建立薄子宫内膜的小鼠模型

本文描述了一种详细的方案，通过在 1-3 分钟内将 95% 乙醇注射到小鼠子宫中来产生可靠且可重复的薄子宫内膜，具有非常低的死亡率和最小的宫腔粘连。

子宫内膜薄 （TE） 已被广泛认为是导致不孕症的关键原因。然而，TE 的发病机制仍不清楚，仍然迫切需要令人满意的治疗方案。已经开发了几种 TE 动物模型，但涉及腹部手术和注射 95% 乙醇的小鼠模型提出了巨大的挑战，因为如果作不当，死亡率高且有宫腔粘连的风险。在这里，我们描述了一种详细的方案，该方案通过以不同的输注时间将 95% 乙醇注射到小鼠子宫中，产生可靠且可重复的 TE，死亡率非常低，宫腔粘连最小。结果表明，所有小鼠都成功发展了 TE，输注时间在 1-3 分钟之间，其特征是子宫内膜厚度和腺体数量的典型减少，以及子宫内膜纤维化过度。这些发现表明，这种小鼠模型适用于研究薄子宫内膜，可以作为开发未来 TE 治疗的平台。

子宫内膜薄 （TE） 是妇产科的一种严重疾病，经常影响育龄妇女。当超声扫描显示子宫内膜厚度小于 7 毫米，伴有正常的子宫腔时，可诊断为 TE，并且与妊娠失败密切相关 ^1,2。据估计，大约 1.5%-9.1% 接受体外受精 （IVF） 治疗的女性会经历 TE，这使其成为生殖医学中越来越大的挑战 ^3,4,5。TE 最常见的原因包括手术分离宫腔粘连 （IUA） 和刮宫术后子宫内膜修复不当，这通常伴有血管分布中断和腺体稀疏 ^6,7,8。迄今为止，TE 的细胞和分子机制仍不清楚。TE 患者的子宫内膜恢复非常耗时，尽管已探索将雌激素治疗和低剂量阿司匹林治疗作为潜在的干预措施⁹。因此，深入研究 TE 的发病机制是应对这种情况挑战的最直接方法。然而，关于 TE 发病机制的研究依赖于动物模型，因此选择合适的模型至关重要。

薄子宫内膜 （TE） 的大多数组织病理学研究表明，上皮细胞和巨噬细胞增殖受损、卵巢类固醇激素受体表达降低、细胞外基质过度沉积和细胞衰老是 TE 最显着的病理特征 ^6,9,10。目前，已经开发了各种大鼠模型来模拟 TE，包括抓挠^11、12、13、缺血¹⁴、热损伤¹⁵ 和化学损伤^{16、17、18、19} 诱导的模型。大鼠模型是通过用针头或导管抓挠子宫内膜来诱导的，这通常会导致宫腔粘连 （IUA） 而不是 TE 11,12,20,21,22。还报道了大鼠缺血诱导的 TE 模型，其中子宫内膜缺血是通过进行双侧子宫动脉结扎来实现的，导致子宫内膜厚度减小。然而，这种方法很耗时，需要三个月的时间，并且没有广泛用于研究¹⁴。在热损伤诱导模型中，使用人工授精管通过子宫角两侧的汇合处将 85 °C 预热的水注入子宫角的一侧，使其比其他方法更复杂¹⁵。化学诱导模型包括将 95% 的乙醇注射到暴露的子宫角中以损害整个子宫内膜。该模型具有成本低、实验周期短等优点，可用于研究 TE 中的病理机制和治疗，但它主要用于大鼠而不是小鼠 16,17,23。尽管存在各种动物模型，尤其是大鼠模型，但每种模型都有其局限性。它们只能模拟 TE 的某些方面，很少有小鼠模型能紧密复制 TE 的疾病特征，同时也方便且用途广泛，可用于研究。

在这种情况下，我们通过使用时间梯度方法和改进的方法²⁴ 将 95% 乙醇注入子宫腔，开发了一种新的薄子宫内膜 （TE） 小鼠模型（图 1）。结果显示，当输注时间在 1-3 min 之间时，所有小鼠都成功发展了 TE，表现出子宫内膜厚度减少、腺体缩小和子宫内膜纤维化增加等典型特征。这些发现表明，我们的小鼠模型是研究 TE 的合适工具，可以作为开发未来 TE 治疗的平台。

这项研究得到了深圳中山妇产科医院（原深圳中山泌尿外科医院）机构动物护理和使用委员会的批准，所有的动物实验都在那里进行。本研究使用雌性 C57BL/6 小鼠 （年龄 6-8 周，体重 18-20 g）。将所有动物饲养在同一房间的无特定病原体 （SPF） 环境中，并在实验前在 （22 ± 1） °C 的无特定病原体的房间中在 12 小时的光照/黑暗循环下适应一周。他们可以免费获得食物和水。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 发情的鉴定

注意：小鼠的发情期与人类的黄体晚期相当，此时子宫内膜内膜相对较厚。选择发情期小鼠进行模型诱导，确保它们处于相对一致的生理状态。此外，当子宫内膜厚度相对较厚时，子宫内膜变薄的结果更为明显。有关此过程的详细信息，请参阅以前发布的报告^25,26。

1. 使用移液管准备 20 μL 盐水。通过抓住鼠标耳朵的两侧并固定鼠标的尾巴，将移液器的尖端轻轻插入阴道口，深度约为 2 毫米。将 20 μL 生理盐水注入阴道并轻轻冲洗 5 个循环。
2. 取出盐水并将其均匀地转移到干净的载玻片上。让它在室温下蒸发并自然干燥。
3. 向每张载玻片上涂抹 30 μL 乙醇以固定细胞。让乙醇蒸发 5 分钟，直到载玻片干燥。
4. 将 50 μL 结晶紫染色溶液涂在每个载玻片上，并在室温下对细胞染色 10 分钟。
5. 用去离子水冲洗每张载玻片，以去除多余的染料并减少非特异性染色。
6. 观察细胞形态并在显微镜下确定细胞类型的比例。
7. 连续两次观察小鼠的发情周期，以确保稳定性。选择处于第三个发情期的小鼠进行实验。
   注意：小鼠的发情周期通常持续 4-5 天，分为四个阶段：发情前、发情、发情和发情。发情前期持续约 24 小时，其特征是圆形至椭圆形有核上皮细胞（图 2A）。发情持续 12 小时至 48 小时，其特征是主要为无核角化上皮细胞（图 2B）。Metestrus 持续长达 24 小时，其特征是无核角化上皮细胞和中性粒细胞的混合物（图 3C）。发情期持续 48 小时至 72 小时，其特征是中性粒细胞、有核上皮细胞和一些去核角化细胞的组合（图 2D）。

2. 群组设计

注意：为了评估不同持续时间的 95% 乙醇输注对 TE 模型稳定性的影响，建立了六个治疗组。一组接受了没有乙醇给药的假手术，以作为手术效果的对照。根据输注时间将乙醇诱导的 TE 小鼠随机分为 5 个治疗组 （每组 n = 5），如下所示：

1. 1 分钟组：将乙醇注射到子宫腔中 1 分钟。
2. 2 分钟组：将乙醇注射到子宫腔中 2 分钟。
3. 3 分钟组：将乙醇注射到子宫腔中 3 分钟。
4. 4 分钟组：将乙醇注射到子宫腔中 4 分钟。
5. 5 分钟组：将乙醇注射到子宫腔中 5 分钟。

3. 小鼠 TE 模型的诱导

1. 使用含有 5% 异氟醚和 100% 氧气的麻醉机麻醉小鼠 3 分钟（遵循机构批准的方案）。使用鼻锥将麻醉维持在 1%-3% 异氟醚。在小鼠的眼睛上涂抹兽药膏，以防止麻醉时干燥。在整个手术过程中，通过捏住脚趾来监测呼吸频率。
2. 使用医用胶带固定小鼠的四肢，并将它们仰卧在用电子毯预热的手术台上。轻轻拉动小鼠的舌头以防止气道阻塞。
   注意：在手术期间让小鼠保持温暖有助于维持免疫功能和血液循环，并防止凝血。此外，拔出小鼠的舌头可确保呼吸道畅通，以避免麻醉期间窒息。
3. 将动物脱毛霜涂抹在小鼠的下腹部 3 分钟。用干净的湿巾去除头发。用 75% 乙醇和碘伏对该区域进行消毒。
4. 在腹部切开 1 厘米，距离尿道口 1 厘米。使用无菌剪刀和镊子将切口向下延伸到腹膜腔。
5. 用无菌镊子轻轻地将内脏移到一边，以找到子宫并露出右子宫角。在靠近子宫颈的近端和靠近卵巢的远端应用止血夹。
   注意：夹住子宫角的两端可确保乙醇注射过程中无泄漏，防止对子宫颈、阴道和卵巢造成损伤。
6. 使用 50 G 注射器将大约 25 μL 的 95% 乙醇²⁷ 滴入子宫腔，针头平行于子宫角的方向。将针头以 30 度角插入子宫腔。根据需要将注射器保持 1 分钟、2 分钟、3 分钟、4 分钟或 5 分钟。取出乙醇并用无菌盐水冲洗子宫腔 5 次，以去除任何残留的乙醇。同样，按照相同的程序将等体积的无菌盐水作为对照滴入左子宫角。
   注意： 确保注射器针头与子宫角的方向平行。避免以太陡的角度插入针头，以防止其穿过整个子宫角。尽可能完全抽出乙醇，以避免持续损伤和实验不稳定。
7. 取下夹子，将子宫和内脏放回原来的位置。
8. 用 5-0 可吸收聚乙二醇手术缝合线缝合腹膜，然后用 5-0 不可吸收聚乙二醇手术缝合线缝合表皮。
9. 用 75% 乙醇和碘伏对切口进行消毒，然后将动物放回笼子中。手术后，密切观察小鼠的心率是否逐渐稳定增加，直到小鼠完全恢复并能正常移动（图 3A-H）。
   注意：口服镇痛药（饮用水中 3.2 mg/mL 对乙酰氨基酚）在手术前一天提供，并在研究的剩余时间内持续使用。
10. 每天 9：00 和 15：00 观察小鼠，并用碘伏消毒切口，以确保它们处于良好状态。

4. 样本采集

1. 在 95% 乙醇处理后 7 天（遵循机构批准的方案）在深度麻醉下通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
2. 使用手术剪刀剪断缝合线以露出子宫。
3. 使用手术钳小心缓慢地提取整个子宫。将子宫与周围的内脏分离。
4. 立即取出两个子宫角，将每个角分成 3-4 小段。
5. 使用移液管向 1.5 mL 微量离心管中加入 1 mL 4% 多聚甲醛。将子宫组织在 4% 多聚甲醛中保存 24 小时以进行固定。

5. 组织脱水

注：使用自动组织脱水机实现组织脱水（参见 材料表）。

1. 将福尔马林固定的样品放入组织盒中。
2. 通过一系列增加乙醇浓度转移组织盒以使组织脱水，如下所示：70% 乙醇 1 小时，85% 乙醇 1 小时，95% 乙醇两次（每次 1 小时）和 100% 乙醇两次（每次 1 小时）。
3. 用 100% 二甲苯代替乙醇（第一次浸泡 135 分钟，随后每次浸泡两次 20 分钟）以确保石蜡穿透组织。
4. 将组织盒浸入60-65°C培养箱中的石蜡中（3次，每次140分钟），并保持盒温暖直至包埋。

6. 石蜡包埋

注：使用模块化组织包埋中心执行这些步骤（参见 材料表）。

1. 用加热至 55 °C 的熔融石蜡填充蜡模具。
2. 使用加热的镊子将浸润的片段从包埋盒快速转移到蜡模中，确保每个片段的横截面平行于模具底部。
3. 一旦片段正确定位，将包埋盒的底部放在组织学模具的顶部。
4. 将模具直接放在设置为 4 °C 的冷却板上至少 20 分钟，以使石蜡凝固。
5. 蜡凝固后，从模具中取出样品，并使用石蜡修剪器修剪掉周围多余的蜡。

7. 石蜡切片

1. 准备 42 °C 的水浴。 切割前将石蜡块放在冷板上，让它们冷却并变得更容易修剪。
2. 将石蜡包埋的标本夹在旋转切片机上，组织表面朝上。
3. 切片 20 μm，以去除覆盖组织的多余石蜡，直到达到所需的组织平面。
4. 一次切割 4 μm 切片。
5. 将石蜡切片的色带转移到 42 °C 温水浴中 2 分钟。
6. 从水面上捡起切片，展开后将它们放在显微镜载玻片上。
7. 将载玻片在 60 °C 培养箱中干燥 30 分钟。

8. 苏木精和伊红染色

注：苏木精和伊红染色是使用自动载玻片染色机进行的（参见 材料表）。

1. 在开始染色程序之前，请提前准备所有试剂。
2. 将载玻片分别浸泡在 100% 二甲苯中 10 分钟、5 分钟和 3 分钟。
3. 在去离子水中以递减的乙醇系列再水化载玻片，如下所示：100% 乙醇、95% 乙醇（两次）和 80% 乙醇，每次 2 分钟。
4. 用去离子水冲洗载玻片。
5. 将载玻片在苏木精溶液中染色 10 分钟。用去离子水冲洗玻片 1 分钟或直到水不再呈紫色。
6. 将载玻片浸入 0.5% 酸性乙醇分化溶液中两次，每次 3-5 秒。用去离子水冲洗载玻片 1 分钟。
7. 将玻片置于发蓝缓冲液（1% 氨溶液）中 1 分钟。用去离子水冲洗载玻片 1 分钟。
8. 用 80% 乙醇脱水载玻片，然后将其浸入 eosin-Y 工作溶液中 10 秒。
9. 将载玻片转移到 95% 乙醇中，每次冲洗两次，每次 10 秒。然后，将载玻片转移到无水乙醇中，并脱水两次，每次 10 秒。
10. 将载玻片浸入 100% 二甲苯中以清除组织两次，每次 2 分钟。
11. 将盖玻片放在组织上并用天然树脂密封。

9. 马森染色

1. 通过将载玻片分别浸泡在 100% 二甲苯中 10 分钟、5 分钟和 3 分钟来脱蜡组织。
2. 脱蜡后，将载玻片浸泡在去离子水中的递减乙醇系列中：100% 乙醇、95% 乙醇（两次）和 80% 乙醇，每次 2 分钟。
3. 用去离子水冲洗载玻片。
4. 将载玻片在 Weigert 苏木精铁溶液中染色 5 分钟，然后用去离子水洗涤载玻片 30 秒。
5. 通过将载玻片在 1% 盐酸醇中孵育 15 秒来区分染色组织结构的颜色。
6. 用去离子水冲洗载玻片 30 秒。
7. 将组织在 Bluing 溶液中孵育 3-5 分钟。
8. 用去离子水冲洗载玻片 30 秒。
9. 将载玻片置于丽春红酸品红溶液中 5-10 分钟。
   注意：将去离子水和弱酸溶液以 2：1 的比例混合，以制备弱酸工作溶液。
10. 用弱酸工作溶液冲洗载玻片 30 秒。
11. 在磷钼酸溶液中区分组织 1-2 分钟，然后用弱酸工作溶液冲洗切片 30 秒。
12. 用苯胺蓝溶液对组织切片染色 1-2 分钟。
13. 在 95% 乙醇中快速脱水组织切片 2-3 秒，然后用 100% 乙醇两次，每次 5-10 秒。在二甲苯中清除载玻片两次，每次 1-2 分钟。
14. 将盖玻片放在组织上并用天然树脂密封。
15. 排干多余的树脂，让玻片干燥。

10. 成像和分析

1. 使用玻片扫描仪系统捕获切片的图像。
   注意：使用 4 倍或 10 倍物镜概述各部分;要获得更详细的图像，请使用 20 倍到 100 倍的物镜。
2. 使用 HALO 图像分析平台对子宫内膜厚度、腺体数量和组织纤维化程度进行定量分析。
   注意：通过在 5 个随机选择的视野中测量从子宫腔到子宫肌层的垂直距离来获得平均厚度。

11. 统计分析

1. 使用 SPSS 版本 23.0（SPSS Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥）进行统计分析。
2. 通过首先执行正态分布检验来评估对照组和模型组之间实验差异的统计显着性。
3. 呈现正态分布为 SEM ±平均值的数据。
4. 使用单因素方差分析分析来自不同治疗组的数据。使用 Bonferroni 方法调整每个基因座中测试等位基因数量的多重比较。将 P 值 <0.05 视为具有统计显著性。

薄子宫内膜 （TE） 的主要特征是子宫内膜厚度和腺体密度降低，以及子宫内膜纤维化增加。这种方法成功地在模型小鼠中复制了这些特征。数据分析显示，1 min 组 （222.3 μm ± 13.96 μm vs. 359.2 μm ± 12.41 μm， P < 0.05）、2 min 组 （168.7 μm ± 17.57 μm vs. 359.2 μm ± 12.41 μm，P < 0.05） 和 3 min 组 （131.8 μm ± 3 μm vs. 359.2 μm ± 12.41 μm， P < 0.05）。然而，在 2 分钟和 3 分钟组之间未观察到子宫内膜厚度的显着差异 （168.7 μm ± 17.57 μm vs. 131.8 μm ± 3 μm，P > 0.05）（图 3A，B）。

与对照组相比，1 min 组 （4.4 ± 2.38 vs. 24.4 vs. 24.4 ± 1.6，P < 0.05）、2 min 组 （0.8 ± 0.49 vs. 24.4 vs. 24.4 ± 1.6，P < 0.05）和 3 min 组 （4.4 ± 3.20 vs. 24.4 ± 1.6，P < 0.05）显着减少。 然而，在 1 min 、 2 min 和 3 min 组之间未观察到子宫内膜腺体数量的显著差异。

由于 TE 发生在用 95% 乙醇治疗 7 天后，因此假设子宫内膜厚度可能与输注持续时间有关。为了研究这一点，另外两组分别用 95% 乙醇处理 4 分钟和 5 分钟。有趣的是，当输注时间增加时，结果显示严重的子宫粘连。（图 4），子宫腔变得几乎不可见。此外，随着输注时间的延长，在小鼠子宫中没有观察到子宫内膜腺（图 4）。

此外，子宫内膜纤维化水平随着 95% 乙醇输注的持续时间而增加，这通过 Masson 染色证实，表明受损子宫内膜纤维化过度（图 5A、B）。

图 1：TE 小鼠模型建立流程图。 整个过程包括以下步骤：首先，让小鼠在实验前 1 周适应。接下来，监测两个发情周期。然后通过将 95% 乙醇注射到子宫腔中来选择第三发情期的小鼠进行模型建立。乙醇注射后 7 天，处死小鼠，收集子宫角用于进一步的 HE 染色和 Masson 染色分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：小鼠发情的鉴定。 （A） 前发情的特征是有核上皮细胞占优势（箭头）。（B） 发情的特征是以无核角化上皮细胞（星号）为主。（C） Metestrus 的特征是无核角化上皮细胞和中性粒细胞（三角形）的组合。（D） Diestrus 的特征是中性粒细胞、有核上皮细胞和少量无核角化细胞的组合。物镜放大倍率为 20 倍。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 3：通过 95% 乙醇输注诱导 TE 的程序。 （A） 使用麻醉机麻醉小鼠。（B） 去除腹部毛发。（C） 在距离尿道口 1 cm 处做一个 1 cm 的切口。（D） 子宫位于子宫位置，子宫角的一侧暴露在外。（E） 止血夹应用于子宫角的两侧。（F） 将 95% 乙醇滴入子宫角，然后用无菌盐水冲洗。（G） 取下夹子，将子宫放回原处。（H） 缝合切口。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：在显微镜下使用 HE 染色观察小鼠的子宫内膜形态。 （A） 检查受伤侧和对照侧子宫内膜的形态。右侧子宫注射 95% 乙醇，而左侧子宫注射无菌生理盐水作为对照。比例尺 = 200 μm。（B） Con 组、1 min、2 min 和 3 min 组子宫内膜厚度的比较。（C） Con 组、1 min、2 min、3 min、4 min 和 5 min 组子宫内膜腺体数量的比较。Con， 控制;**P < 0.01，****P < 0.0001，使用单因子方差分析。数据表示为平均值±平均值的标准误差。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：小鼠子宫内膜中的子宫内膜纤维化。 （A） Masson 三色染色用于评估指定治疗组中的子宫内膜纤维化，其中蓝色表示胶原纤维的分布。比例尺 = 200 μm。（B） 总结条形图显示了不同组之间的胶原纤维化水平。**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，使用单因子方差分析。数据表示为平均值±平均值的标准误差。 请单击此处查看此图的较大版本。

TE 的特征是细胞增殖不足和细胞功能障碍，与不孕症、复发性流产和胎盘异常密切相关 ^2,3。不幸的是，目前没有针对 TE 的有效疗法。动物模型在研究这种情况中起着至关重要的作用。2014 年至 2024 年间，在 208,000 项研究（34,200 项研究）中，有 16.4% 的大鼠被用作模式生物，在 22.7%（47,300 项研究）中，大鼠被用作模式生物。小鼠在实验中的使用增加可归因于它们相对于其他模型的优势，特别是它们在再生研究中的潜力 28,29,30。鉴于模型一致性的重要性，越来越需要更兼容的工具来使用小鼠作为模型进行研究³¹。

正如以前的研究报道的那样，诱导 TE 模型的常见方法包括抓挠^11,12、缺血¹⁴、热诱导损伤¹⁵ 和化学诱导损伤^16,17,23。为了促进动物模型在 TE 研究中的应用并为有效治疗奠定基础，Gao 等人 ²⁴ 首先通过注射无水乙醇 5 分钟来损伤子宫内膜，在 SD 大鼠中建立了 TE 模型。虽然这种方法限制了子宫内膜生长，但它经常导致腹腔严重粘连，存活率仅为 70%。

以前，由于 95% 乙醇易于应用，主要用于大鼠，但这种方法很少产生用于 TE 研究的小鼠模型。经过临床观察、全面的文献回顾、前实验、反复讨论和分析，开发了一种子宫输注时间更短的改进方法。熟练的技术允许将 95% 的乙醇注射到子宫腔中，以创建具有不同输注时间的 TE 模型。

本研究中介绍的小鼠模型建立在 Gao 模型²⁴ 的原理之上。然而，进行了一些修改，包括缩短乙醇输注时间和增加盐水冲洗频率。在该模型中， 通过 腹部解剖暴露小鼠子宫，并将 95% 乙醇注射到子宫角的一侧，持续 1 min、2 min、3 min、4 min 和 5 min。由于对乙醇输注时间的精确控制和标准化程序，小鼠实验获得了稳定的数据，从而最大限度地减少了由于小鼠个体差异而导致的偏差。

组织学结果表明，TE 小鼠子宫内膜厚度、子宫内膜腺体数量和子宫内膜纤维化发生不同程度的明显变化，证实了本研究中建立的模型的可靠性 ^3,6,9。值得注意的是，当乙醇输注时间超过 4 min 或 5 min 时，观察到严重的宫腔粘连 （IUA）。这些发现表明，95% 乙醇输注 1-3 分钟可以有效建立 TE 小鼠模型，而输注时间超过 3 分钟可能会诱导严重的 IUA。

迄今为止，已经开发了几种动物模型来研究 TE，包括抓挠、缺血、热诱导和化学诱导模型。搔抓诱导模型虽然更容易执行，但通常会导致宫腔粘连 （IUA） 而不是 TE。缺血诱导的 TE 模型需要比化学诱导模型更长的持续时间，并且与化学诱导相比，热诱导方法更复杂且更难执行。尽管化学诱导模型既省时又稳定，但它确实存在潜在的局限性，例如对动物的创伤以及由于技术不当而导致感染或死亡的风险。这些问题可以通过仔细的培训和经验来缓解。

总之，结果表明，将 95% 乙醇注入子宫腔 1-3 min 即可有效建立 TE 小鼠模型。这种方法为研究 TE 的病理机制和修复过程以及为患有这种疾病的患者开发有效的治疗方法提供了一种有前途的方法。

作者没有什么可披露的。

我们衷心感谢匿名审稿人的重要和有益的评论。这项工作得到了深圳市科技项目 （No.JCYJ20220818103207016） 和广东省基础与应用基础研究基金 （No. 2024A1515010478）。