Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

Kan-beyin bariyeri (BBB), istikrarlı ve sağlıklı bir beyin ortamının sürdürülmesinde çok önemli bir role sahiptir. BBB disfonksiyonu birçok nörolojik hastalıkla ilişkilidir. Serebrovasküler patolojiyi, BBB bütünlüğünü ve BBB'nin genetik ve hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini araştırmak için BBB'nin 3 boyutlu, kök hücre türevli bir modelini geliştirdik.

Kan-beyin bariyeri (BBB), merkezi sinir sisteminin (CNS) önemli bir fizyolojik bileşenidir, besinleri korur, atıkları temizler ve beyni patojenlerden korur. BBB'nin doğal bariyer özellikleri, nörolojik hastalıkları tedavi etmek için CNS'ye terapötik ilaç verilmesi için bir zorluk teşkil etmektedir. Bozulmuş BBB fonksiyonu nörolojik hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Serebral amiloid anjiyopati (CAA), serebral vaskülatürde amiloidin birikmesi ve riskli bir BBB'ye yol açması, Alzheimer hastalığının (AD) çoğu vakasında bir komorbiditedir ve BBB disfonksiyonunun veya bozulmasının nörodejenerasyonda rol oynayabileceğini düşündürür. İnsan BBB dokusuna sınırlı erişim nedeniyle, uygun BBB fonksiyonuna ve BBB dejenerasyonuna katkıda bulunan mekanizmalar bilinmemektedir. Bu sınırlamaları ele almak için, endotel hücrelerini, perisitleri ve astrositleri bir 3D matriste birleştirerek insan pluripotent kök hücre türevi bir BBB (iBBB) geliştirdik. iBBB, BBB'de bulunan anatomiyi ve hücresel etkileşimleri özetlemek için kendi kendine toplanır. iBBB'lerin amiloid ile tohumlanması, CAA'nın önemli yönlerini yakalar. Ek olarak, iBBB, genetik ve yaşam tarzının hastalık riskini nasıl etkilediğini araştırmak için serebrovasküler hastalık ve nörodejenerasyonda rol oynayan genetik ve çevresel faktörleri modüle etmek için esnek bir platform sunar. Son olarak, iBBB, CNS'ye terapötik iletimi optimize etmek için ilaç taraması ve tıbbi kimya çalışmaları için kullanılabilir. Bu protokolde, insan pluripotent kök hücrelerinden kaynaklanan üç tip hücrenin (endotel hücreleri, perisitler ve astrositler) farklılaşmasını, farklılaşmış hücrelerin iBBB'ye nasıl birleştirileceğini ve ekzojen amiloid kullanılarak CAA'nın in vitro olarak nasıl modelleneceğini açıklıyoruz. Bu model, hem biyolojik sadakate hem de deneysel esnekliğe sahip bir sistemle canlı insan beyin dokusunu incelemenin zorluğunun üstesinden gelir ve insan BBB'sinin ve nörodejenerasyondaki rolünün sorgulanmasını sağlar.

Kan-beyin bariyeri (BBB), uygun nöronal fonksiyon için ideal bir ortam sağlamak için merkezi sinir sistemini (CNS) çevreden ayıran önemli bir mikrovasküler ağdır. Metabolik homeostazı 1,2,3,4 koruyarak, atıkları ^{temizleyerek 4,5,6} ve beyni patojenlerden ve toksinlerden^{koruyarak 7,8} maddelerin CNS'ye akışını ve akışını düzenlemede kritik bir role sahiptir.

BBB'nin birincil hücre tipi endotel hücresidir (EC). Mezoderm soyundan türetilen endotel hücreleri, vaskülatür ^1,9'un duvarlarını oluşturur. Mikrovasküler EC'ler, membranlarının 10,11,12,13,14 geçirgenliğini büyük ölçüde azaltmak için birbirleriyle sıkı bağlantılar oluştururken, besinlerin CNS'ye girip çıkmasını kolaylaştırmak için taşıyıcıları eksprese eder ^1,4,12,14. Mikrovasküler EC'ler, mikrovasküler fonksiyonu ve homeostazı düzenleyen perisitler (PC'ler)-duvar hücreleri ile çevrilidir ve BBB'nin moleküllere ve bağışıklık hücrelerine geçirgenliğini düzenlemek için kritik öneme sahiptir 15,16,17. Majör bir glial hücre tipi olan astrosit, BBB'yi oluşturan son hücre tipidir. Astrosit uç ayakları EC-PC vasküler tüplerinin etrafını sararken, hücre gövdeleri beyin parankimine uzanarak nöronlar ve damar sistemi¹ arasında bir bağlantı oluşturur. Farklı çözünen ve substrat taşıyıcıları, BBB fonksiyonu^{18,19,20,21'de} kritik bir role sahip olan astrosit uç ayaklarında (örneğin, aquaporin 4 [AQP-4]) lokalizedir.

BBB, uygun beyin sağlığı fonksiyonunun sürdürülmesinde kritik öneme sahiptir ve Alzheimer hastalığı (AD)22,23,24,25, multipl skleroz 7,26,27,28, epilepsi ^29,30 ve inme^31,32 dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıkta BBB'nin işlev bozukluğu bildirilmiştir . Serebrovasküler anormalliklerin nörodejenerasyonda merkezi bir rol oynadığı ve iskemik ve hemorajik olaylara duyarlılığın artmasına katkıda bulunduğu giderek daha fazla kabul edilmektedir. Örneğin, AD hastalarının %90'ından fazlasında serebral amiloid anjiyopati (CAA), serebral vaskülatür boyunca amiloid β (Aβ) birikimi ile karakterize bir durumdur. CAA, BBB geçirgenliğini arttırır ve BBB fonksiyonunu azaltır, CNS'yi iskemi, hemorajik olaylar ve hızlandırılmış bilişsel gerilemeye karşı savunmasız bırakır³³.

Yakın zamanda, bir 3D matriste kapsüllenmiş EC'leri, PC'leri ve astrositleri içeren, hasta kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen insan BBB'sinin in vitro bir modelini geliştirdik (Şekil 1A). iBBB, vasküler tüp oluşumu ve astrosit uç ayaklarının vaskülatür²⁴ ile lokalizasyonu dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili etkileşimleri özetler. APOE4'ün aracılık ettiği CAA duyarlılığını modellemek için iBBB'yi uyguladık (Şekil 1B). Bu, APOE4'ün CAA'yı teşvik ettiği nedensel hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamamızı ve CAA patolojisini azaltan ve APOE4 farelerinde in vivo öğrenme ve hafızayı geliştiren terapötik stratejiler geliştirmek için bu içgörülerden yararlanmamızı sağladı²⁴. Burada, BBB'yi insan iPSC'lerinden yeniden yapılandırmak ve CAA'yı in vitro modellemek için ayrıntılı bir protokol ve video eğitimi sunuyoruz.

1. iPSC'leri iBBB hücrelerine ayırma

NOT: Bu farklılaşma protokolleri daha önce Mesentier-Louro ve ^ark.34'te tanımlanmıştır.

1. Hücre kültürü plakalarının kaplanması
   1. Azaltılmış büyüme faktörü (GF) membran matrisini gece boyunca 4 °C'de çözdürün. 500 μL bazal membran matrisini 49.5 mL DMEM ile seyreltin. Kaplama çözeltisinin erken polimerizasyonunu önlemek için bu çözeltiyi soğuk tutun.
   2. 6 oyuklu doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakanın oyuğu başına 1-2 mL ekleyin. Kaplama solüsyonunu uygun ısıtılmış kültür ortamıyla değiştirmeden önce 37 °C'de en az 20 dakika bekletin.
2. İnsan iPSC'lerinin ETV2 ile indüklenebilir endotel hücrelerine farklılaşması
   Süre: 8 gün
   NOT: Bu protokol Blanchard ve ^ark.24 ve Qian ve ^ark.35'ten uyarlanmıştır. Verimi artırmak için Wang ve ^ark.36 tarafından tarif edildiği gibi, transkripsiyon faktörü ETV2'nin doksisiklin ile indüklenebilir ekspresyonunu kullanıyoruz. ETV2, PiggyBac plazmidi yoluyla tanıtıldı ve hücreler daha sonra transfekte edildi.
   1. Hücreler ~%70 birleşmeye ulaşana kadar besleyici içermeyen pluripotent kök hücre ortamında indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde kültür iPSC'leri.
      NOT: İndüklenebilir iPSC'lerin PiggyBac plazmidi (yani puromisin) seçimi ile korunmasını öneririz
   2. Gün 0: Hücreleri 5 dakika boyunca bir proteaz-kollajenaz karışımı ile ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının kök hücre ortamına 1:3 oranında sahip konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini kök hücre ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri, 10 μM Y27632 ile desteklenmiş kök hücre ortamında azaltılmış GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine 20.800 hücre /^cm2'de plakalayın.
   3. 1. Gün: Ortamı DeSR1 [DMEM / F12 + glutamin takviyesi, 1x Minimum Esansiyel Orta Esansiyel Olmayan Amino Asitler (MEM-NEAA),% 1 penisilin-streptomisin (P / S)], 10 ng / mL BMP4, 6 μM CHIR99021 ve 5 μg / mL doksisiklin ile desteklenmiştir.
   4. 3. Gün: Ortamı 5 μg/mL doksisiklin ile takviye edilmiş DeSR2 [DMEM/F12 + glutamin takviyesi, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, %1/S] ile değiştirin.
   5. 5. Gün: Ortamı 50 ng / mL VEGF-A, 2 μM forskolin ve 5 μg / mL doksisiklin ile desteklenmiş hECSR [İnsan Endotelyal Serumsuz Ortam, 1x MEM-NEAA, 1x B-27,% 1 P / S] ile değiştirin.
   6. 7. Gün: Ortamı 50 ng / mL VEGF-A, 2 μM forskolin ve 5 μg / mL doksisiklin ile desteklenmiş hECSR ile değiştirin.
   7. 8. Gün: ECs 1:3'ü bir proteaz-kollajenaz karışımı ile bölün ve 50 ng/mL VEGF-A ve 5 μg/mL doksisiklin ile desteklenmiş hECSR'de taze indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalara yeniden tohumlayın.
      NOT: Bu, tek tip vaskülatür oluşumu için EC'leri iBBB'lere kapsüllemek için en iyi zaman noktasıdır.
   8. 10+ Gün: Hücreleri her 2-3 günde bir 50 ng/mL VEGF-A ve 5 μg/mL doksisiklin ile takviye edilmiş hECSR ile besleyin. Plakalar birleştiğinde hücreleri bir proteaz-kollajenaz karışımı ile 1:3 oranında bölmeye devam edin.
      NOT: iPSC'den türetilen EC'ler, 8. günden itibaren herhangi bir noktada dondurulabilir. Hücreleri geçiş yapıyormuş gibi kaldırın. Peletleri EC dondurma ortamında [% 60 nakavt serum replasmanı (KSR),% 30 hECSR,% 10 DMSO, 50 ng / mL VEGF-A ve 10 μM Y27632] hücreleri 1: 3'e bölerek yeniden süspanse edin ve -80 ° C'de bir dondurma kabı kullanarak dondurun. 50 ng/mL VEGF-A, 5 μg/mL doksisiklin ile desteklenmiş hECSR'de indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine çözdürün.
   9. CD31 / PECAM1 veya VE-kaderine karşı antikorlar kullanarak immünositokimya ile beyin mikrovasküler endotel hücre farklılaşmasını doğrulayın (Şekil 2A).
3. İnsan iPSC'lerinin perisitlere farklılaşması
   Süre: 6 gün
   NOT: Bu protokol Patsch ve ^ark.36'dan uyarlanmıştır.
   1. Hücreler ~%70 birleşmeye ulaşana kadar kök hücre ortamında besleyicisiz koşullarda indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde kültür iPSC'leri.
   2. Gün 0: Hücreleri 5 dakika boyunca bir proteaz-kollajenaz karışımı ile ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının kök hücre ortamına 1:3 oranında sahip konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini kök hücre ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri 37.000-40.000 hücre/^cm2'de (hücre hattına bağlı olarak) 10 μM Y27632 ile takviye edilmiş kök hücre ortamında indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine yerleştirin.
   3. 1. Gün: Ortamı N2B27 [% 50 DMEM / F12 + glutamin takviyesi,% 50 Nörobazal, 1x MEM-NEAA, 0.5x, glutamin takviyesi, 1x N-2, 1x- B-27,% 1 P / S] ile değiştirin 25 ng / mL BMP4 ve 8 uM CHIR99021 ile desteklenmiştir.
   4. 3-4. Günler: Ortamı 2 ng/mL Activin A ve 10 ng/mL PDGF-BB ile desteklenmiş N2B27 ile değiştirin ve günlük olarak besleyin.
   5. 5. Gün: PC'leri bir proteaz-kollajenaz karışımı ile bölün ve 10 ng / mL PDGF-BB ile desteklenmiş N2B27'de 35.000 hücre /^cm2'de % 0.1 jelatin kaplı plakalara tohumlayın.
      NOT: Hücreleri yalnızca birleştikten sonra bölün. Bazı hatların bölünmeye hazır olması için birkaç gün daha gerekebilir; Hücreler birleşene kadar ortamı günlük olarak değiştirmeye devam edin.
   6. Her 2-3 günde bir medya değiştirerek 10 ng/mL PDGF-BB ile desteklenmiş N2B27'deki PC'leri genişletin. Hücreler bir kez daha birleştikten ve ikinci bir geçişten geçtikten sonra PDGF-BB'yi ortamdan çıkarın.
      NOT: Perisitler, ikinci geçişten sonra iBBB'lerde kullanılmaya hazırdır. Genişletildikten sonra PC'ler dondurulabilir. Hücreleri geçiş yapacakmış gibi kaldırın, hücre peletini dondurma ortamında [%90 KSR ve %10 DMSO] yeniden süspanse edin ve -80 °C'de bir dondurma kabı kullanarak dondurun. N2B27'de 35.000 hücre/^cm2'de %0.1 jelatin kaplı plakalar üzerine çözdürün.
   7. PDGFRB ve NG2'ye karşı antikorlar kullanarak immünositokimya ile perisit farklılaşmasını doğrulayın (Şekil 2B).
4. İnsan iPSC'lerinin nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) ve astrositlere farklılaşması
   Zamanlama: Toplam 45 gün (NPC'ler için 15 gün, astrositler için 30 gün)
   NOT: NPC farklılaşma protokolü Chambers ve ^ark.38'den uyarlanmıştır ve astrosit farklılaşması TCW ve ^ark.39'da açıklandığı gibidir.
   1. Hücreler ~%70 birleşmeye ulaşana kadar kök hücre ortamında besleyicisiz koşullarda indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde kültür iPSC'leri.
   2. Hücreleri 5 dakika boyunca bir proteaz-kollajenaz karışımı ile ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının kök hücre ortamına 1:3 oranında sahip konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini kök hücre ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri 100.000 hücre/^cm2'de 10 μM Y27632 ile takviye edilmiş kök hücre ortamında azaltılmış GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine yerleştirin.
   3. Kök hücre ortamını ertesi gün değiştirin. Hücreleri% >95 birleşme noktasına ulaşana kadar (hücre hattına bağlı olarak 3-4 gün) her gün beslemeye devam edin.
   4. NPC Gün 0: Ortamı N2B27 [%50 DMEM/F12 + glutamin takviyesi, %50 Nörobazal, 1x MEM-NEAA, 0.5x, glutamin takviyesi, 1x N-2, 1X-B-27, %1 P/S] ile 10 μM SB43152 ve 100 nM LDN193189 ile tamamlayın.
   5. NPC Günleri 1-9: Hücreleri günlük olarak 10 μM SB43152 ve 100 nM LDN193189 ile desteklenmiş N2B27 ile besleyin.
   6. NPC 10. Gün: NPC'leri proteaz-kollajenaz karışımı ile 1:3 oranında bölün ve 20 ng/mL FGF-bazik ve 10 μM Y27632 ile desteklenmiş N2B27'de taze indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalara tohumlayın.
   7. NPC Günleri 11 - 13: NPC'leri günlük olarak 20 ng/mL FGF-basic ile desteklenmiş N2B27 ile besleyin.
   8. NPC 14. Gün: NPC'leri proteaz-kollajenaz karışımıyla 1:3 oranında bölün ve 20 ng/mL FGF-bazik ve 10 μM Y27632 ile desteklenmiş N2B27'de taze indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalara yeniden tohumlayın.
   9. NPC Gün 15/Astrosit Gün 0: Bu, astrosit farklılaşmasının 0. günüdür. Hücreleri tam Astrosit ortamı () ile besleyin.
      NOT: NPC'ler, 20 ng/mL FGF-bazik ile desteklenmiş N2B27'de tutulabilir ve birleştiğinde geçilebilir. NPC'leri dondurmak için, hücre peletini dondurma ortamında [% 90 KSR ve% 10 DMSO] yeniden süspanse edin, hücreleri 1: 3'e bölün ve -80 ° C'de bir dondurma kabı kullanarak dondurun. 20 ng/mL bFGF ve 10 μM Y27632 ile desteklenmiş N2B27'de indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine çözdürün.
   10. Astrosit Günleri 1-30: Hücreleri her 2-3 günde bir ile besleyin. Hücreler %>90 birleştiğinde,'de taze indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde 15.000 hücre/^cm2'de proteaz-kollajenaz karışımı ve plakası kullanılarak geçiş.
       NOT: Astrositler 30 gün içinde tamamen farklılaşmalıdır. Astrositler, -80 °C'de bir dondurma kabında dondurma ortamında [% 90 KSR ve% 10 DMSO] dondurulabilir. 'de 25.000-35.000 hücre/^cm2'de indirgenmiş GF bazal membran matris kaplı plakalar üzerine çözdürün.
   11. Nestin ve SOX2'ye karşı antikorlar kullanarak immünositokimya ile NPC farklılaşmasını doğrulayın. S100B ve CD44'e karşı antikorlar kullanarak immünositokimya ile astrosit farklılaşmasını doğrulayın (Şekil 2C).

2. iBBB'nin montajı

1. Azaltılmış büyüme faktörü (GF) bazal membran matrisini gece boyunca 4 °C'de çözdürün. iBBB'ler %100 azaltılmış GF bazal membran matrisi içinde kapsüllendiğinden bu matrisi DMEM'de seyreltmeyin. Her iBBB, 50 μL matris gerektirir.
2. Farklılaşmış EC'leri bir proteaz-kollajenaz karışımı ile 37 °C'de 5 dakika ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının hECSR'ye (İnsan Endotelyal Serumsuz Ortam, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, %1 P/S) oranıyla konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini hECSR'de yeniden süspanse edin.
   NOT: 15 mL veya 50 mL'lik konik bir tüp kullanın, bu, ayrışmış hücrelerin ve ortamın hacmini barındıracak kadar büyüktür. Hücreler ayrıca birden fazla tüp arasında bölünebilir ve daha sonra yeniden süspansiyon üzerine yeniden birleştirilebilir.
3. Farklılaşmış PC'leri proteaz-kollajenaz karışımı ile 37 °C'de 5 dakika ayırın. Ayrışmış hücreleri, proteaz-kollajenaz karışımının N2B27'ye 1: 3 oranında konik bir tüpe aktarın (% 50 DMEM / F12 + glutamin takviyesi,% 50 Nörobazal, 1x MEM-NEAA, 0.5x glutamin takviyesi, 1x N-2, 1x B-27,% 1 penisilin-streptomisin [P / S]). Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini N2B27'de yeniden süspanse edin.
4. Farklılaşmış astrositleri proteaz-kollajenaz karışımı ile 37 °C'de 5 dakika ayırın. Ayrışmış hücreleri, Astrosit Ortamını () tamamlamak için proteaz-kollajenaz karışımının 1:3 oranına sahip konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Hücre peletini'de yeniden süspanse edin.
5. Bir hemositometre kullanarak her hücre tipini sayın. Her bir hücre süspansiyonu tipini uygun ortamda 1 × 10⁶ hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
6. Her hücre tipi için hesaplanan hücre sayısını konik bir tüpte birleştirin: 50 μL iBBB, 2,5 × 10⁵ EC, 5 × 10⁴ PC ve 5 × 10⁴ astrosit gerektirir. Pipetleme hatalarını hesaba katmak için hesaplanan hücre sayısından %10 daha fazlasını ekleyin. Hücre karışımını 300 × g'da 3 dakika döndürün.
   NOT: Giriş hücrelerinin kalite kontrolü için sabitlemek ve boyamak için her hücre tipinden kalan bazı hücrelerin 2D monokültürlerde kaplanması şiddetle tavsiye edilir. Her hücre tipini 35.000 hücre/^cm2'de önceden hazırlanmış plakalar üzerine azaltılmış GF bazal membran matrisi ile kaplayın ve 3-4 gün sonra sabitleyin. Hücre tipi spesifik antikorlar için Tablo 1'e bakınız.
7. Hücre peletinden ortamı aspire edin ve hücre peletinin üzerinde yaklaşık 50 μL süpernatan bırakın. Bir P200 kullanarak, tek hücreli bir bulamaç oluşturmak için hücre peletini artık ortamda nazikçe yeniden süspanse edin.
8. Hücre bulamacını, iBBB başına 50 μL indirgenmiş GF bazal membran matrisinde istenen sayıda iBBB için 10 ng/mL VEGF-A ile desteklenmiş yeterince azaltılmış GF bazal membran matrisinde karıştırın ve hücreleri homojen bir şekilde karıştırmaya özen gösterin.
   NOT: Erken polimerizasyonu önlemek için hücreleri ve azaltılmış GF bazal membran matrisini bu aşamada buz üzerinde tutmak çok önemlidir.
9. 50 μL azaltılmış GF bazal membran matris karışımını 48 oyuklu cam tabanlı bir kültür kabının kuyucuğuna pipetleyin. Hacmi tabağın dibine eşit olarak dağıtın (Şekil 1C).
10. Azaltılmış GF bazal membran matrisinin polimerize olmasına izin vermek için iBBB'leri 37 °C'de 30-40 dakika inkübe edin ve matristeki hücreleri kapsülleyin.
11. 10 ng / mL VEGF-A, 5 μg / mL doksisiklin ve 10 μM Y27632 ile desteklenmiş 500 μL ekleyin.
12. Ertesi gün ortamı 10 ng / mL VEGF-A ile desteklenmiş olarak değiştirin. Ortamı 2-3 günde bir değiştirmeye devam edin. 2 hafta sonra VEGF-A takviyesini bırakın; iBBB'ler 2 hafta sonra aşağı akış tahlilleri için hazırdır.

3. Aβ fibrilleri ile serebral amiloid anjiyopatinin (CAA) indüklenmesi

1. PBS'de 200 μM'de amiloid-β_1-40 ve amiloid-β_1-42 stok çözeltileri hazırlayın.
2. 2 haftalık iBBB'lerde iBBB ortamına Aβ'yi 20 nM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Hücreleri Aβ takviyeli ortamda 96 saat (4 gün) inkübe edin.
3. 96 saat sonra ortamı çıkarın ve sabitlemeye devam edin (bölüm 4).

4. iBBB'nin sabitlenmesi ve boyanması

1. iBBB'yi sabitlemek için ortamı çıkarın, 1 mL PBS'de yıkayın ve gece boyunca 4 °C'de 500 μL %4 paraformaldehit içinde inkübe edin.
2. % 4 paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve 1 mL PBS'de 4 x (en az) 15 dakika durulayın.
3. Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.3 PBST (% 0.3 Triton X-100 ile PBS) içinde hafifçe çalkalayarak geçirgenleştirin.
4. Kültürleri bloke edici tamponda (% 0.3 PBST'de% 5 Normal Serum) oda sıcaklığında en az 1 saat hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
   NOT: Kullanılan serum tipi, kullanılan ikincil antikorlar için konakçı türe bağlıdır. Örneğin, ikincil antikorlar için konakçı tür keçi ise, normal keçi serumu kullanın; Konakçı tür eşek ise, normal eşek serumu kullanın. Bu aynı zamanda gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak da yapılabilir.
5. Birincil antikorları, bloke edici tamponda önerilen veya belirlenen konsantrasyona seyreltin.
6. Bloke edici çözeltiyi birincil antikor seyreltmesi ile değiştirin. Eşit inkübasyon için iBBB'lerin antikor çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun; 100-150 μL, 48 oyuklu cam tabanlı bir kültür kabında 50 μL'lik bir iBBB'yi kaplamak için yeterlidir. Hafifçe çalkalayarak gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
7. Birincil antikoru çıkarın. İBBB'leri %0,3 PBS'de 3 x 10-20 dakika yıkayın.
8. İkincil antikoru, bloke edici tamponda önerilen veya belirlenen konsantrasyona seyreltin. Ek olarak, önerilen veya belirlenen konsantrasyonda ikincil antikor çözeltisine Hoechst gibi bir nükleer leke ekleyin.
9. Son PBS yıkamasını ikincil antikor seyreltmesi ile değiştirin. Eşit inkübasyon için iBBB'lerin antikor çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun; 100-150 μL, 48 oyuklu cam tabanlı bir kültür kabında 50 μL'lik bir iBBB'yi kaplamak için yeterlidir. Hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
   NOT: Bu, gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak da yapılabilir.
10. PBS'de yıkama başına en az 1 saat boyunca iBBB'leri 4-5x yıkayın. Numuneler görüntülenene kadar PBS veya solma önleyici montaj ortamında 4 °C'de saklayın.
11. Ters çevrilmiş bir mikroskopta görüntülemek için, iBBB'leri cam tabanlı plakalarda veya tabaklarda tutun. iBBB'leri yerinde tutmak için camın üzerine bir cam lamel yerleştirin (Şekil 1D).

Düzgün şekillendirilmiş bir iBBB, tek bir yarı saydam diskte katılaşır (Şekil 3A). iBBB'nin birkaç gün sonra ilk pipetlendiği yüzeyden ayrılması normaldir. Bu önlenemez, ancak medyayı değiştirirken yanlışlıkla iBBB'yi aspire etmemek için dikkatli olunursa, iBBB'nin düzgün oluşumu için büyük bir endişe kaynağı değildir. 24 saat sonra, eşit olarak dağılmış, tek hücreler parlak alan mikroskobu altında tanımlanabilir (Şekil 3B). 2 hafta sonra, tanımla ayırt etmek zor olsa da, daha belirgin yapılar görülebilir (Şekil 3C).

iBBB'nin kalitesi büyük ölçüde girdi hücrelerinin farklılaşmasının kalitesine bağlıdır. Hücre tipine özgü belirteçleri sabitlemek ve boyamak için bazı artık hücrelerin 2D monokültürlerde kaplanmasını şiddetle tavsiye ederiz. PECAM1 veya VE-kaderin için %70'in üzerinde pozitif olan endotel hücrelerinden oluşan iBBB'ler (Şekil 2A), PDGFRB için %95'in üzerinde pozitif perisitler (Şekil 2B) ve S100B ve CD44 için %95'in üzerinde pozitif astrositler (Şekil 2C) başarılı iBBB'ler için en iyisidir. Bu kalite kontrolünden elde edilen sonuçlar, yüksek kaliteli iBBB'ler için en erken göstergedir.

Fizyolojik olarak ilgili 3D yapılar, 2 haftalık kendi kendine montajdan sonra oluşmalıdır. Sabitleme ve boyama üzerine, sıkı bağlantı oluşumu için kritik olan endotelyal belirteç PECAM1 için pozitif boyanan tüp benzeri yapıların kanıtlarını görüyoruz (Şekil 4A). iBBB oluşumundaki en büyük değişkenlik, mikrovasküler sistem oluşumunun derecesidir. "En kötü durum" senaryosunda, endotel hücre ağı daha parçalanmış görünür veya iBBB boyunca uzanmazken, "en iyi durum" senaryosunda, damar sistemi tekdüzedir ve iBBB boyunca dallanır. %70'in üzerinde PECAM1 pozitif olan endotel hücre farklılaşması daha tutarlı ağlar oluşturur. Ek olarak, astrositler tarafından eksprese edilen ve astrosit uç ayaklarına lokalize olan bir protein olan aquaporin-4, PECAM1 boyaması ile hizalanır, bu da astrositlerin endotel hücrelerine temas etmek için uç ayaklarını uzattığını gösterir (Şekil 4B). Son olarak, damar sistemi çevresinde perisitler görmeyi bekliyoruz (Şekil 4C).

İBBB'lerde serebral amiloid anjiyopati (CAA) için birincil okuma, amiloid-β (Aβ) varlığıdır. Aβ, hedeflenen antikorlar kullanılarak veya CAA fenotiplerini indüklemek için floresan etiketli Aβ'nın tohumlanmasıyla ölçülebilir (Şekil 5). BBB'lerin Aβ ile tedavisi, BBB hücreleri çok fazla endojen Aβ proteini ifade etmediğinden, Aβ boyama yoğunluğunu ve alanını arttırmalıdır. Alternatif olarak, amiloid birikimini tespit etmek için sabit numuneler Thioflavin T ile boyanabilir. Aβ seviyeleri, iBBB'yi oluşturmak için kullanılan kök hücrelerin genotipine bağlıdır, bazı Alzheimer hastalığı ve CAA ile ilişkili risk faktörleri Aβ birikimi ve boyama miktarını arttırır (Şekil 5B, C)²⁴.

Şekil 1: Serebral amiloid anjiyopatiyi modellemek için in vitro kan-beyin bariyeri. (A) iBBB montajı ve olgunlaşmasının şematik gösterimi. Endotel hücrelerinin, astrositlerin ve perisitlerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden farklılaşmasından sonra, hücreler tek hücreli bir süspansiyon içinde bir jel matris içinde kapsüllenir. 2 hafta boyunca, hücreler in vivo olarak tanımlanan yapılara benzer şekilde vasküler birimler halinde kendiliğinden birleşir. (B) Serebral amiloid anjiyopati testinin şeması. Aβ agregasyonunu indüklemek için olgunlaşmış iBBB'lere 96 saat boyunca amiloid-β eklenir. (C) Cam tabanlı bir kuyuya tohumlamadan sonra bir iBBB'nin yandan görünümünü gösteren diyagram. (D) Ters mikroskopta görüntüleme için hazırlanmış bir iBBB grafiği. Kısaltmalar: BBB = kan-beyin bariyeri; iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; iBBB = bir 3D matriste kapsüllenmiş endotel hücreleri, perisitler ve astrositler içeren bir hasta iPSC'den türetilmiş BBB modelinden türetilen insan BBB'sinin in vitro modeli; Aβ = Amiloid-β. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: iPSC'den türetilen iBBB hücrelerinin doğrulanması. (A) VE-kaderin (yeşil) ve PECAM1 (kırmızı) ile boyanmış 2D monokültürlerde endotel hücrelerinin temsili maksimum yoğunluk projeksiyonu. (B) PDGFRB (yeşil) ve NG2 (kırmızı) ile boyanmış 2D monokültürlerdeki perisitlerin temsili görüntüleri. (C) CD44 (üstte; yeşil) ve S100B (altta; yeşil) ile boyanmış 2D monokültürlerdeki astrositlerin temsili görüntüleri. Tüm çekirdekler Hoechst 33342 ile boyanır. Görüntüler Nikon Eclipse Ti2-E ile 20x büyütme (A,B) veya Leica Stellaris 8 ile 40x büyütme (C) ile çekilmiştir. Tüm ölçek çubukları 100 μm'dir. Kısaltmalar: BBB = kan-beyin bariyeri; iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; iBBB = bir 3D matriste kapsüllenmiş endotel hücreleri, perisitler ve astrositler içeren bir hasta iPSC'den türetilmiş BBB modelinden türetilen insan BBB'sinin in vitro modeli; VE-kaderin = vasküler endotelyal kaderin; PECAM1 = trombosit ve endotel hücre adezyon molekülü 1; PDGFRB = trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü beta; NG2 = nöron glial antijen 2; S100B = S100 kalsiyum bağlayıcı protein beta. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: iBBB'nin montajı. (A) 2x büyütmede kaplamadan 24 saat sonra 15 μL iBBB'nin parlak alan görüntüsü. (B) 10x büyütmede kaplamadan 24 saat sonra bir iBBB'nin parlak alan görüntüsü. (C) 10x büyütmede kaplamadan 2 hafta sonra bir iBBB'nin parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 1 mm (A), 100 μm (B,C). Ters çevrilmiş Nikon Eclipse Ts2R-FL ile çekilen görüntüler. Kısaltmalar: BBB = kan-beyin bariyeri; iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; iBBB = bir 3D matriste kapsüllenmiş endotel hücrelerini, perisitleri ve astrositleri içeren bir hasta iPSC'den türetilmiş BBB modelinden türetilen insan BBB'sinin in vitro modeli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: iBBB'deki hücre etkileşimleri. iBBB'deki endotel hücrelerinin, perisitlerin ve astrositlerin temsili görüntüleri. (A) Endotel hücreleri (PECAM1) ve astrositler (S100β). (B) Endotel hücreleri (PECAM1) ve astrosit uç ayakları (AQP-4) birlikte lokalizasyonu. (C) endotel hücreleri (PECAM1) ve perisitler (NG2). Tüm çekirdekler Hoechst 33342 ile boyanır. Konfokal Z-yığını görüntüleri, 20x büyütmede (A,B) bir Leica Stellaris 8 veya 20x büyütmede (C) bir Nikon Eclipse Ti2-E ile çekildi. Ölçek çubukları = 200 μm (A), 100 μm (B,C). Kısaltmalar: BBB = kan-beyin bariyeri; iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; iBBB = bir 3D matriste kapsüllenmiş endotel hücreleri, perisitler ve astrositler içeren bir hasta iPSC'den türetilmiş BBB modelinden türetilen insan BBB'sinin in vitro modeli; PECAM1 = trombosit ve endotel hücre adezyon molekülü 1; AQP-4 = aquaporin-4; NG2 = nöron glial antijen 2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Serebral amiloid anjiyopati in vitro. (A) Kontrol veya Aβ-aşırı ekspresyon nöronlarından koşullu ortama maruz kalan AD olmayan iBBB'ler. 6e10 antikoru Aβ'yı tanır. (B) 96 saat boyunca 20 nM Aβ-FITC_1-42 ile muamele edilen izojenik APOE3 ve APOE4 hücre hatlarından iBBB'lerin temsili görüntüleri. (C) 20 nM Aβ-FITC_1-40 veya Aβ-FITC_1-42 ile muamele edilen izogenik APOE3 ve APOE4 hücre hatlarından iBBB'lerde amiloid miktarının belirlenmesi. _{Ölçek çubukları = 50 μm (}A), 10 μm (B). Bu rakam Blanchard ve ark.^24'ten uyarlanmıştır. Kısaltmalar: BBB = kan-beyin bariyeri; iPSC'ler = indüklenmiş pluripotent kök hücreler; iBBB = bir 3D matriste kapsüllenmiş endotel hücreleri, perisitler ve astrositler içeren bir hasta iPSC'den türetilmiş BBB modelinden türetilen insan BBB'sinin in vitro modeli; Aβ = Amiloid-β. APOE = ApolipoproteinE. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Farklılaşma kalite kontrolleri için önerilen hücre belirteçleri. Farklılaşmaların kalitesini kontrol etmek ve oluşan iBBB'deki hücreleri tanımlamak için kullanılabilecek BBB'nin farklı hücre tipleri için hücre belirteçleri. Bu yazıda kullanılan markörler kalın yazılmıştır.

BBB disfonksiyonu bir komorbiditedir ve potansiyel olarak çok sayıda nörolojik hastalıkta bir neden veya şiddetlendirici faktördür ^7,40,41. Bununla birlikte, nörovasküler hastalığı olan insanlarda BBB'nin işlev bozukluğu ve parçalanmasının altında yatan moleküler ve hücre biyolojisini incelemek neredeyse imkansızdır. Bu protokolde sunulan indüklenebilir-BBB (iBBB), vasküler tüp oluşumu ve astrosit uç ayaklarının vaskülatür ile lokalizasyonu dahil olmak üzere BBB'nin önemli hücre etkileşimlerini özetleyen bir in vitro sistem sağlar. IBBB, BBB disfonksiyonunun herhangi bir aşamasında yer alan moleküler yolları incelemek için kullanılabilir ve serebral amiloid anjiyopatide görüldüğü gibi amiloid β agregasyonu gibi nörovasküler hastalık fenotiplerini modelleyebilir.

iBBB'lerin kalitesi büyük ölçüde kullanılan iPSC'den türetilen hücrelerin kalitesine bağlı olmasına rağmen, iBBB'nin montajı basittir. IBBB, bileşen hücrelerinin olgunlaşmasını teşvik edebilen çok hücreli bir niş sağlarken, her hücre tipinin kapsüllenmeden önce uygun şekilde modellenmesi gerekir. Tek tek monokültürlerde hücre tipine özgü belirteçler için immünofloresan boyama yaparak her bir farklılaşma üzerinde kalite kontrolleri yapmak çok önemlidir (Tablo 1). Her iPSC hattı farklı davranır ve tohumlama yoğunluğu veya her bir modelleme ortamındaki gün sayısı gibi bazı koşulların ampirik olarak belirlenmesi ve farklılaşma verimliliğini optimize etmek için ayarlanması gerekebilir.

Açıklanan protokol 50 μL'lik bir boyut önerir, ancak iBBB, hücre kullanılabilirliğine, istenen iBBB'lerin sayısına ve aşağı akış uygulamasına bağlı olarak 5 μL'ye kadar küçültülebilir. Daha büyük iBBB'ler daha fazla hücre içerir, bu da onları protein, lipid veya nükleik asit toplama için ideal hale getirir. Daha küçük iBBB'ler, ilaç taramalarını veya diğer ölçeklenebilir tahlilleri kolaylaştırabilir.

IBBB, BBB'yi in vitro olarak incelemek için çok yönlü bir araçtır. Her hücre tipi bağımsız olarak farklılaştığından, iBBB'ler farklı genetik geçmişlerden bir araya getirilebilir, bu da genetik risk faktörlerinin BBB işlev bozukluğuna katkıda bulunmak için belirli hücre tiplerini nasıl etkilediğini incelememize olanak tanır. Bu strateji, Alzheimer hastalığı ve serebral amiloid anjiyopati için en yaygın risk faktörü olan APOE4'ün, kısmen perisitlerde patojenik bir mekanizma yoluyla etki ettiğini göstermek için uygulandı²⁴. Bu aracın daha fazla kullanılması, EC'lerin, PC'lerin ve astrositlerin BBB bütünlüğünü korumadaki bireysel katkılarını ve her bir hücre tipinin hastalık gelişimi sırasında nasıl bocaladığını incelememize izin verecektir.

Şu anda, BBB'yi in vitro modellemenin en yaygın yöntemi, geçirimsiz bir tek tabaka^42,43,44 oluşturmak için EC'lerle tohumlanmış ve bazen perisitler ve/veya astrositlerle birlikte kültürlenmiş bir transwell sistemi kullanmaktır. iBBB'nin 3D yapısı, vasküler ünitenin kendi kendine montajını sağlar ve fizyolojik vaskülatüre daha çok benzeyen tübüler yapıların oluşumuna izin verir. Bu protokolde tarif edildiği gibi, iBBB'lerin bir kuyu plakasına tohumlanmasının bir dezavantajı, bir in vivo sistemde sabit akışlı vaskülatür sisteminin neden olduğu saf stresleri yaşamamalarıdır. Bunun üstesinden gelmek için, iBBB, dinamik bir akış^45,46,47 oluşturabilen bir mikroakışkan çipe ekilebilir. Bu sistem aynı zamanda damar sistemi geçirgenliğini ve küçük moleküllerin perfüzyonunu test etmek için de kullanılabilir.

Sonuç olarak, bu yöntem, nörovasküler hastalık fenotiplerini özetleme yeteneği ve çok çeşitli uygulamalar için ilaç BBB geçirgenliğini tarama potansiyeli de dahil olmak üzere, BBB'nin sayısız yönünü hücresel düzeyde incelemek için bir platform olarak kullanılabilecek esnek, 3D, iPSC'den türetilmiş bir BBB modeli sağlar.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Bu çalışma NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Girişimi, MJFF / ASAP Vakfı ve Amerika Beyin Hasarı Derneği tarafından desteklenmektedir. CG, NIH F31NS130909 tarafından desteklenmektedir. Şekil 1A , BioRender.com ile oluşturulmuştur.