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* これらの著者は同等に貢献しました
血液脳関門(BBB)は、安定した健康な脳環境を維持する上で重要な役割を果たしています。BBB機能障害は、多くの神経疾患と関連しています。私たちは、脳血管の病理学、BBBの完全性、およびBBBが遺伝学や疾患によってどのように変化するかを調べるために、BBBの3D幹細胞由来モデルを開発しました。
血液脳関門(BBB)は、中枢神経系(CNS)の重要な生理学的構成要素であり、栄養素を維持し、老廃物を取り除き、病原体から脳を保護します。BBBの固有のバリア特性は、神経疾患を治療するための中枢神経系への治療薬送達に課題を提起します。BBB機能障害は神経疾患に関連しています。脳血管系にアミロイドが沈着してBBBが損なわれる脳アミロイド血管症(CAA)は、アルツハイマー病(AD)のほとんどの症例で併存疾患であり、BBBの機能不全または破壊が神経変性に関与している可能性があることを示唆しています。ヒトBBB組織へのアクセスが限られているため、適切なBBB機能とBBB変性に寄与するメカニズムは不明のままです。これらの限界に対処するために、私たちは、内皮細胞、周皮細胞、およびアストロサイトを3Dマトリックスに組み込むことにより、ヒト多能性幹細胞由来BBB(iBBB)を開発しました。iBBBは自己組織化して、BBBに存在する解剖学的構造と細胞相互作用を再現します。iBBBにアミロイドを播種することで、CAAの重要な側面を捉えることができます。さらに、iBBBは、脳血管疾患や神経変性に関与する遺伝的要因や環境要因を調節し、遺伝学や生活習慣が疾患リスクにどのように影響するかを調査するための柔軟なプラットフォームを提供します。最後に、iBBBは、中枢神経系への治療送達を最適化するための薬物スクリーニングおよび創薬化学研究に使用できます。このプロトコルでは、ヒト多能性幹細胞から生じる3種類の細胞(内皮細胞、周皮細胞、アストロサイト)の微分、iBBBに分化した細胞を組み立てる方法、および外因性アミロイドを使用して生体 外で CAAをモデル化する方法について説明します。このモデルは、生物学的忠実度と実験の柔軟性の両方を備えたシステムを使用して、生きたヒト脳組織を研究するという課題を克服し、ヒトBBBと神経変性におけるその役割の調査を可能にします。
血液脳関門(BBB)は、中枢神経系(CNS)を末梢から分離し、適切な神経機能に理想的な環境を維持する重要な微小血管ネットワークです。代謝ホメオスタシスを維持し1,2,3,4、老廃物4,5,6を除去し、病原体や毒素から脳を保護することにより、中枢神経系への物質の流入と流出を調節する上で重要な役割を果たします7,8。
BBBの一次細胞型は内皮細胞(EC)です。中胚葉系統に由来する内皮細胞は、血管系の壁を形成します1,9。微小血管ECは互いにタイトジャンクションを形成して膜の透過性を大幅に低下させる一方で、トランスポーターを発現して中枢神経系への栄養素の出入りを促進する10,11,12,13,14.微小血管ECは、微小血管機能と恒常性を調節する周皮細胞(PC)壁細胞に囲まれており、分子および免疫細胞に対するBBBの透過性を調節するために重要です15,16,17。主要なグリア細胞型であるアストロサイトは、BBBを含む最後の細胞型です。アストロサイトの末端足はEC-PC血管管を包み込み、細胞体は脳実質に伸び、ニューロンと血管系の間の接続を形成します1。BBB機能に重要な役割を果たすアストロサイト末端(アクアポリン4[AQP-4]など)には、異なる溶質および基質トランスポーターが局在しています18,19,20,21。
BBBは脳の健康機能の維持に不可欠であり、アルツハイマー病(AD)22,23,24,25、多発性硬化症7,26,27,28、てんかん29,30、脳卒中31,32など、多くの神経疾患でBBBの機能不全が報告されています.脳血管の異常が神経変性において中心的な役割を果たし、虚血性および出血性イベントに対する感受性の増加に寄与していることがますます認識されています。例えば、AD患者の90%以上が、脳血管系に沿ってアミロイドβ(Aβ)が沈着することを特徴とする脳アミロイド血管障害(CAA)を患っています。CAAはBBBの透過性を高め、BBB機能を低下させ、中枢神経系を虚血、出血性イベント、および加速された認知機能低下に対して脆弱なままにします33。
私たちは最近、3Dマトリックスにカプセル化されたEC、PC、およびアストロサイトを組み込んだ、患者誘発多能性幹細胞に由来するヒトBBBの in vitro モデルを開発しました(図1A)。iBBBは、血管管の形成や血管系によるアストロサイトのエンドフットの局在化など、生理学的に関連する相互作用を再現します24。APOE4が媒介するCAAの感受性をモデル化するためにiBBBを適用しました(図1B)。これにより、APOE4がCAAを促進する原因となる細胞および分子メカニズムを特定し、これらの洞察を活用して、APOE4マウスのCAA病理を低減し、 in vivoでの 学習と記憶を改善する治療戦略を開発することができました24。ここでは、ヒトiPS細胞からBBBを再構築し、 in vitroでCAAをモデル化するための詳細なプロトコルとビデオチュートリアルを提供します。
1. iPS細胞からiBBB細胞への分化
注:これらの分化プロトコルは、Mesentier-Louro et al.34で以前に説明されています。
2. iBBBの組み立て
3. Aβ線維による脳アミロイド血管障害(CAA)の誘導
4. iBBBの固定と染色
適切に形成されたiBBBは、1つの半透明のディスクに固化します(図3A)。iBBBは、数日後に最初にピペットで固定した表面から剥がれるのが普通です。これは避けることはできませんが、培地を交換する際に誤ってiBBBを吸引しないように注意すれば、iBBBの適切な形成にとって大きな懸念事項ではありません。24時間後、明視野顕微鏡で均一に分布した単一細胞を同定できます(図3B)。2週間後、より明瞭な構造が見えるようになるが、定義で判断することは困難である(図3C)。
iBBBの品質は、インプット細胞の分化の質に大きく依存します。残った細胞を2D単培養で播種し、細胞タイプ特異的なマーカーを固定および染色することを強くお勧めします。PECAM1またはVE-カドヘリンが70%以上陽性の内皮細胞(図2A)、PDGFRBが95%以上陽性の周皮細胞(図2B)、S100BおよびCD44が95%以上陽性のアストロサイト(図2C)から形成されたiBBBは、iBBBの成功に最適です。この品質チェックの結果は、高品質のiBBBの最も初期の指標です。
生理学的に関連する3D構造は、自己組織化の2週間後に形成されるはずです。固定して染色すると、タイトジャンクション形成に重要な内皮マーカーPECAM1を陽性で染色するチューブ状構造の証拠が見られます(図4A)。iBBB形成における最大の変動は、微小血管形成の程度である。「最悪のケース」のシナリオでは、内皮細胞ネットワークはより断片化されているか、iBBB全体に広がっていないように見えますが、「最良のシナリオ」では、血管系は均一であり、iBBB全体に分岐しています。PECAM1陽性の内皮細胞分化が70%を超えると、より一貫性のあるネットワークが形成されます。さらに、アストロサイトが発現するタンパク質で、アストロサイトの末端に局在するアクアポリン-4は、PECAM1染色と整合しており、アストロサイトが末端を伸ばして内皮細胞に接触していることを示しています(図4B)。最後に、血管系の周囲に周皮細胞が見られると予想されます(図4C)。
iBBBにおける脳アミロイド血管障害(CAA)の主な読み出しは、アミロイドβ(Aβ)の存在です。Aβは、標的抗体を使用するか、蛍光標識されたAβを播種してCAA表現型を誘導することで測定できます(図5)。iBBBをAβで処理すると、BBBの細胞は内因性Aβタンパク質をあまり発現しないため、Aβ染色の強度と面積が増加するはずです。あるいは、固定サンプルをチオフラビンTで染色して、アミロイドの蓄積を検出することもできます。Aβレベルは、iBBBの生成に使用された幹細胞の遺伝子型に依存し、一部のアルツハイマー病およびCAA関連の危険因子は、Aβの蓄積と染色の量を増加させます(図5B、C)24。
図1:脳アミロイド血管障害をモデル化するための in vitro 血液脳関門。 (A)iBBBの組み立てと成熟の模式図。人工多能性幹細胞から内皮細胞、アストロサイト、ペリサイトを分化させた後、細胞を単一細胞懸濁液中のゲルマトリックスにカプセル化します。2週間の間に、細胞はin vivoで同定された構造と同様に、血管単位に自己組織化します。(B)脳アミロイド血管障害アッセイの概略図。アミロイドβを成熟iBBBに96時間添加し、Aβ凝集を誘導します。(C)ガラス底ウェルに播種した後のiBBBの側面図を示す図。(D)倒立顕微鏡でイメージングするために準備されたiBBBのグラフィック。略語:BBB =血液脳関門;iPS細胞=人工多能性幹細胞;iBBB = 患者iPS細胞由来のBBBモデルから得られたヒトBBBの in vitro モデルで、内皮細胞、周皮細胞、およびアストロサイトを3Dマトリックスにカプセル化しています。Aβ=アミロイドβ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:iPS細胞由来iBBB細胞のバリデーション。 (A)VE-カドヘリン(緑)およびPECAM1(赤)で染色した2D単培養における内皮細胞の代表的な最大強度投影。(B)PDGFRB(緑)とNG2(赤)で染色した2D単培養の周皮細胞の代表画像。(C)CD44(上;緑)およびS100B(下;緑)で染色した2D単培養におけるアストロサイトの代表的な画像。すべての核はHoechst 33342で染色されています。画像は、Nikon Eclipse Ti2-Eで20倍の倍率(A、B)またはLeica Stellaris 8で40倍の倍率(C)で撮影しました。すべてのスケールバーは100μmです。略語:BBB =血液脳関門;iPS細胞=人工多能性幹細胞;iBBB = 患者iPS細胞由来のBBBモデルから得られたヒトBBBの in vitro モデルで、内皮細胞、周皮細胞、およびアストロサイトを3Dマトリックスにカプセル化しています。VE-カドヘリン=血管内皮カドヘリン;PECAM1 = 血小板および内皮細胞接着分子1;PDGFRB = 血小板由来成長因子受容体ベータ;NG2 = ニューロングリア抗原 2;S100B = S100カルシウム結合タンパク質ベータ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:iBBBの組み立て。 (A)めっき後24時間後の15 μL iBBBの明視野画像(倍率2倍)。(B)めっき後24時間後のiBBBを10倍の倍率で撮影した明視野画像。(C)めっき2週間後のiBBBの明視野画像(倍率10倍)。スケールバー = 1 mm (A)、100 μm (B、C)。ニコンエクリプスTs2R-FLを倒立させた画像。 略語:BBB = 血液脳関門;iPS細胞=人工多能性幹細胞;iBBB = 内皮細胞、周皮細胞、アストロサイトを3Dマトリックスに封入した患者iPS細胞由来のBBBモデルから得られたヒトBBBの in vitro モデル。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:iBBBにおける細胞間相互作用。 iBBBにおける内皮細胞、周皮細胞、アストロサイトの代表的な画像。(A)内皮細胞(PECAM1)およびアストロサイト(S100β)。(B)内皮細胞(PECAM1)とアストロサイト末足(AQP-4)の共局在。(C)内皮細胞(PECAM1)および周皮細胞(NG2)。すべての核はHoechst 33342で染色されています。共焦点Zスタック画像は、Leica Stellaris 8で20倍の倍率(A、B)またはNikon Eclipse Ti2-Eで20倍の倍率(C)で撮影されました。スケールバー = 200 μm (A)、100 μm (B、C)。略語:BBB =血液脳関門;iPS細胞=人工多能性幹細胞;iBBB = 患者iPS細胞由来のBBBモデルから得られたヒトBBBの in vitro モデルで、内皮細胞、周皮細胞、およびアストロサイトを3Dマトリックスにカプセル化しています。PECAM1 = 血小板および内皮細胞接着分子1;AQP-4 = アクアポリン-4;NG2 = ニューロングリア抗原 2. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5: in vitroでの脳アミロイド血管障害。 (A)コントロールニューロンまたはAβ過剰発現ニューロンからの条件付け培地に曝露された非AD iBBB。6e10抗体はAβを認識します。(B)20 nM Aβ-FITC1-42 で96時間処理した同質APOE3およびAPOE4細胞株のiBBBの代表的な画像。 (C)20 nM Aβ-FITC1-40 またはAβ-FITC1-42で処理した同原性APOE3およびAPOE4細胞株のiBBB中のアミロイドの定量。スケールバー = 50 μm (A)、10 μm (B)。この図は、Blanchard et al24 から引用したものです。略語:BBB =血液脳関門;iPS細胞=人工多能性幹細胞;iBBB = 患者iPS細胞由来のBBBモデルから得られたヒトBBBの in vitro モデルで、内皮細胞、周皮細胞、およびアストロサイトを3Dマトリックスにカプセル化しています。Aβ=アミロイドβ。APOE = アポリポタンパク質E。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
マーカー | 会社 | カタログ番号 | 希釈 | |
内皮細胞 | PECAM1(CD31) | R&Dシステム | AF806型 | 1:500 |
VE-カドヘリン(CD144) | R&Dシステム | AF938型 | 1:500 | |
ZO-1 (ゾワン) | インビトロジェン | MA3-39100-A488 | 1:500 | |
周皮細胞 | PDGFRβ | R&Dシステム | AF385型 | 1:500 |
NG2の | アブカム | AB255811 | 1:500 | |
アストロサイト | S100β | シグマ・アルドリッチ | S2532-100uL | 1:500 |
CD44の | 細胞シグナル伝達技術 | 3570S型 | 1:400 | |
AQP-4型 | インビトロジェン | PA5-53234 | 1:300 | |
GFAPの | ||||
ALDH1L1 | ||||
EAAT1の | ||||
EAAT2(イーアット2) | ||||
アミロイドβ | 6e10の | バイオレジェンド | SIG-39320 (英語) | 1:1,000 |
チオフラビンT | ケムインペックス | 22870 | 25 μM |
表1:分化品質チェックに推奨される細胞マーカー。 分化の質をチェックし、形成されたiBBBの細胞を同定するために使用できるBBBのさまざまな細胞タイプの細胞マーカー。このホワイトペーパーで使用されているマーカーは太字で示しています。
BBB機能障害は併存疾患であり、多くの神経疾患の原因または悪化因子である可能性があります7,40,41。しかし、神経血管疾患のヒトにおけるBBBの機能不全と破壊の根底にある分子生物学および細胞生物学を研究することはほぼ不可能です。このプロトコルで示される誘導性BBB (iBBB)は管管の形成および血管系のastrocyte端フィートの局在化を含むBBBの重要なセル相互作用を、要約する生体外のシステムを提供する。iBBBは、BBB機能障害のあらゆる段階に関与する分子経路の研究に使用でき、脳アミロイド血管障害に見られるアミロイドβ凝集などの神経血管疾患の表現型をモデル化できます。
iBBBの組み立ては簡単ですが、iBBBの品質は、使用するiPS細胞由来細胞の品質に大きく依存します。iBBBは、構成細胞の成熟を促進することができる多細胞ニッチを提供しますが、各細胞タイプはカプセル化する前に適切にパターン化する必要があります。個々のモノカルチャーで細胞型特異的マーカーの免疫蛍光染色を行うことにより、各分化の品質チェックを行うことが重要です(表1)。iPS細胞株はそれぞれ異なる挙動を示すため、シード密度や各パターニング培地の日数などの条件を経験的に決定し、分化効率を最適化するために調整する必要がある場合があります。
記載されているプロトコールでは50 μLのサイズが推奨されていますが、iBBBは、細胞の入手可能性、目的のiBBBの数、およびダウンストリームアプリケーションに応じて、5 μLまでスケールダウンできます。iBBBが大きいほど細胞数が多いため、タンパク質、脂質、核酸の収集に最適です。iBBBを小型にすることで、薬物スクリーニングやその他のスケーラブルなアッセイを容易にすることができます。
iBBBは、 in vitroでBBBを研究するための非常に汎用性の高いツールです。各細胞タイプは独立して分化するため、iBBBは異なる遺伝的背景から組み立てることができ、遺伝的危険因子が特定の細胞タイプにどのように影響し、BBB機能障害に寄与するかを研究することができます。この戦略は、アルツハイマー病と脳アミロイド血管障害の最も一般的な危険因子であるAPOE4が、特に周皮細胞における病原性メカニズムを介して部分的に作用することを示すために適用されました24。このツールをさらに使用することで、BBBの完全性を維持する上でのEC、PC、およびアストロサイトの個々の寄与と、疾患の発症中に各細胞タイプがどのように衰えるかを解剖することができます。
現在、in vitroでBBBをモデル化する最も一般的な方法は、ECを播種し、時には周皮細胞および/またはアストロサイトと共培養して、不浸透性の単層を形成するトランズウェルシステムを使用することです42,43,44。iBBBの3D構造は、血管ユニットの自己組織化を可能にし、より生理学的血管系に似た管状構造の形成を可能にします。このプロトコルで説明されているように、ウェルプレートにiBBBを播種することの欠点は、in vivoシステムで一定の流量の血管系によって引き起こされる薄いストレスを経験しないことです。これを克服するために、iBBBは、動的流れ45、46、47を生成することができるマイクロ流体チップに播種することができる。このシステムは、血管系透過性および低分子の灌流試験にも使用できます。
結論として、この手法は、神経血管疾患の表現型を再現する能力や、幅広い用途で薬物のBBB透過性をスクリーニングする可能性など、細胞レベルでBBBの無数の側面を研究するためのプラットフォームとして使用できる、柔軟な3DiPS細胞由来のBBBモデルを提供します。
著者らは利益相反を報告していない。
この研究は、NIH 3-UG3-NS115064-01、R01NS14239、Cure Alzheimer's Fund、NASA 80ARCO22CA004、Chan-Zuckerberg Initiative、MJFF/ASAP Foundation、Brain Injury Association of Americaの支援を受けています。C.G.はNIH F31NS130909によってサポートされています。 図 1A は BioRender.com で作成されました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6e10 amyloid-β antibody | Biolegend | SIG-39320 | Used at 1:1000 |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
Activin A | Peprotech | 20-14E | |
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies | Invitrogen | Various | Used at 1:1000 |
Amyloid-beta 40 fibril | AnaSpec | AS-24235 | |
Amyloid-beta 42 fibril | AnaSpec | AS-20276 | |
Aquaporin-4 antibody | Invitrogen | PA5-53234 | Used at 1:300 |
Astrocyte basal media and supplements | ScienCell | 1801 | |
B-27 serum-free supplement | Gibco | 17504044 | |
BMP4 | Peprotech | 120-05ET | |
CHIR99021 | Cyamn Chemical | 13112 | |
DMEM/F12 with GlutaMAX medium | Gibco | 10565018 | |
Doxycycline | Millipore-Sigma | D3072-1ML | |
FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
Fluoromount-G slide mounting medium | VWR | 100502-406 | |
Forskolin | R&D Systems | 1099/10 | |
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement | Gibco | A1413302 | |
Glass Bottom 48-well Culture Dishes | Mattek Corporation | P48G-1.5-6-F | |
GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
Human Endothelial Serum-free medium | Gibco | 11111044 | |
LDN193189 | Tocris | 6053 | |
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) | Gibco | 11140050 | |
N-2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
Normal Donkey Serum | Millipore-Sigma | S30-100mL | Use serum to match secondary antibody host |
Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher | 28908 | |
PDGF-BB | Peprotech | 100-14B | |
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody | R&D Systems | AF385 | Used at 1:500 |
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010031 | |
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody | R&D Systems | AF806 | Used at 1:500 |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) | AddGene | Catalog #168805 | |
S100B antibody | Sigma-Aldrich | S2532-100uL | Used at 1:500 |
SB43152 | Reprocell | 04-0010 | |
Thioflavin T | Chem Impex | 22870 | Used at 25uM |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250mL | |
VE-cadherin (CD144) antibody | R&D systems | AF938 | Used at 1:500 |
VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
Y27632 | R&D Systems | 1254/10 | |
ZO-1 | Invitrogen | MA3-39100-A488 | Dilution = 1:500 |
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