İnce Endometriyumun Fare Modelinin Oluşturulması

Bu makale, fare rahmine 1-3 dakika içinde %95 etanol enjekte ederek çok düşük mortalite oranı ve minimal intrauterin adezyonlara sahip güvenilir ve tekrarlanabilir bir ince endometriyum üretmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır.

İnce endometriyum (TE), infertilitenin kritik bir nedeni olarak yaygın olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, TE'nin patogenezi belirsizliğini korumaktadır ve tatmin edici tedavi seçeneklerine hala acilen ihtiyaç duyulmaktadır. TE'nin çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir, ancak abdominal cerrahi ve% 95 etanol enjeksiyonunu içeren fare modeli, yüksek mortalite oranı ve doğru şekilde yapılmadığı takdirde intrauterin yapışma riski nedeniyle zorlu bir zorluk teşkil etmektedir. Burada, fare uterusuna değişen infüzyon süreleri ile %95 etanol enjekte ederek çok düşük mortalite oranı ve minimal intrauterin yapışıklıklar ile güvenilir ve tekrarlanabilir TE üreten ayrıntılı bir protokol tarif ediyoruz. Sonuçlar, tüm farelerin, endometriyal kalınlıkta ve bez sayısında tipik bir azalmanın yanı sıra aşırı endometriyal fibroz ile karakterize edilen 1-3 dakika arasında değişen infüzyon süreleri ile başarılı bir şekilde TE'yi geliştirdiğini gösterdi. Bu bulgular, bu fare modelinin ince endometriyum çalışmak için uygun olduğunu ve gelecekteki TE tedavilerini geliştirmek için bir platform olarak hizmet edebileceğini göstermektedir.

İnce endometriyum (TE), obstetrik ve jinekolojide sıklıkla doğurganlık çağındaki kadınları etkileyen ciddi bir durumdur. TE, endometriyum kalınlığı ultrason taramasında 7 mm'den az ölçüldüğünde, normal bir uterus boşluğu ile birlikte teşhis edilir ve gebelik başarısızlığı ile yakından ilişkilidir ^1,2. İn vitro fertilizasyon (IVF) tedavisi gören kadınların yaklaşık %1,5-9,1'inin TE yaşayacağı tahmin edilmektedir ve bu da üreme tıbbında büyüyen bir zorluk haline gelmektedir ^3,4,5. TE'nin en sık nedenleri arasında, intrauterin adezyonların (IUA) ve küretajın cerrahi olarak ayrılmasını takiben yanlış endometrium onarımı yer alır ve buna sıklıkla kan damarı dağılımında bozulma ve seyrek bezler eşlik eder ^6,7,8. Bugüne kadar, TE'nin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. TE hastalarında endometriyumun iyileşmesi zaman alıcıdır, ancak östrojen tedavisi ve düşük doz aspirin tedavisi potansiyel müdahaleler olarak araştırılmıştır⁹. Bu nedenle, TE patogenezinin derinlemesine incelenmesi, bu durumun zorluklarını ele almak için en doğrudan yaklaşımdır. Bununla birlikte, TE'nin patogenezi üzerine yapılan çalışmalar hayvan modellerine dayanmaktadır ve bu da uygun bir model seçimini çok önemli hale getirmektedir.

İnce endometrium (TE) ile ilgili histopatolojik çalışmaların çoğu, epitel hücrelerinin ve makrofajların proliferasyonunda bozulma, over steroid hormon reseptörlerinin ekspresyonunda azalma, ekstraselüler matriksin aşırı birikimi ve hücresel yaşlanmanın TE ^6,9,10'un en önemli patolojik özellikleri olduğunu göstermiştir. Şu anda, ^11,12,13, iskemi¹⁴, termal yaralanma¹⁵ ve kimyasal yaralanma 16,17,18,19 ile indüklenen modeller de dahil olmak üzere TE'yi taklit etmek için çeşitli sıçan modelleri geliştirilmiştir. Bir sıçan modeli, endometriyumun bir iğne veya kateter ile çizilmesiyle indüklenir, bu da genellikle TE 11,12,20,21,22 yerine intrauterin adezyonlar (IUA) ile sonuçlanır. Sıçanlarda iskemiye bağlı bir TE modeli de bildirilmiştir, burada endometriyal iskemi bilateral uterin arter ligasyonu yapılarak elde edilir ve bu da endometriyal kalınlığın azalmasına neden olur. Bununla birlikte, bu yöntem zaman alıcıdır, üç ay gerektirir ve araştırma için yaygın olarak kullanılmamaktadır¹⁴. Termal yaralanmanın neden olduğu modelde, 85 ° C'de önceden ısıtılmış suyu uterus boynuzunun bir tarafına iki tarafın birleşmesi yoluyla demlemek için bir suni tohumlama tüpü kullanılır, bu da onu diğer yöntemlerden daha karmaşık hale getirir¹⁵. Kimyasal kaynaklı model, tüm endometriyuma zarar vermek için açıkta kalan uterus boynuzuna% 95 etanol enjekte etmeyi içerir. Bu model, TE'deki patolojik mekanizmaları ve tedavileri incelemek için düşük maliyetli ve kısa bir deneysel sürenin avantajlarını sunar, ancak esas olarak farelerden ziyade sıçanlarda kullanılır 16,17,23. Çeşitli hayvan modelleri, özellikle sıçan modelleri mevcut olsa da, her birinin sınırlamaları vardır. TE'nin yalnızca belirli yönlerini simüle edebilirler ve az sayıda fare modeli, TE'nin hastalık özelliklerini yakından taklit ederken, aynı zamanda araştırma için uygun ve çok yönlüdür.

Bu bağlamda, modifiye edilmiş bir yöntem²⁴ ile zaman gradyanı yaklaşımı kullanarak uterus boşluğuna %95 etanol infüze ederek yeni bir ince endometriyum (TE) fare modeli geliştirdik (Şekil 1). Sonuçlar, infüzyon süresi 1-3 dakika arasında değiştiğinde, tüm farelerin, azalmış endometriyal kalınlık, bez azalması ve artmış endometriyal fibroz gibi tipik özellikler göstererek, başarılı bir şekilde TE geliştirdiğini gösterdi. Bu bulgular, fare modelimizin TE'yi incelemek için uygun bir araç olduğunu ve gelecekteki TE tedavilerini geliştirmek için bir platform olarak hizmet edebileceğini göstermektedir.

Bu çalışma, tüm hayvan deneylerinin yapıldığı Shenzhen Zhongshan Kadın Hastalıkları ve Doğum Hastanesi (eski adıyla Shenzhen Zhongshan Üroloji Hastanesi) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada dişi C57BL / 6 fareler (yaş 6-8 hafta, ağırlık 18-20 g) kullanıldı. Tüm hayvanlar, aynı odada belirli bir patojen içermeyen (SPF) ortamda barındırıldı ve deneylerden önce bir hafta boyunca, 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü altında (22 ± 1) ° C'de spesifik patojenler içermeyen bir odada iklimlendirildi. Onlara yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlandı. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Kızgınlığın tanımlanması

NOT: Farelerde kızgınlık fazı, insanlarda geç luteal faz ile karşılaştırılabilir ve şu anda nispeten kalın bir endometriyal astar vardır. Model indüksiyonu için kızgınlıkta farelerin seçilmesi, nispeten tutarlı bir fizyolojik durumda olmalarını sağlar. Ek olarak, endometriyal incelmenin sonuçları, endometriyal kalınlık nispeten kalın olduğunda daha belirgindir. Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için daha önce yayınlanmış raporlara^{bakın 25,26}.

1. Bir pipet kullanarak 20 μL salin hazırlayın. Farenin kulaklarının her iki tarafını kavrayarak ve farenin kuyruğunu sabitleyerek, pipetin ucunu vajinal deliğe yaklaşık 2 mm derinliğe kadar nazikçe sokun. Vajinaya 20 μL salin damlatın ve 5 döngü boyunca nazikçe yıkayın.
2. Tuzlu suyu geri çekin ve temiz bir slayta eşit şekilde aktarın. Oda sıcaklığında doğal olarak buharlaşmasına ve kurumasına izin verin.
3. Hücreleri sabitlemek için her slayta 30 μL etanol uygulayın. Slayt kuruyana kadar etanolün 5 dakika buharlaşmasına izin verin.
4. Her slayta 50 μL kristal viyole boyama solüsyonu uygulayın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyayın.
5. Fazla boyayı çıkarmak ve spesifik olmayan lekelenmeyi azaltmak için her slaytı deiyonize suyla durulayın.
6. Hücre morfolojisini gözlemleyin ve mikroskop altında hücre tiplerinin oranını belirleyin.
7. Stabiliteyi sağlamak için farelerin kızgınlık döngülerini art arda iki kez gözlemleyin. Deney için üçüncü kızgınlıktaki fareleri seçin.
   NOT: Farelerde kızgınlık döngüsü tipik olarak 4-5 gün sürer ve dört aşamaya ayrılır: proöstrus, östrus, metessus ve diestrus. Proöstrus yaklaşık 24 saat sürer ve yuvarlak ila oval çekirdekli epitel hücreleri ile karakterizedir (Şekil 2A). Östrus 12 saat ile 48 saat arasında sürer ve ağırlıklı olarak annüklee keratinize epitel hücreleri ile karakterizedir (Şekil 2B). Metestrus 24 saate kadar sürer ve anükleasyonlu keratinize epitel hücreleri ve nötrofillerin bir karışımı ile karakterize edilir (Şekil 3C). Diestrus 48 saat ile 72 saat arasında sürer ve nötrofiller, çekirdekli epitel hücreleri ve birkaç anükleasyonlu keratinize hücrenin bir kombinasyonu ile karakterize edilir (Şekil 2D).

2. Grup tasarımı

NOT: % 95 etanol infüzyonunun çeşitli sürelerinin TE modelinin stabilitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için altı tedavi grubu oluşturulmuştur. Bir gruba, prosedürel etkiler için bir kontrol olarak hizmet etmek için etanol uygulaması yapılmadan sahte cerrahi uygulandı. Etanol ile indüklenen TE'li fareler, infüzyon süresine (grup başına n = 5) göre aşağıdaki gibi rastgele beş tedavi grubuna ayrıldı:

1. 1 dakikalık grup: Rahim boşluğuna 1 dakika boyunca etanol enjekte edin.
2. 2 dakikalık grup: Rahim boşluğuna 2 dakika boyunca etanol enjekte edin.
3. 3 dakikalık grup: Rahim boşluğuna 3 dakika boyunca etanol enjekte edin.
4. 4 dakikalık grup: Rahim boşluğuna 4 dakika boyunca etanol enjekte edin.
5. 5- dk grubu: Rahim boşluğuna 5 dakika boyunca etanol enjekte edin.

3. Farelerde TE modelinin indüksiyonu

1. Fareleri 3 dakika boyunca% 5 izofluran ve% 100 oksijen içeren bir anestezi makinesi kullanarak uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış bir protokolü izleyerek). Bir burun konisi kullanarak anesteziyi% 1 -% 3 izofluranda tutun. Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için farelerin gözlerine veteriner merhemi sürün. İşlem boyunca solunum hızını bir ayak parmağı tutamıyla izleyin.
2. Farelerin uzuvlarını sabitlemek için tıbbi bant kullanın ve onları elektronik bir battaniye ile önceden ısıtılmış ameliyat masasında sırtüstü pozisyonda tutun. Hava yolu tıkanıklığını önlemek için farelerin dilini hafifçe çekin.
   NOT: Ameliyat sırasında fareleri sıcak tutmak, bağışıklık fonksiyonunun ve kan dolaşımının korunmasına yardımcı olur ve pıhtılaşmayı önler. Ek olarak, farelerin dillerini dışarı çekmek, anestezi sırasında boğulmayı önlemek için temiz solunum yolları sağlar.
3. Farelerin alt karın bölgesine 3 dakika boyunca hayvan tüy dökücü krem uygulayın. Saçları temiz mendillerle çıkarın. Alanı% 75 etanol ve iyodofor ile dezenfekte edin.
4. Karında 1 cm'lik bir kesi yapın, üretral delikten 1 cm uzakta. Kesiyeri periton boşluğuna kadar uzatmak için steril makas ve forseps kullanın.
5. Uterusu bulmak ve sağ uterus boynuzunu ortaya çıkarmak için bağırsakları steril forseps ile nazikçe kenara hareket ettirin. Rahim ağzının yakınındaki proksimal uca ve yumurtalığın yakınındaki distal uca hemostatik klempler uygulayın.
   NOT: Rahim boynuzunun her iki ucunun da kenetlenmesi, etanol enjeksiyonu sırasında sızıntı olmamasını sağlayarak rahim ağzı, vajina ve yumurtalığın zarar görmesini önler.
6. İğne rahim boynuzunun yönüne paralel olacak şekilde 25 G'lik bir şırınga kullanarak rahim boşluğuna yaklaşık 50 μL% 95 etanol²⁷ damlatın. İğneyi rahim boşluğuna 30 derecelik bir açıyla yerleştirin. Şırıngayı uygun şekilde 1 dakika, 2 dakika, 3 dakika, 4 dakika veya 5 dakika koruyun. Etanolü geri çekin ve kalan etanolü çıkarmak için uterus boşluğunu 5 kez steril tuzlu su ile yıkayın. Benzer şekilde, aynı prosedürleri izleyerek kontrol olarak sol uterus boynuzuna eşit miktarda steril salin damlatın.
   NOT: Şırınga iğnesinin rahim boynuzunun yönüne paralel olduğundan emin olun. İğneyi, tüm rahim boynuzunu geçmesini önlemek için çok dik bir açıyla sokmaktan kaçının. Kalıcı hasarı ve deneysel kararsızlığı önlemek için etanolü mümkün olduğunca tamamen geri çekin.
7. Kelepçeleri çıkarın ve uterusu ve bağırsakları orijinal konumlarına geri getirin.
8. Peritonu 5-0 emilebilir poliglikolid cerrahi sütürlerle dikin, ardından epidermisi 5-0 emilemeyen poliglikolid cerrahi sütürlerle dikin.
9. Kesiği %75 etanol ve iyodofor ile dezenfekte edin ve ardından hayvanları kafeslerine geri koyun. Ameliyattan sonra, fare tamamen iyileşene ve normal şekilde hareket edebilene kadar farenin kalp atış hızının kademeli ve istikrarlı bir şekilde artıp artmadığını yakından gözlemleyin (Şekil 3A-H).
   NOT: Oral analjezik (içme suyunda 3.2 mg / mL asetaminofen) ameliyattan bir gün önce sağlandı ve çalışmanın geri kalanı boyunca devam etti.
10. Fareleri her gün 9:00 ve 15:00'te gözlemleyin ve iyi durumda olduklarından emin olmak için insizyonu iyodofor ile dezenfekte edin.

4. Örnek toplama

1. % 95 etanol tedavisinden 7 gün sonra (kurumsal olarak onaylanmış bir protokolü izleyerek) derin anestezi altındayken servikal omurga çıkığı ile farelere ötenazi yapın.
2. Cerrahi makas kullanarak uterusu ortaya çıkarmak için dikişleri kesin.
3. Cerrahi forseps kullanarak tüm uterusu dikkatlice ve yavaşça çıkarın. Uterusu çevredeki bağırsaklardan ayırın.
4. Hemen her iki rahim boynuzunu da çıkarın ve her boynuzu 3-4 küçük parçaya bölün.
5. Bir pipet kullanarak 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 1 mL %4 paraformaldehit ekleyin. Fiksasyon için uterus dokusunu 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde koruyun.

5. Doku dehidrasyonu

NOT: Doku dehidrasyonu, otomatik bir doku işlemcisi kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).

1. Formalinle sabitlenmiş numuneleri doku kasetlerine yerleştirin.
2. Dokuyu aşağıdaki gibi kurutmak için doku kasetlerini bir dizi artan etanol konsantrasyonundan geçirin: 1 saat boyunca% 70 etanol, 1 saat% 85 etanol, iki kez% 95 etanol (her biri 1 saat) ve% 100 etanol iki kez (her biri 1 saat).
3. Parafinin dokuya nüfuz etmesini sağlamak için etanolü %100 ksilen ile değiştirin (ilk daldırma için 135 dakika, sonraki her daldırma için iki kez 20 dakika).
4. Doku kasetlerini 60-65 ° C'de (3 kez, her biri 140 dakika) bir inkübatörde parafine daldırın ve kasetleri gömülene kadar sıcak tutun.

6. Parafin gömme

NOT: Bu adımları modüler bir doku gömme merkezi kullanarak gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).

1. Bir balmumu kalıbını 55 ° C'ye ısıtılmış erimiş parafin mumu ile doldurun.
2. Sızan segmentleri gömme kasetinden balmumu kalıbına hızlı bir şekilde aktarmak için ısıtılmış forseps kullanın ve her segmentin enine kesitinin kalıbın tabanına paralel durduğundan emin olun.
3. Segmentler düzgün bir şekilde yerleştirildikten sonra, gömme kasetinin altını histoloji kalıbının üzerine yerleştirin.
4. Parafinin katılaşmasını sağlamak için kalıbı doğrudan en az 20 dakika boyunca 4 °C'ye ayarlanmış bir soğutma plakasına yerleştirin.
5. Balmumu katılaştıktan sonra, numuneyi kalıptan çıkarın ve etrafındaki fazla balmumu kesmek için bir parafin düzeltici kullanın.

7. Parafin bölümleme

1. 42 °C'de bir su banyosu hazırlayın. Parafin bloklarını kesmeden önce soğumalarını ve kesilmelerini kolaylaştırmak için soğuk bir tabağa koyun.
2. Parafine gömülü numuneyi, doku yüzeyi yukarı bakacak şekilde döner bir mikrotom üzerine sıkıştırın.
3. İstenilen doku düzlemine ulaşılana kadar dokuyu kaplayan fazla parafini çıkarmak için bir seferde 20 μm kesit.
4. Bir seferde 4 μm kesit kesin.
5. Parafin kesitli şeridi 2 dakika boyunca 42 °C ılık su banyosuna aktarın.
6. Su yüzeyinden kesitleri alın ve açtıktan sonra bir mikroskop lamına yerleştirin.
7. Slaytları 60 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika kurutun.

8. Hematoksilen ve eozin boyama

NOT: Hematoksilen ve Eozin boyama, otomatik bir slayt boyama makinesi kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).

1. Boyama prosedürüne başlamadan önce tüm reaktifleri önceden hazırlayın.
2. Slaytları sırasıyla 10 dakika, 5 dakika ve 3 dakika %100 ksilen içinde bekletin.
3. Slaytları azalan bir etanol serisindeki deiyonize suda aşağıdaki gibi rehidre edin: %100 etanol, %95 etanol (iki kez) ve %80 etanol, her biri 2 dakika.
4. Slaytları deiyonize suda durulayın.
5. Slaytları hematoksilen solüsyonunda 10 dakika boyayın. Slaytları deiyonize suda 1 dakika veya su artık mor olmayana kadar durulayın.
6. Slaytları her seferinde 3-5 saniye boyunca iki kez% 0.5 asit etanol farklılaştırma çözeltisine batırın. Slaytları deiyonize suda 1 dakika durulayın.
7. Slaytları 1 dakika boyunca bir mavileştirme tamponuna (% 1 amonyak çözeltisi) yerleştirin. Slaytları deiyonize suda 1 dakika durulayın.
8. Slaytları %80 etanol ile kurutun ve ardından 10 saniye boyunca bir eozin-Y çalışma solüsyonuna batırın.
9. Slaytları %95 etanole aktarın ve her biri 10 saniye boyunca iki kez durulayın. Ardından, slaytları mutlak etanole aktarın ve her biri 10 saniye boyunca iki kez kurutun.
10. Dokuyu temizlemek için slaytları her biri 2 dakika boyunca iki kez %100 ksilene batırın.
11. Dokunun üzerine bir lamel yerleştirin ve doğal reçine ile kapatın.

9. Masson boyama

1. Slaytları sırasıyla 10 dakika, 5 dakika ve 3 dakika boyunca %100 ksilen içinde bekleterek dokuyu deparafinize edin.
2. Deparafinize ettikten sonra, slaytları azalan bir etanol serisinde deiyonize suda bekletin:% 100 etanol,% 95 etanol (iki kez) ve% 80 etanol, her biri 2 dakika.
3. Slaytları deiyonize suda durulayın.
4. Slaytları Weigert'in demir hematoksilen solüsyonunda 5 dakika boyayın, ardından slaytları 30 saniye boyunca deiyonize suda yıkayın.
5. Slaytları 15 saniye boyunca% 1 hidroklorik asit alkol içinde inkübe ederek lekeli doku yapılarının renklerini ayırt edin.
6. Slaytları deiyonize suda 30 saniye durulayın.
7. Dokuyu 3-5 dakika boyunca bir Bluing Solüsyonunda inkübe edin.
8. Slaytları deiyonize suda 30 saniye durulayın.
9. Slaytları 5-10 dakika Ponceau-Acid Fuchsin Solüsyonuna yerleştirin.
   NOT: Zayıf asit çalışma çözeltisini hazırlamak için deiyonize su ve zayıf asit çözeltisini 2:1 oranında karıştırın.
10. Slaytları zayıf asit çalışma solüsyonu ile 30 saniye durulayın.
11. Fosfomolibdik asit çözeltisindeki dokuyu 1-2 dakika ayırt edin ve ardından bölümleri 30 saniye boyunca zayıf bir asit çalışma çözeltisi ile durulayın.
12. Doku bölümlerini 1-2 dakika anilin mavisi solüsyonla boyayın.
13. Doku bölümlerini 2-3 saniye boyunca% 95 etanol içinde hızlı bir şekilde kurutun, ardından her biri 5-10 saniye boyunca iki kez% 100 etanol ile kurutun. Slaytları ksilen içinde her biri 1-2 dakika boyunca iki kez temizleyin.
14. Dokunun üzerine bir lamel yerleştirin ve doğal reçine ile kapatın.
15. Fazla reçineyi boşaltın ve slaytların kurumasını bekleyin.

10. Görüntüleme ve analiz

1. Bir slayt tarayıcı sistemi kullanarak bölümlerin görüntülerini yakalayın.
   NOT: Bölümlere genel bir bakış için 4x veya 10x hedef kullanın; Daha ayrıntılı görüntüler için 20x ila 100x objektif kullanın.
2. HALO görüntü analiz platformunu kullanarak endometriyal kalınlık, bez sayısı ve doku fibrozunun derecesinin kantitatif analizini gerçekleştirin.
   NOT: Ortalama kalınlık, rastgele seçilen 5 görüş alanında uterus boşluğundan myometriuma olan dikey mesafenin ölçülmesiyle elde edilir.

11. İstatistiksel analizler

1. SPSS sürüm 23.0'ı (SPSS Inc., Chicago, IL, ABD) kullanarak istatistiksel analizler yapın.
2. Önce bir normal dağılım testi yaparak kontrol ve model grupları arasındaki deneysel farklılıkların istatistiksel anlamlılığını değerlendirin.
3. Normalde ortalama ± SEM olarak dağıtılan verileri sunun.
4. Tek yönlü ANOVA kullanarak farklı tedavi gruplarından gelen verileri analiz edin. Bonferroni yöntemini kullanarak her lokusta test edilen alellerin sayısının çoklu karşılaştırmaları için ayarlayın. <0.05 P değerini istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün.

İnce endometriyumun (TE) temel özellikleri, artmış endometriyal fibroz ile birlikte azalmış endometriyal kalınlık ve glandüler yoğunluktur. Bu yöntem, bu özellikleri model farelerde başarıyla çoğalttı. Veri analizi, 1 dakikalık grupta (222.3 μm ± 13.96 μm'ye karşı 359.2 μm ± 12.41 μm, P < 0.05), 2 dakikalık grupta (168.7 μm ± 17.57 μm'ye karşı 359.2 μm ± 12.41 μm, P < 0.05) endometriyal kalınlıkta önemli bir azalma gösterdi±±. P < 0.05) kontrol grubu ile karşılaştırıldığında. Bununla birlikte, 2 dakika ve 3 dakika grupları arasında endometriyal kalınlıkta anlamlı bir fark gözlenmedi (168.7 μm ± 17.57 μm vs. 131.8 μm ± 3 μm, P > 0.05) (Şekil 3A,B).

Endometriyal bez sayısı 1 dakikalık grupta (4.4 ± 2.38'e karşı 24.4 ± 1.6, P < 0.05), 2 dakikalık grupta (0.8 ± 0.49'a karşı 24.4 ± 1.6, P < 0.05) ve 3 dakikalık grupta (4.4 ± 3.20'ye karşı 24.4 ± 1.6, P < 0.05) kontrol grubuna kıyasla önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 3A, C). Bununla birlikte, 1 dakika, 2 dakika ve 3 dakika grupları arasında endometriyal bez sayısında anlamlı bir fark gözlenmedi.

TE, 7 gün boyunca% 95 etanol ile tedaviden sonra meydana geldiğinden, endometriyal kalınlığın infüzyon süresi ile ilişkili olabileceği varsayılmıştır. Bunu araştırmak için, iki ek grup sırasıyla 4 dakika ve 5 dakika boyunca% 95 etanol ile muamele edildi. İlginç bir şekilde, sonuçlar infüzyon süresi arttığında ciddi uterus yapışması gösterdi. (Şekil 4), rahim boşluğu neredeyse görünmez hale gelir. Ek olarak, infüzyon süresinin uzaması ile fare uterusunda endometrial bez gözlenmedi (Şekil 4).

Ayrıca, endometriyal fibroz seviyesi, Masson boyaması ile doğrulandığı gibi% 95 etanol infüzyonu süresi ile artmıştır, bu da hasarlı endometriyumda aşırı fibrozisi gösterir (Şekil 5A, B).

Şekil 1: TE fare modeli kurulumunun akış şeması. Tüm prosedür aşağıdaki adımları içerir: İlk olarak, farelerin deneyden önce 1 hafta boyunca alışmalarına izin verildi. Daha sonra, iki kızgınlık döngüsü izlendi. Üçüncü kızgınlıktaki fareler daha sonra uterus boşluğuna% 95 etanol enjekte edilerek model oluşturma için seçildi. Etanol enjeksiyonundan yedi gün sonra, fareler sakrifiye edildi ve uterus boynuzları daha fazla HE boyama ve Masson boyama analizi için toplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Farelerde östrusun tanımlanması. (A) Proöstrus, çekirdekli epitel hücrelerinin baskınlığı ile karakterize edilir (ok). (B) Kızgınlık, anükleasyonlu keratinize epitel hücrelerinin (yıldız işaretleri) baskınlığı ile karakterizedir. (C) Metestrus, anükleasyonlu keratinize epitel hücreleri ve nötrofillerin (üçgen) bir kombinasyonu ile karakterize edilir. (D) Diestrus, nötrofiller, çekirdekli epitel hücreleri ve düşük sayıda anükleasyonlu keratinize hücrelerin bir kombinasyonu ile karakterize edilir. 20x objektif büyütme. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: % 95 etanol infüzyonu ile TE indüksiyonu prosedürü. (A) Fareler bir anestezi makinesi kullanılarak uyuşturulur. (B) Karın kılları alınır. (C) Üretral delikten 1 cm uzakta 1 cm'lik bir kesi yapılır. (D) Rahim bulunur ve rahim boynuzunun bir tarafı açıktadır. (E) Rahim boynuzunun her iki tarafına hemostatik klempler uygulanır. (F) Rahim boynuzuna% 95 etanol damlatılır ve daha sonra steril tuzlu su ile yıkanır. (G) Kelepçeler çıkarılır ve rahim geri yerleştirilir. (H) Kesi dikilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Mikroskopi altında HE boyama kullanılarak farelerde endometriyal morfolojinin gözlemlenmesi. (A) Yaralı ve kontrol taraflarındaki endometriyumun morfolojisi incelendi. Sağ uterusa %95'lik etanol enjekte edilirken, sol uterusa kontrol amaçlı steril salin enjekte edildi. Ölçek çubukları = 200 μm. (B) Con grubu, 1 dk, 2 dk ve 3 dk grupları arasında endometriyal kalınlığın karşılaştırılması. (C) Con grubu, 1 dk, 2 dk, 3 dk, 4 dk ve 5 dk grupları arasında endometriyumdaki bez sayısının karşılaştırılması. Aleyhte, kontrol; **P < 0.01, ****P < 0.0001, tek yönlü ANOVA ile. Veriler, ortalamanın standart hatası ± ortalama olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Fare endometriyumunda endometriyal fibroz. (A) Masson'un trikrom boyaması, belirtilen tedavi gruplarında mavi rengin kollajen liflerinin dağılımını gösterdiği endometriyal fibrozu değerlendirmek için kullanıldı. Ölçek çubukları = 200 μm. (B) Bir özet çubuk grafik, farklı gruplar arasındaki kollajen fibroz seviyesini gösterir. **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, tek yönlü ANOVA ile. Veriler, ortalamanın standart hatası ± ortalama olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

TE, yetersiz hücre proliferasyonu ve işlevsiz hücreler ile karakterizedir, kısırlık, tekrarlayan düşük ve plasental anormallikler ile yakından bağlantılıdır ^2,3. Ne yazık ki, şu anda TE için etkili bir tedavi yoktur. Hayvan modelleri bu durumun incelenmesinde çok önemli bir rol oynamaktadır. 2014 ve 2024 yılları arasında 208.000 çalışmanın %16,4'ünde (34.200 çalışma) sıçanlar ve %22,7'sinde (47.300 çalışma) fareler model organizma olarak kullanıldı. Farelerin deneylerde artan kullanımı, diğer modellere göre avantajlarına, özellikle de rejenerasyon çalışmalarındaki potansiyellerine^{bağlanabilir} 28,29,30. Model tutarlılığının önemi göz önüne alındığında, fareleri model olarak kullanarak çalışmalar yürütmek için daha uyumlu araçlara artan bir ihtiyaç vardır³¹.

Önceki çalışmalarda bildirildiği gibi, TE modellerini indüklemek için yaygın yöntemler arasında kaşıma^11,12, iskemi¹⁴, termal kaynaklı yaralanma¹⁵ ve kimyasal kaynaklı yaralanma 16,17,23 bulunur. TE çalışmalarında hayvan modellerinin kullanımını kolaylaştırmak ve etkili tedavilerin temelini atmak için, Gao ve ^ark.24 ilk olarak SD sıçanlarda endometriyuma zarar vermek için 5 dakika boyunca mutlak etanol enjekte ederek bir TE modeli oluşturmuştur. Bu yöntem endometriyal büyümeyi kısıtlamasına rağmen, genellikle karın boşluğunda ciddi yapışıklıklara yol açar ve hayatta kalma oranı sadece% 70'tir.

Önceden,% 95 etanol, uygulama kolaylığı nedeniyle sıçanlarda ağırlıklı olarak kullanılıyordu, ancak bu yöntem TE çalışmaları için birkaç fare modeli üretti. Klinik gözlemler, kapsamlı bir literatür taraması, ön deneyler, tekrarlanan tartışmalar ve analizlerden sonra, daha kısa uterus infüzyon süresi ile geliştirilmiş bir yöntem geliştirildi. Yetenekli teknikler, değişen infüzyon sürelerine sahip bir TE modeli oluşturmak için uterus boşluğuna% 95 etanol enjekte edilmesine izin verir.

Bu çalışmada tanıtılan fare modeli, Gao'nun^{model 24'ün} ilkeleri üzerine inşa edilmiştir. Bununla birlikte, etanol infüzyon süresinin kısaltılması ve tuzlu su yıkama frekansının arttırılması dahil olmak üzere çeşitli modifikasyonlar yapılmıştır. Bu modelde, fare uterusu abdominal diseksiyon yoluyla maruz bırakıldı ve uterus boynuzlarının bir tarafına çeşitli sürelerde% 95 etanol enjekte edildi: 1 dk, 2 dk, 3 dk, 4 dk ve 5 dk. Etanol infüzyon süresi üzerindeki hassas kontrol ve standartlaştırılmış prosedür sayesinde, fare deneylerinde, fareler arasındaki bireysel farklılıklardan kaynaklanan sapmaları en aza indiren kararlı veriler elde edildi.

Histolojik sonuçlar, TE fareleri arasında endometriyal kalınlıkta, endometriyal bezlerin sayısında ve endometriyal fibrozda değişen derecelerde belirgin değişiklikler olduğunu göstermekte ve bu çalışmada kurulan modelin güvenilirliğini doğrulamaktadır ^3,6,9. Özellikle, etanol infüzyon süresi 4 dakika veya 5 dakikayı aştığında, ciddi intrauterin yapışıklıklar (IUA) gözlendi. Bu bulgular, TE fare modelinin 1-3 dakikalık% 95 etanol infüzyonu ile etkili bir şekilde kurulabileceğini, 3 dakikayı aşan infüzyon sürelerinin ise ciddi IUA'yı indükleyebileceğini göstermektedir.

Bugüne kadar, TE'yi incelemek için çizilme, iskemi, termal kaynaklı ve kimyasal kaynaklı modeller dahil olmak üzere çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir. Kaşımaya bağlı model, gerçekleştirilmesi daha kolay olsa da, genellikle TE'den ziyade intrauterin yapışıklıklara (IUA) yol açar. İskemi kaynaklı TE modeli, kimyasal indüklenen modelden çok daha uzun bir süre gerektirir ve termal olarak indüklenen yöntem, kimyasal indüksiyona kıyasla daha karmaşık ve uygulanması zordur. Kimyasal kaynaklı model zaman açısından verimli ve stabil olmasına rağmen, hayvanlara travma ve uygun olmayan teknik nedeniyle enfeksiyon veya ölüm riskleri gibi potansiyel sınırlamaları vardır. Bu sorunlar dikkatli bir eğitim ve deneyim ile hafifletilebilir.

Sonuç olarak, sonuçlar, TE fare modelinin rahim boşluğuna 1-3 dakika boyunca% 95 etanol enjekte edilerek etkili bir şekilde kurulabileceğini göstermektedir. Bu yaklaşım, TE'nin patolojik mekanizmalarını ve onarım süreçlerini incelemek ve bu durumdaki hastalar için etkili tedaviler geliştirmek için umut verici bir yöntem sunmaktadır.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

İsimsiz hakemlere önemli ve yardımcı yorumları için minnetle teşekkür ederiz. Bu çalışma Shenzhen Bilim ve Teknoloji Projesi tarafından desteklenmiştir (No. JCYJ20220818103207016) ve Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (No. 2024A1515010478).