Biyokimyasal Doğrulama (Girişim) <ol><li> % 50 sulandırılmış uygun toplanmış seyreltilmiş dışkı ekstresi [200 ul paralleli tarafından belirlenen bağlanma ile (3.9 1000 ng / çukur kortikosteron sıfır) seri olarak seyreltilmiş standartların 200 ul Spikesm (1:20)] ve ÇED analiz arsa ardından bölüm 3&#39;teki gibi ÇED üzerinde çalışan gözlenen konsantrasyon eksi beklenen konsantrasyonuna karşı arka plan (sıfır numunenin konsantrasyonu). NOT: standartlara seyreltilmiş toplanmış fekal ekstresinin eklenmesi önemli ölçüde miktarı beklenen ve lineer regresyon sonuçlarını değiştirmez vermezse R 2&gt; 0.90, 1.0 ve p &lt;0.05 yakın bir eğim verir. EIA ile hiçbir girişim elde edilmiştir. </li></ol></li><li> Biyolojik Doğrulama: NOT: Seçilen ÇED ilgi hormon biyolojik ilgili değişiklikleri ölçmek yeteneğine sahip bir gösteri [örneğin, bir farmakolojik aşağıdaki glukokortikoid konsantrasyonlarda artış ya da biyolojik bir meydan okuma (ACTH genellikle lisanslı bir işlemdir) (örneğin, psikolojik ve / veya çevre; bir fırsatçı düzensiz olay olması daha muhtemeldir)]. <ol><li> Seçin, özü ve glukokortikoid metabolit konsantrasyonları için dışkı örnekleri analizönce ve zorlu bir olaydan sonra 3 - bölümlerde 1 detaylı süreci kullanarak. NOT: zorlu bir olay özgü türler olacaktır. Bir örnek yöntemi yerli at için aşağıda verilmiştir. Atlar için zorlu olaylarla dolu örnekler yönetimi 9 ve hayvancılık prosedürleri 16 kullanımı dahil, daha önce yayınlanmıştır. zorlu olayın ardından glukokortikoid metabolit konsantrasyonlarında anlamlı bir artış gözlendi ve istatistiksel analiz kullanılarak onaylanmalıdır. Bu, tekrarlı ölçümlerde, örnek tarih ve bireysel etkisini uygun olan yerlerde içermelidir. Biyolojik doğrulama sonra elde sayılır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Morm&#232;de, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+function+as+a+tool+to+evaluate+animal+welfare.">Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare.</a> Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).</li><li>Lane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+non-invasive+glucocorticoid+measures+be+used+as+reliable+indicators+of+stress+in+animals?.">Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals?.</a> Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).</li><li>Morgan, K. N., Tromborg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+of+stress+in+captivity.">Sources of stress in captivity.</a> Applied Animal Behaviour Science. 102, 262-302 (2007).</li><li>Nelson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , 670-671 (2005).</li><li>Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Do+Glucocorticoids+Influence+Stress+Responses?+Integrating+Permissive,+Suppressive,+Stimulatory,+and+Preparative+Actions.">How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions.</a> Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).</li><li>Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+steroids+in+the+human+gut.">Degradation of steroids in the human gut.</a> Journal of Lipid Research. 24, 675-700 (1983).</li><li>Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+monitoring+of+adrenocortical+activity+in+carnivores+by+fecal+glucocorticoid+analysis.">Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis.</a> General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).</li><li>Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain+causes+increased+concentrations+of+glucocorticoid+metabolites+in+horse+faeces.">Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces.</a> Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).</li><li>Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domesticated+horses+differ+in+their+behavioural+and+physiological+responses+to+isolated+and+group+housing.">Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing.</a> Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).</li><li>Wielebnowski, N., Watters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+fecal+endocrine+monitoring+to+conservation+and+behaviour+studies+of+wild+mammals:+important+considerations+and+preliminary+tests.">Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests.</a> Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).</li><li>Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fecal+steroids:+guidelines+for+a+practical+application.">Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).</li><li>Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+liquid+and+solid+digesta+retention+in+ruminants,+equines+and+rabbits+given+timothy+hay.">The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay.</a> British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).</li><li>Goymann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+monitoring+of+hormones+in+bird+droppings:+biological+validations,+sampling,+extraction,+sex+differences+and+the+influence+of+diet+on+hormone+metabolite+levels.">Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).</li><li>Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sex+and+time+of+day+on+metabolism+and+excretion+of+corticosterone+in+urine+and+feces+of+mice.">Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice.</a> General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).</li><li>Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+corticosterone+metabolites+in+chicken+droppings.">Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings.</a> British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).</li><li>Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+the+aversive+nature+of+an+animal+management+procedure+using+behavioural+and+physiological+measures.">An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures.</a> Physiology &amp; Behaviour. 118, 32-39 (2013).</li><li>Goymann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+non-invasive+hormone+research+in+uncontrolled,+natural+environments:+the+problem+with+sex,+diet,+metabolic+rate+and+the+individual.">On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual.</a> Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).</li><li>Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+stress+in+wildlife:+techniques+for+quantifying+glucocorticoids.">Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids.</a> Oecologia. 166, 614-619 (2011).</li><li>Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+versatile+enzyme+immunoassay+for+non-invasive+assessment+of+glucocorticoid+metabolites+in+a+diversity+of+taxonomic+species.">Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species.</a> General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).</li><li>Touma, C., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fecal+glucocorticoid+metabolites+in+mammals+and+birds:+the+importance+of+validation.">Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).</li><li>Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fecal+glucocorticoid+metabolite+measures+in+conservation+biology+research:+considerations+for+application+and+interpretation.">Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation.</a> General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dışkı kortikosteron analizi atlarda adrenal aktivitenin uzun süreli desen değerlendirmek için bir araç sağlar. Yöntemin non-invaziv doğa tükürük ve plazma analizi 9 olmak üzere adrenal aktivitesini değerlendirmek için kullanılan diğer örnekleme yöntemleri karıştırıcı etkilerini ortadan kaldırmaktadır. Buna ek olarak teknik ücretsiz değişen atları okuyan eğer net bir non-invaziv bir avantaja sahiptir. Bu yöntemle ve uygun kullanımıyla ilgili görüşmek üzere çeşitli kilit nokta vardır. protokolde kritik bir adım soru ve uygun antikor seçiminde türler için tahlilin doğrulama olduğunu. Kullanılan antikor yapısal olarak benzer ancak işlevsel olarak farklı glukokortikoid metabolitleri ile çapraz reaksiyona Eğer bu sonuçlar 17 bulandırabilir olabilir. Bu nedenle, tahliller hormon metabolitleri dikkatli fizyolojik veya biyolojik doğrulama gerektiren ölçmek için, detayları literatürde 18,19 ve protokol descr içinde varIBED. Dışkı örneğinin durumu hem hormonal metabolit düzeylerini 20 etkilediği gösterilmiştir numune ve çevresel maruziyet tazeliği de dahil olmak üzere dikkate alınması gerekmektedir. Aşırı yağmur veya güneş maruziyeti nedeniyle bakteriyel metabolleştirme 21 artışa neden olduğu bilinen ya da metabolit konsantrasyonları azalmaktadır. tazelik değişen derecelerde örnekleri toplamak isteyen araştırmacılar çevresel etkisine ek olarak numune bütünlüğü zamanın etkilerini araştırmak gerekir. Bu iklimsel değişkenlere tazelik ve maruz kalma değişen derecelerde ile küçük bir deney kurma ve periyodik olarak erkek ve kadın bireylerin dışkı örnekleme yoluyla önce çalışmaya yapılabilir. Çoğu araştırma senaryolarda, bilinen kişilerden örnekler yararlı ya da 10 gerekli olacaktır. yerli atlar bu id yutulur gıda işaretlerini defekasyon için bir grup izleme veya kullanılarak elde edilebilirDaha büyük gruplar 12 bireylerden dışkı entify. ücretsiz değişen türlerde bu bireysel izleme gerekecektir olarak zaman alıcı ispat edebilir. glukokortikoid analizi yöntemi seçerken dışkı kortikosteron testinin sonuçları oldukça zaman ölçü bir noktaya daha zamanla bir havuza örnek temsil o kabul edilmelidir; Bu nedenle, verilerin daha az bir dalgalanma olacaktır. Araştırmacı bir durumun uzun vadeli etkileri ile ilgilenen varsa, hayvancılık tekniği veya yönetim uygulaması daha sonra dışkı analizi uygun bir teknik sunmaktadır. Hormon konsantrasyon kısa vadeli desen değerlendirilmesi gerekiyorsa o zaman plazma veya tükürük analizi tercih edilen yöntem olacaktır.

yöntem tarif amaçları adrenal aktivite non-invaziv bir değerlendirme sağlamak amacıyla at dışkısı kortikosteron konsantrasyonları analiz etmek. hipotalamus-hipofiz-adrenal (HPA) eksen aktivitesinin ölçülmesi esir ve yerli türler hem potansiyel caydırıcı durumlara tepki incelemek için kabul edilmiş bir yaklaşımdır. Referans tekniği ve en yaygın olarak kullanılan yöntem, ancak bu tür dışkı analizi gibi alternatif yöntemler bilgilerini kadar tür izleme olanağı kan örneği kendisinin neden olduğu stres üstesinden gelmek ve sağlamak amacıyla geliştirilmiştir kan plazması 1 &#39;in kullanımı olup. caydırıcı bir durum sırasında, fizyolojik homeostasis bozulur. ön hipofiz bezi üzerinde hareket eder ve adrenokortikotropik hormon (ACTH) salınımını uyarır salgılatıcı hormon (CRH) kortikotropin beyin sürümlerde hipotalamus. ACTH kan dolaşımına girer ve türünden salgılaması için adrenal korteksi uyarırs, belirli glukokortikoidler (GC). Glukokortikoidler yakından oldukça tutarlı nedenle genellikle diğer stres bağlantılı hormonların üzerinde 2 tercih ölçülen tüm enerji artan devletler üretilen daha stresli olaylarla bağlantılıdır. Glukokortikoidler atların birçok adaptif etkileri sorumludur. Enerji hızlı yağlı asitler ve glukoz şeklinde vücuda depolama sitelerinden mobilize, oksijen alımı sensör fonksiyonu 3 geliştirilmiş ve kan akımı hareket 4 için gerekli olmayan alanlara azaltılır, artar. Yanı sıra bir başa çıkma mekanizması olarak hareket olarak, Glukokortikoid stres kaynaklı artış da sonraki stresör 5 için hayvan hazırlamak için yardımcı olabilir. Hormon plazmadaki düzeyleri ve tükürük değerlendirilmesi gaita önlemler hormon metabolik son ürünü metabolitleri ölçmek, ancak gerçek dolaşan hormonu ölçüm içerir. Sirkülasyon steroid l katabolize edilenonlar bağırsak parça 6 içinde bakteri florasının enzimatik faaliyetleri kolaylaştırdı ileri değişikliklere uğrarlar safra için atılımı önce Iver. Bu nedenle, kan glukokortikoid yönelik bağışıklık dışkı glukokortikoid metabolitlerin 7 analizi için uygun olmayabilir. Dışkı toplanması, at için bir rahatsızlık ile gerçekleştirilebilir gibi, kortikosteron için dışkı analizi, koşullar, bir dizi HPA etkinliğini izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Atların dışkı içinde yükseltilmiş kortikosteron ameliyat sonrası tedavisi için veteriner hekimliğinde 8 boyunca ve kısıtlayıcı yuva 9 da dahil olmak üzere, potansiyel olarak caydırıcı durumlara cevap olarak bildirilmiştir. Fekal örnekleme zamanla toplanmış glukokortikoid düzeyi ziyade uzun vadeli, kronik veya mevsimsel desenleri 10 izlenmesi için uygun hale plazma ve tükürük tarafından sunulan zaman örnekleme noktasını yansıtır. Nedeniyle non-invaziv içinYöntemin niteliği, numuneler yakalama veya bağlama 11 gerek kalmadan bir birey için, art arda toplanabilir. Bir numune alma protokolü planlama Ancak, türe özgü bağırsaktan geçiş süresi dikkate alınmalıdır. Atlarda, bağırsaktan geçiş süresi bu • durumda, böbrek üstü tepkisi ve daha sonra kortikosteron metabolitleri HPA ekseninin ilk aktivasyon bir gün sonra dışkı ile saptanabilir yaklaşık 18 saat 12&#39;dir. Non-invaziv immunoassay teknikleri kullanılarak zaman araştırılan türler için dikkatli bir doğrulama 13 esastır. Buna ek olarak, hormon metabolit boşaltım cinsiyet farkları nedeniyle metabolizma hızı ve fareler 14. ve tavuk 15 de dahil olmak üzere çeşitli türlerin atılır kortikosteron metaboliti türü farklılıkları muhtemelen bildirilmiştir. th ayrıntılı gibi deney erkek ve dişi, evcil atlar uygulamalarında kullanmak için geçerli olan bu yöntemin bir parçası olarak, bu nedenle önemlie protokolü. Cinsiyetler arasındaki hormon metabolizmasında Bu fark ele alınması ve tahlil doğrulama parçası olarak dahil nadiren edilir henüz veri kalitesi için sonuçları vardır. Bu non-invaziv yöntem yerli atlar adrenal aktivitenin uzun süreli değerlendirmesini sağlar. protokol ayrıntıları testin geçerliliği ve tahlil tekniği kendisi hem de.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Corticosterone antibody &#38; HRP kit</td>
			<td>Coralie Munro - UC Davis</td>
			<td>NA</td>
			<td>No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortisol antibody &#38; HRP kit</td>
			<td>Coralie Munro - UC Davis</td>
			<td>NA</td>
			<td>No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone synthetic standard hormone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>50-23-7</td>
			<td>Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortisol synthetic standard hormone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>15087-01-1</td>
			<td>Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Irritant. Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate Anhydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>77-92-9</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>30931-67-0</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer capsules - pH 4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332732B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer capsules - pH 7</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332742D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer capsules - pH 10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>332762H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>435570</td>
			<td>Irritant. Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BFS-525-010A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air compressor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer +printer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fridge-freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flammable liquid storagecabinet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>649-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume cupboard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot-plate stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>640-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate washer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research&#174; pipettes - multipack option 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette - 1000ul</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette - 200ul</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette - 20ul</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Progen Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Hilsonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purification system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal glucocorticoid analysis: non-invasive adrenal monitoring in equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Yurtiçi atları (n = 16, 8 kısrak, 8 geldings) 15 yıl (± 3) yaş ortalaması ile cinsiyete ve sosyal izolasyon (n = 4 at / tedavi) artan seviyeleri ile dört konut tasarımları tabi göre gruplandırıldı. yakından doğal yaşam simülasyonu, bir sürü ortamında yaşayan Konut 1. katılan atlar. kapalı ahırda çiftler yaşayan Konut 2 dahil atlar. Konut 3 tutulan atlar ahırlarda ancak diğer atlar ve atlar konut 4 dahil toplam izolasyon görsel temas yalnız ev sahipliği yapmıştır. her bir tedaviye maruz kalma, beş günlük bir süre için rastgele bir blok tasarımı oldu. Aşağıda bu atlar sonraki konut tedaviye maruz kalmadan önce iki gün boyunca kendi deney gruplarında çimenlik içine çevrildi. Dışkı örnekleri günlerde 1, 2 günde bir kez toplandı ve 3 n = 8 atları her konut tedavisi (içinde harcananHer tedavi içinde n = 2 atlar). Dışkı numuneleri mümkün olduğu ve dışkılama sonrası 1 saat içinde en kısa sürede toplandı. At konut tedavisine başlanan gün sonra bir ilk örnek en az 20 saat toplandı Bütün numuneler ahır anlam ilk tam gününde 1.200 saat sonra toplandı. Günde bir, iki ve üç (konut tasarım başına 24 numune total) Örnekler nedeniyle digesta 12 geçiş oranı geçmiş 18 saat yansıtıcı dışkı kortikosteron seviyeleri açısından değerlendirildi. aynı birey atlar çalışma boyunca dışkı analizi için kullanılmıştır. Ek ölçülen parametreler yerli atlar için zorlu olayların yayınlanan eser 9 Alternatif örneklere bakın da dahil olmak üzere, bu biyolojik meydan dolu ayrıntılar için de literatürde 16 bulunabilir. Bu bölümde, her iki cor için bir biyokimyasal doğrulama (paralellik) örnek sonuçlar sağlarerkek ve kadın iç atı dışkısı ticosterone ve kortizol. Bu bölümde ayrıca dışkı çıkarma ve ÇED analizinden elde edilen temsili verileri sağlar. Sonuçlar at davranış ve fizyolojisi 9 üzerine, konut tasarımına yol açtığı sosyal izolasyon etkisini araştırdık daha büyük bir çalışmanın parçası olarak elde edilmiştir. Biyokimyasal doğrulama sonuçları kortikosteron EIA, R2 = 0,9545, F [Şekil 1A erkek örnek% = bağlayıcı 25,349 + 0,729 (standart% bağlanma) adrenal aktiviteyi ölçmek için uygun olduğunu gösterdi (1, 7) daha = 146,710, p az 0.001); Şekil 1B kadın numune% bağlayıcı = 29,989 + 0,7198 (standart%) R2 = 0,95594, F (1 bağlayıcı, 7) = 151,865, 0.001 az] ancak kortizol ÇED [Şekil 1C erkek örnek% bağlanma p = 79,089 + 0,0629 R2 = 0.175, K, (standart% bağlanma) (1, 7) = 1.485, p = 0.262), Şekil 1B dişi örneği% Bağlanma = 81,652 + 0,0772 (standart% bağlanma), R2 = 0.257, F (1, 7) = 2,422, p = 0.164]. kortikosteron ÇED kortikosteron üzerine kortizol ÇED ve parazit testi aksine paralellik gösterdiği gibi ÇED beklenen miktarını değiştirmemiştir kortikosteron standartlarına seyreltilmiş fekal ekstresinin eklenmesi gibi, matris müdahale bulgusuna rastlanmadı (erkek: Gözlenen = + 1.017 1.302 (Beklenen) R2 = 0,9972, F1, 7 = 1287,128, p &lt;0.001; kadın: Gözlenen = (Beklenen) 0,3169 + 1,0931 R2 = 0,9972, F1, 7 = 2432,65, p &lt;0.001). ÇED sonuçları erkek atları (M = 37.7, SS = 14.1) ve dişi atlar arasında kortikosteron düzeylerinde anlamlı bir fark olmadığını ortaya koymuştur (M = 33.8, SD = 12.7; t (70) = 1.23, p = 0.22) . yalıtım düzeyi arttıkça dışkı kortikosteron düzeyi arttı. İzole atları (konut tasarımı 4) anlamlı derecede yüksek vardıer dışkı kortikosteron düzeyleri diğer konut tasarımları (p ≤0.02 Wilks Lambda = 0.58, F (3, 18) = 4.29, p = 0.01, çok değişkenli kısmi eta kare = 0.42) ile karşılaştırıldığında. diğer konut tedavilere kıyasla fekal kortikosteron düzeyi en izole konut sırasında her üç numune gün tüm atlar için yüksek oldu. Her bir gün için, her yuva tasarımı için ortalama dışkı kortikosteron konsantrasyonları, Tablo 1 &#39;de sunulmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53479/53479fig1.jpg" /> Kadın ve Erkek Atlar için Kortikosteron ve kortizol Enzyme Linked-Immunoassay Şekil 1. Biyokimyasal Doğrulama (paralellik). Bu rakam üzerinde kortikosteron ve kortizol standart eğrisi artan konsantrasyonlarda karşı kadın ve erkek iç atı dışkı özler seri seyreltilmiş havuzların bağlayıcı yüzde detayları ÇED. Sonuçlar göstermektedirkortikosteron (A, erkek, B, bayan) ve kortizol ÇED (C, erkek; D, dişi). kortikosteron EIA standart eğri ile başarılı bir deplasman eğrisi paralel vermiştir <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53479/53479fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table><tbody><tr><td rowspan="3"></td><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> HER KONUT TEDAVİSİNDE ORTALAMA (± SD) FEKAL kortikosteron (ng / g) </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> KONUT TEDAVİSİ </td><td> 1.gün </td><td> 2. gün </td><td> gün 3 </td><td> GENEL </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 31,73 ± 10.2 </td><td> 32,18 ± 8,0 </td><td> 29.22 ± 5.9 </td><td> 31.05 ± 7.8 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32.75 ± 10.0 </td><td> 33.66 ± 12.9 </td><td> 34,67 ± 9,3 </td><td> 33,69 ± 10.3 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 35.06 ± 14.6 </td><td> 35.14 ± 15.9 </td><td> 33.13 ± 12.5 </td><td> 34.44 ± 13.6 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td><td> * </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 38.16 ± 17.8 </td><td> 42.00 ± 16.7 </td><td> 41,52 ± 17.6 </td><td> 40,56 ± 16.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Ortalama her Konut Tedavisinde tüm Üç Gün Gün One, İki ve Üç ve Ortalama Fekal kortikosteron (ng / g) Her Konut Tedavisi (Genel). Bu tablo gösterileri için Fekal kortikosteron (ng / g) (± SD) dışkı kortikosteron (ng / g) için ortalama değerler günde bir, iki, üç boyunca muhafaza işlemin her biri için, standart sapma ±. Atlar konut girdikten sonra numuneler en az 20 saat toplanmıştır. Ayrıca, ortalama dışkı kortikosteron (ng / g) her bir muhafaza tedavisinde üç gün boyunca (genel) standart sapma ± gösterir. dışkı kortikosteron concentratiyon izole konut tasarımı sırasında (*) anlamlı olarak daha yüksekti. Tüm gün boyunca dışkı kortikosteron en düşük konsantrasyon grubu yerleştirilmiş tedavi (tedavi 1) tespit edildi. Yarnell ark uyarlanmıştır. (2015), Fizyoloji ve Davranış Journal izni ile.

Watch this Scientific Journal Video about Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids at JoVE.com

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

fecal-glucocorticoid-analysis-non-invasive-adrenal-monitoring

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K Görüntüleme.  Nottingham Trent University. Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Video: Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This protocol illustrates the method used to dissect the adrenals and then isolate the medullary region by stripping away the adrenal cortex.  The digestion of the medulla into single chromaffin cells is then demonstrated.

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting. This protocol illustrates the method used to dissect the adrenals and then isolate the medullary region by stripping away the adrenal cortex. The digestion of the medulla into single chromaffin cells is then demonstrated.

Fare Adrenal Kromafin Hücre İzolasyonu

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This ...

Biyoloji

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Demir Oksit hESC ve hMSCs Etiketleme MR Görüntüleme in vivo Takip Non-Invasive Nanopartiküller

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Sinkrotron-X-ray tomografi Sub-mikron Çözünürlük ile Non-invaziv 3D Görselleştirme

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

Havayolu Direnci Ölçümleri ve Fare Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı Örnekleme için, geri dönüşümlü, Non-invaziv Yöntemi

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Bir Zebra balığı Larva Lusıferaz Muhabir Sistemi ile glukokortikoid Signaling&#39;den için bir Kimyasal Tarama Prosedürü

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Who is Who? Non-invasive Methods to Individually Sex and Mark Altricial Chicks

Many experiments require early determination of offspring's sex as well as early marking of newborns for individual recognition. According to animal welfare guidelines, non-invasive techniques should be preferred whenever applicable. In our group, we work on different species of song birds in the lab and in the field, and we successfully apply non-invasive methods to sex and individually mark chicks. This paper presents a comprehensive non-invasive tool-box. Sexing birds prior to the expression of secondary sexual traits requires the collection of DNA-bearing material for PCR. We established a quick and easy method to sex birds of any age (post hatching) by extracting DNA from buccal swabs. Results can be obtained within 3 hours. For individual marking chick's down feathers are trimmed in specific patterns allowing fast identification within the hatching order. This set of methods is easily applicable in a standard equipped lab and especially suitable for working in the field as no special equipment is required for sampling and storage. Handling of chicks is minimized and marking and sexing techniques are non-invasive thereby supporting the RRR-principle of animal welfare guidelines.

This protocol provides a convenient set of methods, which enables extremely fast, easy, non-invasive, reliable and low-cost, molecular sex determination of birds and their non-invasive, quick, safe and easily recognizable marking shortly after hatching. Only limited handling of chicks is required. This convenient toolbox of methods complies entirely with the RRR-guidelines.

Kim kimdir? Non-invaziv yöntemler Bireysel Seks ve Mark altricial Civcivler

Many experiments require early determination of offspring's sex as well as early marking of newborns for individual recognition. According to animal ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL kolesterol alımını tahlil canlı hücre analizi ile hücre Imaging kullanarak sistem durumu izleme

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...