얇은 자궁내막의 마우스 모델 구축

이 논문은 1-3분 이내에 95% 에탄올을 마우스 자궁에 주입하여 사망률이 매우 낮고 자궁 내 유착을 최소화하면서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 얇은 자궁내막을 생산하기 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

얇은 자궁내막(TE)은 불임의 중요한 원인으로 널리 알려져 있습니다. 그러나 TE의 발병 기전은 여전히 불분명하며 만족스러운 치료 옵션이 여전히 시급히 필요합니다. TE의 여러 동물 모델이 개발되었지만, 복부 수술 및 95% 에탄올 주입을 포함하는 마우스 모델은 높은 사망률과 올바르게 수행하지 않을 경우 자궁 내 유착의 위험으로 인해 만만치 않은 도전입니다. 여기에서는 다양한 주입 시간으로 95% 에탄올을 마우스 자궁에 주입하여 매우 낮은 폐사율과 최소한의 자궁 내 유착으로 신뢰할 수 있고 재현 가능한 TE를 생성하는 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 그 결과, 모든 마우스에서 주입 시간이 1-3분 범위로 TE가 성공적으로 발달했으며, 이는 자궁내막 두께와 분비선 수의 전형적인 감소, 과도한 자궁내막 섬유증을 특징으로 합니다. 이러한 결과는 이 마우스 모델이 얇은 자궁내막을 연구하는 데 적합하며 향후 TE 치료법을 개발하기 위한 플랫폼 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

얇은 자궁내막(TE)은 산부인과에서 흔히 발생하는 심각한 질환으로, 가임기 여성에게 영향을 미치는 경우가 많습니다. TE는 초음파 검사에서 자궁내막 두께가 7mm 미만으로 측정되고 정상 자궁강이 있을 때 진단되며, 임신 실패와 밀접한 관련이 있습니다 ^1,2. 체외 수정(IVF) 치료를 받는 여성의 약 1.5%-9.1%가 TE를 경험하는 것으로 추정되며, 이는 생식 의학에서 점점 더 많은 도전을 받고 있습니다 ^3,4,5. TE의 가장 흔한 원인으로는 자궁 내 유착(IUA)과 소파술의 외과적 분리 후 부적절한 자궁 내막 복원이 포함되며, 이는 종종 혈관 분포 중단 및 희박한 분비샘을 동반합니다 ^6,7,8. 현재까지 TE의 기저에 있는 세포 및 분자 메커니즘은 불분명합니다. TE 환자에서 자궁내막을 회복하는 데는 시간이 많이 걸리지만, 에스트로겐 치료와 저용량 아스피린 요법이 잠재적인 중재책으로 연구되고 있다⁹. 따라서 TE의 발병 기전에 대한 심층 연구는 이 상태의 문제를 해결하는 가장 직접적인 접근 방식입니다. 그러나 TE의 발병 기전에 대한 연구는 동물 모델에 의존하기 때문에 적절한 모델을 선택하는 것이 중요합니다.

얇은 자궁내막(TE)에 대한 대부분의 조직병리학적 연구는 상피 세포와 대식세포의 증식 장애, 난소 스테로이드 호르몬 수용체의 발현 감소, 세포외 기질의 과도한 침착 및 세포 노화가 TE ^6,9,10의 가장 중요한 병리학적 특징임을 보여주었습니다. 현재 긁힘 11,12,13, 허혈¹⁴, 열 손상¹⁵ 및 화학적 손상 16,17,18,19에 의해 유도된 모델을 포함하여 TE를 모방하기 위해 다양한 랫드 모델이 개발되었습니다. 쥐 모델은 바늘이나 카테터로 자궁내막을 긁음으로써 유도되며, 이는 종종 TE 11,12,20,21,22가 아닌 자궁내 유착(IUA)을 초래합니다. 쥐에서 허혈 유발 TE 모델도 보고되었는데, 여기서 자궁내막 허혈은 양측 자궁 동맥 결찰술을 수행하여 자궁 내막 두께를 감소시켜 달성됩니다. 그러나 이 방법은 시간이 많이 걸리고 3개월이 소요되며 연구에 널리 사용되지 않는다¹⁴. 열 손상으로 인한 모델에서는 인공 수정 튜브를 사용하여 85°C로 예열된 물을 양쪽의 합류를 통해 자궁 각의 한쪽 면에 주입하여 다른 방법보다 더 복잡하게 만듭니다¹⁵. 화학적 유도 모델은 노출된 자궁 뿔에 95% 에탄올을 주입하여 자궁내막 전체를 손상시키는 것입니다. 이 모델은 TE에서 병리학적 메커니즘 및 치료법을 연구하기 위한 저렴한 비용과 짧은 실험 기간의 이점을 제공하지만 주로 마우스보다는 쥐에서 사용됩니다 16,17,23. 다양한 동물 모델, 특히 쥐 모델이 존재하지만 각각 한계가 있습니다. TE의 특정 측면만 시뮬레이션할 수 있으며, TE의 질병 특성을 밀접하게 복제하는 동시에 연구에 편리하고 다재다능한 마우스 모델은 거의 없습니다.

이러한 맥락에서 우리는 수정된 방법²⁴ 와 함께 시간 구배 접근법을 사용하여 95% 에탄올을 자궁강에 주입하여 새로운 얇은 자궁내막(TE) 마우스 모델을 개발했습니다. 그 결과, 주입 시간이 1-3분 범위일 때 모든 마우스에서 TE가 성공적으로 발달하여 자궁내막 두께 감소, 분비선 축소, 자궁내막 섬유증 증가와 같은 전형적인 특성을 보였다. 이러한 결과는 우리의 마우스 모델이 TE 연구에 적합한 도구이며 향후 TE 치료법을 개발하기 위한 플랫폼 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

이 연구는 모든 동물 실험이 수행된 Shenzhen Zhongshan Obstetrics & Gynecology Hospital(구 Shenzhen Zhongshan Urology Hospital)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 암컷 C57BL/6 마우스(생후 6-8주, 체중 18-20g)가 사용되었습니다. 모든 동물은 같은 방의 특정 병원체가 없는(SPF) 환경에 수용되었으며 12시간 명암 주기로 (22 ± 1) °C에서 특정 병원체가 없는 방에서 실험하기 전 일주일 동안 순응했습니다. 그들은 음식과 물을 무료로 제공받았습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 발정기의 확인

참고: 생쥐의 발정기는 인간의 후기 황체기와 비슷하며, 이 시기에는 비교적 두꺼운 자궁내막 내막이 있습니다. 모델 유도를 위해 발정기에 있는 마우스를 선택하면 상대적으로 일관된 생리학적 상태를 유지할 수 있습니다. 또한, 자궁내막 얇아짐의 결과는 자궁내막 두께가 상대적으로 두꺼울 때 더 두드러집니다. 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전에 게시된 보고서^25,26을 참조하십시오.

1. 피펫을 사용하여 식염수 20μL를 준비합니다. 마우스 귀의 양쪽을 잡고 마우스 꼬리를 고정하여 피펫 끝을 약 2mm 깊이까지 질 구멍에 부드럽게 삽입합니다. 20μL의 식염수를 질에 주입하고 5회 동안 부드럽게 씻어냅니다.
2. 식염수를 빼서 깨끗한 슬라이드에 골고루 옮깁니다. 실온에서 증발하고 자연 건조시키십시오.
3. 각 슬라이드에 30μL의 에탄올을 도포하여 세포를 고정합니다. 슬라이드가 마를 때까지 에탄올을 5분 동안 증발시킵니다.
4. 각 슬라이드에 50μL의 크리스털 바이올렛 염색 용액을 바르고 실온에서 10분 동안 세포를 염색합니다.
5. 각 슬라이드를 탈이온수로 헹구어 과도한 염료를 제거하고 비특이적 염색을 줄입니다.
6. 세포 형태를 관찰하고 현미경으로 세포 유형의 비율을 결정합니다.
7. 안정성을 보장하기 위해 마우스의 발정 주기를 두 번 연속으로 관찰합니다. 실험을 위해 세 번째 발정기의 마우스를 선택합니다.
   참고: 마우스의 발정 주기는 일반적으로 4-5일 동안 지속되며 프로발정, 발정기, 메테스트러스, 디스트루스의 4단계로 나뉩니다. 프로발정은 약 24시간 동안 지속되며 원형에서 타원형의 핵이 있는 상피 세포가 특징입니다(그림 2A). 발정은 12시간에서 48시간 사이에 지속되며 주로 핵이 있는 각질화된 상피 세포가 특징입니다(그림 2B). 메테스트러스는 최대 24시간 동안 지속되며 무핵화된 각질화된 상피 세포와 호중구가 혼합된 것이 특징입니다(그림 3C). Diestrus는 48시간에서 72시간 사이에 지속되며 호중구, 핵이 있는 상피 세포 및 몇 개의 핵이 있는 각질 세포의 조합을 특징으로 합니다(그림 2D).

2. 그룹 디자인

참고: 95% 에탄올 주입의 다양한 지속 기간이 TE 모델의 안정성에 미치는 영향을 평가하기 위해 6개의 치료 그룹이 설정되었습니다. 한 그룹은 절차적 효과에 대한 통제 역할을 하기 위해 에탄올 투여 없이 가짜 수술을 받았습니다. 에탄올 유도 TE를 가진 마우스는 다음과 같이 주입 시간(그룹당 n = 5)에 따라 5개의 치료 그룹으로 무작위로 나뉘었습니다.

1. 1분 그룹: 1분 동안 자궁강에 에탄올을 주입합니다.
2. 2- 분 그룹: 2분 동안 자궁강에 에탄올을 주입합니다.
3. 3- 분 그룹: 3분 동안 자궁강에 에탄올을 주입합니다.
4. 4- 분 그룹: 4분 동안 자궁강에 에탄올을 주입합니다.
5. 5분 그룹: 5분 동안 자궁강에 에탄올을 주입합니다.

3. 마우스에서 TE 모델 유도

1. 5% 이소플루란과 100% 산소가 함유된 마취기를 사용하여 3분 동안 마우스를 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 노즈 콘을 사용하여 1%-3% 이소플루란에서 마취를 유지합니다. 마취 중 건조를 방지하기 위해 쥐의 눈에 동물용 연고를 바르십시오. 시술 내내 발가락 꼬집기로 호흡수를 모니터링하십시오.
2. 의료용 테이프를 사용하여 생쥐의 팔다리를 고정하고 전자 담요로 예열된 수술대에서 누운 자세로 유지합니다. 기도 막힘을 방지하기 위해 쥐의 혀를 부드럽게 약간 당깁니다.
   참고: 수술 중 생쥐를 따뜻하게 유지하면 면역 기능과 혈액 순환을 유지하고 응고를 방지하는 데 도움이 됩니다. 또한 쥐의 혀를 뽑으면 마취 중 질식을 피하기 위해 깨끗한 호흡기를 확보할 수 있습니다.
3. 동물의 제모 크림을 쥐의 하복부에 3 분 동안 바르십시오. 깨끗한 물티슈로 털을 제거하십시오. 75% 에탄올과 요오드로 해당 부위를 소독하십시오.
4. 복부에서 1cm, 요도구에서 1cm 절개를 합니다. 멸균 가위와 집게를 사용하여 절개 부위를 복막강까지 확장하십시오.
5. 멸균 집게로 내장을 부드럽게 옆으로 움직여 자궁의 위치를 파악하고 오른쪽 자궁 뿔을 드러냅니다. 자궁경부 근처의 근위부와 난소 근처의 원위부에 지혈 클램프를 적용합니다.
   참고: 자궁 뿔의 양쪽 끝을 클램핑하면 에탄올 주입 중 누출이 발생하지 않아 자궁경부, 질 및 난소의 손상을 방지할 수 있습니다.
6. 25G 주사기를 사용하여 약 50μL의 95% 에탄올²⁷ 을 자궁강에 주입하고 바늘을 자궁 뿔 방향과 평행하게 합니다. 바늘을 30도 각도로 자궁강에 삽입합니다. 주사기를 적절하게 1분, 2분, 3분, 4분 또는 5분 동안 유지 관리합니다. 에탄올을 빼내고 멸균 식염수로 자궁강을 5회 세척하여 남아 있는 에탄올을 제거합니다. 마찬가지로, 동일한 절차에 따라 대조군으로 동일한 양의 멸균 식염수를 왼쪽 자궁 뿔에 주입합니다.
   알림: 주사기 바늘이 자궁 뿔의 방향과 평행한지 확인하십시오. 바늘이 자궁경막 전체를 가로지르는 것을 막을 수 없을 정도로 너무 가파른 각도로 바늘을 삽입하지 마십시오. 지속적인 손상과 실험적 불안정성을 방지하기 위해 에탄올을 가능한 한 완전히 회수하십시오.
7. 클램프를 제거하고 자궁과 내장을 원래 위치로 되돌립니다.
8. 5-0 흡수성 폴리글리콜라이드 수술용 봉합사로 복막을 봉합한 다음 5-0 비흡수성 폴리글리콜라이드 수술용 봉합사로 표피를 봉합합니다.
9. 절개 부위를 75% 에탄올과 요오드로 소독한 다음 동물을 우리로 되돌려 놓습니다. 수술 후 마우스가 완전히 회복되어 정상적으로 움직일 수 있을 때까지 마우스의 심박수가 점차적으로 꾸준히 증가하는지 면밀히 관찰합니다(그림 3A-H).
   참고: 경구 진통제(음용수 내 3.2mg/mL 아세트아미노펜)는 수술 전날에 제공되었으며 연구의 나머지 기간 동안 계속되었습니다.
10. 매일 9:00 및 15:00에 쥐를 관찰하고 요오드로 절개 부위를 소독하여 양호한 상태인지 확인합니다.

4. 샘플 수집

1. 95% 에탄올 처리 후 7일 후에 깊은 마취 상태에서 경추 탈구로 마우스를 안락사시킵니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).
2. 수술용 가위를 사용하여 자궁이 드러나도록 봉합사를 절단합니다.
3. 수술용 겸자를 사용하여 자궁 전체를 조심스럽게 천천히 추출합니다. 주변 내장에서 자궁을 분리합니다.
4. 즉시 양쪽 자궁 뿔을 제거하고 각 뿔을 3-4개의 작은 부분으로 나눕니다.
5. 피펫을 사용하여 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 4% 파라포름알데히드 1mL를 추가합니다. 고정을 위해 4% 파라포름알데히드에 자궁 조직을 24시간 동안 보존합니다.

5. 조직 탈수

알림: 조직 탈수는 자동 조직 처리기를 사용하여 이루어집니다( 재료 표 참조).

1. 포르말린으로 고정된 샘플을 조직 카세트에 넣습니다.
2. 다음과 같이 조직을 탈수하기 위해 일련의 증가하는 에탄올 농도를 통해 조직 카세트를 옮깁니다 : 1 시간 동안 70 % 에탄올, 1 시간 동안 85 % 에탄올, 95 % 에탄올 2 회 (각 1 시간), 100 % 에탄올 2 회 (각 1 시간).
3. 에탄올을 100% 자일렌(첫 번째 침지 시 135분, 이후 두 번 침지할 때마다 20분)으로 교체하여 파라핀이 조직에 침투하도록 합니다.
4. 조직 카세트를 파라핀에 담근 후 60-65°C(3회, 각 140분)의 인큐베이터에 담그고 포자기가 삽입될 때까지 카세트를 따뜻하게 유지합니다.

6. 파라핀 끼워넣기

참고: 모듈식 조직 포매 센터를 사용하여 다음 단계를 수행합니다( 재료 표 참조).

1. 55 ° C로 가열 된 용융 파라핀 왁스로 왁스 몰드를 채 웁니다.
2. 가열된 집게를 사용하여 임베딩 카세트에서 침투된 세그먼트를 왁스 몰드로 빠르게 전달하여 각 세그먼트의 단면이 몰드 베이스와 평행하게 놓이도록 합니다.
3. 세그먼트가 적절하게 배치되면 임베딩 카세트의 바닥을 조직학 금형 위에 놓습니다.
4. 파라핀이 응고될 수 있도록 최소 20분 동안 4°C로 설정된 냉각판에 금형을 직접 놓습니다.
5. 왁스가 응고된 후 s를 제거하십시오.amp금형에서 제거하고 파라핀 트리머를 사용하여 주변의 과도한 왁스를 다듬습니다.

7. 파라핀 단면화

1. 42 ° C에서 수조를 준비하십시오. 절단하기 전에 파라핀 블록을 냉각판에 올려 냉각시키고 더 쉽게 다듬을 수 있도록 합니다.
2. 파라핀이 박힌 표본을 조직 표면이 위를 향하도록 회전식 마이크로톰에 고정합니다.
3. 한 번에 20μm를 절단하여 원하는 조직 평면에 도달할 때까지 조직을 덮고 있는 과도한 파라핀을 제거합니다.
4. 한 번에 4μm 섹션을 자릅니다.
5. 파라핀 절편 리본을 42°C 온수 수조에 2분 동안 옮깁니다.
6. 물 표면에서 부분을 집어 펼친 후 현미경 슬라이드에 놓습니다.
7. 60°C 인큐베이터에서 슬라이드를 30분 동안 건조시킵니다.

8. Hematoxylin와 eosin 염색

참고: Hematoxylin 및 Eosin 염색은 자동화된 슬라이드 염색 기계를 사용하여 수행됩니다( 재료 표 참조).

1. 염색 절차를 시작하기 전에 모든 시약을 미리 준비하십시오.
2. 슬라이드를 100% 자일렌에 각각 10분, 5분, 3분 동안 담그십시오.
3. 탈이온수에 감소하는 에탄올 시리즈로 슬라이드를 다음과 같이 재수화합니다: 100% 에탄올, 95% 에탄올(2회) 및 80% 에탄올, 각각 2분 동안.
4. 슬라이드를 탈이온수로 헹굽니다.
5. 헤마톡실린 용액에 슬라이드를 10분 동안 염색합니다. 탈이온수로 슬라이드를 1분 동안 또는 물이 더 이상 보라색이 아닐 때까지 헹굽니다.
6. 슬라이드를 0.5% 산성 에탄올 분화 용액에 두 번 3-5초 동안 매번 담그십시오. 슬라이드를 탈이온수로 1분 동안 헹굽니다.
7. 슬라이드를 블루잉 버퍼(1% 암모니아 용액)에 1분 동안 놓습니다. 슬라이드를 탈이온수로 1분 동안 헹굽니다.
8. 슬라이드를 80% 에탄올로 탈수한 다음 eosin-Y 작업 용액에 10초 동안 담그십시오.
9. 슬라이드를 95% 에탄올로 옮기고 각각 10초 동안 두 번 헹굽니다. 그런 다음 슬라이드를 절대 에탄올로 옮기고 각각 10초 동안 두 번 탈수합니다.
10. 슬라이드를 100% 자일렌에 담궈 조직을 각각 2분 동안 두 번 제거합니다.
11. 티슈 위에 커버슬립을 놓고 천연 수지로 밀봉합니다.

9. Masson 염색

1. 슬라이드를 100% 자일렌에 각각 10분, 5분, 3분 동안 담가 조직을 파라핀화합니다.
2. 탈파라핀화 후 슬라이드를 탈이온수(100% 에탄올, 95% 에탄올(2회), 80% 에탄올에 각각 2분 동안 담그십시오.
3. 슬라이드를 탈이온수로 헹굽니다.
4. Weigert의 철 헤마톡실린 용액에 슬라이드를 5분 동안 염색한 다음 탈이온수로 슬라이드를 30초 동안 세척합니다.
5. 슬라이드를 1% 염산 알코올에 15초 동안 배양하여 염색된 조직 구조의 색상을 구별합니다.
6. 슬라이드를 탈이온수로 30초 동안 헹굽니다.
7. Bluing Solution에서 조직을 3-5분 동안 배양합니다.
8. 슬라이드를 탈이온수로 30초 동안 헹굽니다.
9. 슬라이드를 Ponceau-Acid Fuchsin Solution에 5-10분 동안 놓습니다.
   알림: 탈이온수와 약산용액을 2:1의 비율로 혼합하여 약산성 작동액을 제조합니다.
10. 약산성 작업 용액으로 슬라이드를 30초 동안 헹굽니다.
11. 포스포몰리브딕산 용액에서 조직을 1-2분 동안 분화한 다음 약산성 작동 용액으로 섹션을 30초 동안 헹굽니다.
12. 아닐린 블루 용액으로 조직 부분을 1-2분 동안 염색합니다.
13. 조직 절편을 95% 에탄올로 2-3초 동안 빠르게 탈수한 다음 100% 에탄올을 각각 5-10초 동안 두 번 탈수합니다. 자일렌의 슬라이드를 각각 1-2분 동안 두 번 지웁니다.
14. 티슈 위에 커버슬립을 놓고 천연 수지로 밀봉합니다.
15. 여분의 수지를 배출하고 슬라이드를 건조시킵니다.

10. 이미징 및 분석

1. 슬라이드 스캐너 시스템을 사용하여 섹션의 이미지를 캡처합니다.
   참고: 섹션의 개요를 위해 4x 또는 10x 대물렌즈를 사용하십시오. 더 자세한 이미지를 보려면 20X - 100X 대물렌즈를 사용하십시오.
2. HALO 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 자궁내막 두께, 땀샘 수 및 조직 섬유증 정도에 대한 정량 분석을 수행합니다.
   참고: 평균 두께는 자궁강에서 근막까지의 수직 거리를 무작위로 선택된 5개의 시야에서 측정하여 구합니다.

11. 통계 분석

1. SPSS 버전 23.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
2. 먼저 정규 분포 검정을 수행하여 통제 그룹과 모델 그룹 간의 실험적 차이에 대한 통계적 유의성을 평가합니다.
3. SEM± 평균으로 정규 분포를 따르는 데이터를 표시합니다.
4. 일원분산분석(One-way ANOVA)을 사용하여 서로 다른 치료 그룹의 데이터를 분석합니다. Bonferroni 방법을 사용하여 각 유전자 자리에서 테스트된 대립유전자 수의 다중 비교를 조정합니다. P-값 <0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

얇은 자궁내막(TE)의 주요 특징은 자궁내막 두께와 선 밀도 감소와 자궁내막 섬유증 증가입니다. 이 방법은 모델 마우스에서 이러한 특성을 성공적으로 복제했습니다. 데이터 분석에 따르면 1분 그룹(222.3μm ± 13.96μm 대 359.2μm ± 12.41μm, P < 0.05), 2분 그룹(168.7μm ± 17.57μm 대 359.2μm ± 12.41μm, P < 0.05), 3분 그룹(131.8μm ± 3μm 대 359.2μm ± 12.41μm), P < 0.05)를 대조군과 비교했을 때. 그러나 2분과 3분 그룹 간에 자궁내막 두께의 유의미한 차이는 관찰되지 않았다(168.7μm ± 17.57μm 대 131.8μm ± 3μm, P > 0.05)(그림 3A,B).

자궁내막샘의 수는 대조군과 비교했을 때 1분 그룹(4.4 ± 2.38 vs. 24.4 ± 1.6, P < 0.05), 2분 그룹(0.8 ± 0.49 vs. 24.4 ± 1.6, P < 0.05), 3분 그룹(4.4 ± 3.20 vs. 24.4 ± 1.6, P < 0.05)에서 유의하게 감소했다(그림 3A,C). 그러나 자궁내막샘의 수에는 1분, 2분, 3분 그룹에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

TE는 95% 에탄올을 7일 동안 처리한 후 발생했기 때문에 자궁내막 두께가 주입 기간과 관련이 있을 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이를 조사하기 위해 두 개의 추가 그룹을 각각 4분 및 5분 동안 95% 에탄올로 처리했습니다. 흥미롭게도, 그 결과는 주입 시간이 늘어났을 때 심각한 자궁 유착을 보여주었습니다. (그림 4), 자궁강이 거의 보이지 않게 됩니다. 또한, 주입 시간이 길어진 쥐의 자궁에서 자궁내막샘이 관찰되지 않았습니다(그림 4).

더욱이, 95% 에탄올 주입 기간 동안 자궁내막 섬유증의 수준이 증가했는데, 이는 Masson 염색에 의해 확인된 바와 같이 손상된 자궁내막의 과도한 섬유화를 나타냅니다(그림 5A, B).

그림 1: TE 마우스 모델 설정의 순서도. 전체 절차에는 다음 단계가 포함됩니다.첫째, 실험 전 1주일 동안 마우스가 적응하도록 했습니다. 다음으로, 두 개의 발정 주기를 모니터링했습니다. 그런 다음 3차 발정기의 마우스를 선택하여 95% 에탄올을 자궁강에 주입하여 모델 확립을 위해 선택했습니다. 에탄올 주입 7일 후, 마우스를 희생하고 추가 HE 염색 및 Masson 염색 분석을 위해 자궁 뿔을 채취했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 마우스의 발정 확인. (A) Proestrus는 핵이 있는 상피 세포(화살표)가 우세한 것이 특징입니다. (B) 발정은 무핵 각질화된 상피 세포(별표)가 우세한 것이 특징입니다. (C) 메테스트러스(Metestrus)는 무핵 각질화된 상피 세포와 호중구(삼각형)의 조합을 특징으로 합니다. (D) 디스트러스는 호중구, 핵이 있는 상피 세포 및 적은 수의 핵 각질화된 세포의 조합을 특징으로 합니다. 20배의 객관적 배율. 스케일 바 = 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 95% 에탄올 주입에 의한 TE 유도 절차. (A) 마우스는 마취 기계를 사용하여 마취됩니다. (B) 복부 털을 제거합니다. (C) 요도 구멍에서 1cm 떨어진 곳에서 1cm 절개를 합니다. (D) 자궁이 위치하고 있으며 자궁 뿔의 한쪽이 노출되어 있습니다. (E) 지혈 클램프는 자궁 뿔의 양쪽에 적용됩니다. (F) 95% 에탄올을 자궁 뿔에 주입한 다음 멸균 식염수로 씻어냅니다. (G) 클램프를 제거하고 자궁을 다시 놓습니다. (H) 절개 부위를 봉합합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 현미경 검사에서 HE 염색을 사용한 마우스의 자궁내막 형태 관찰. (A) 손상 측과 대조군의 자궁내막의 형태를 조사했습니다. 오른쪽 자궁에는 95% 에탄올을 주입하고, 왼쪽 자궁에는 무균 식염수를 대조군으로 주입했습니다. 스케일 바 = 200μm. (B) Con 그룹, 1분, 2분, 3분 그룹 간의 자궁내막 두께 비교. (C) Con 그룹, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분 그룹 간의 자궁내막내 땀샘 수 비교. 콘, 제어; **P < 0.01, ****P < 0.0001(일원 분산 분석). 데이터는 평균의 표준 오차± 평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 마우스 자궁내막의 자궁내막 섬유증. (A) Masson의 트리크롬 염색은 자궁내막 섬유증을 평가하는 데 사용되었으며, 파란색은 표시된 치료 그룹에서 콜라겐 섬유의 분포를 나타냅니다. 스케일 바 = 200μm. (B) 요약 막대 차트는 서로 다른 그룹 간의 콜라겐 섬유화 수준을 보여줍니다. **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001(일원 분산 분석). 데이터는 평균의 표준 오차± 평균으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

TE는 불충분한 세포 증식 및 기능 장애를 특징으로 하며, 이는 불임, 재발성 유산 및 태반 이상과 밀접한 관련이 있습니다 ^2,3. 불행히도 현재 TE에 대한 효과적인 치료법은 없습니다. 동물 모델은 이 상태를 연구하는 데 중요한 역할을 합니다. 2014년에서 2024년 사이에 쥐는 208,000건의 연구 중 16.4%(34,200건)에서, 쥐는 22.7%(47,300건의 연구)에서 모델 유기체로 사용되었습니다. 실험에서 마우스의 사용이 증가하는 것은 다른 모델에 비해 장점, 특히 재생 연구에서의 잠재력에 기인할 수 있습니다 28,29,30. 모델 일관성의 중요성을 감안할 때, 마우스를 모델로 사용하여 연구를 수행하기 위해 더 많은 호환 가능한 도구에 대한 필요성이 증가하고 있습니다³¹.

이전 연구에서 보고된 바와 같이 TE 모델을 유도하는 일반적인 방법에는 긁힘^11,12, 허혈¹⁴, 열 유도 손상 15 및 화학적 유도 손상^16,17,23 등이 있습니다. TE 연구에서 동물 모델의 사용을 촉진하고 효과적인 치료를 위한 토대를 마련하기 위해 Gao 등^[24]은 먼저 자궁내막을 손상시키기 위해 5분 동안 절대 에탄올을 주입하여 SD 쥐에 TE 모델을 확립했습니다. 이 방법은 자궁내막 성장을 제한하지만, 종종 복강에 심각한 유착을 일으켜 생존율이 70%에 불과합니다.

이전에는 95% 에탄올이 적용이 용이하여 쥐에서 주로 사용되었지만, 이 방법은 TE 연구를 위한 마우스 모델을 거의 생성하지 못했습니다. 임상적 관찰, 종합적인 문헌 검토, 사전 실험, 반복적인 토론 및 분석을 거쳐 자궁 주입 시간을 단축하는 개선된 방법이 개발되었습니다. 숙련된 기술을 통해 95% 에탄올을 자궁강에 주입하여 주입 시간이 다양한 TE 모델을 만들 수 있습니다.

본 연구에서 소개한 마우스 모델은 Gao의 모델²⁴의 원리를 기반으로 합니다. 그러나 에탄올 주입 시간을 단축하고 식염수 세척 빈도를 늘리는 등 몇 가지 수정이 이루어졌습니다. 이 모델에서는 복부 박리를 통해 쥐의 자궁을 노출시키고 1분, 2분, 3분, 4분, 5분 등 다양한 시간 동안 95% 에탄올을 자궁 뿔의 한쪽에 주입했습니다. 에탄올 주입 시간에 대한 정밀한 제어와 표준화된 절차 덕분에 마우스 실험에서 안정적인 데이터를 얻을 수 있었고, 이는 마우스 간의 개인차에 따른 편차를 최소화했습니다.

조직학적 결과는 TE 마우스에서 자궁내막 두께, 자궁내막샘 수 및 자궁내막 섬유증의 명확한 변화를 다양한 정도로 보여주며, 이는 본 연구에서 확립된 모델의 신뢰성을 확인시켜줍니다 ^3,6,9. 특히, 에탄올 주입 시간이 4분 또는 5분을 초과하는 경우 심각한 자궁내 유착(IUA)이 관찰되었습니다. 이러한 결과는 TE 마우스 모델이 1-3분의 95% 에탄올 주입으로 효과적으로 확립될 수 있는 반면, 주입 시간이 3분을 초과하면 심각한 IUA를 유발할 수 있음을 시사합니다.

현재까지 TE를 연구하기 위해 긁힘, 허혈, 열 유도 및 화학 유도 모델을 포함한 여러 동물 모델이 개발되었습니다. 긁힘으로 유도된 모델은 수행하기가 더 쉽지만 TE보다는 자궁 내 유착(IUA)으로 이어지는 경우가 많습니다. 허혈 유도 TE 모델은 화학적 유도 모델보다 훨씬 더 긴 지속 시간이 필요하며, 열 유도 방법은 화학적 유도에 비해 더 복잡하고 실행하기 어렵습니다. 화학 물질 유도 모델은 시간 효율적이고 안정적이지만 동물에 대한 외상 및 부적절한 기술로 인한 감염 또는 사망 위험과 같은 잠재적인 제한이 있습니다. 이러한 문제는 신중한 교육과 경험으로 완화할 수 있습니다.

결론적으로, 본 연구 결과는 95% 에탄올을 1-3분 동안 자궁강에 주입함으로써 TE 마우스 모델을 효과적으로 확립할 수 있음을 보여줍니다. 이 접근 방식은 TE의 병리학적 메커니즘 및 복구 과정을 연구하고 이 상태를 가진 환자를 위한 효과적인 치료법을 개발하기 위한 유망한 방법을 제공합니다.

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중요하고 도움이 되는 의견을 주신 익명의 심사위원님들께 감사드립니다. 이 작업은 선전시(Shenzhen Science and Technology Project, No. JCYJ20220818103207016) 및 광둥성 기초 및 응용 기초 연구 재단(No. 2024A1515010478)을 통해 설립되었다.