Farede Periprostetik Eklem Candida albicans Enfeksiyon Modeli

Tehlikeli patojenlerin neden olduğu periprostetik eklem enfeksiyonu (PEE) klinik ortopedide yaygındır. Mevcut hayvan modelleri, PJI'nin gerçek durumunu doğru bir şekilde simüle edemez. Burada, PJI için yeni terapötikler araştırmak ve geliştirmek için Candida albicans biyofilm ile ilişkili bir PJI fare modeli kurduk.

Periprostetik eklem enfeksiyonu (PEE), cerrahları ve bilim adamlarını giderek daha fazla ilgilendiren Candida albicans'ın (C. albicans) neden olduğu yaygın enfeksiyonlardan biridir. Genel olarak, enfeksiyon bölgesinde C. albicans'ı antibiyotiklerden ve immün klirenstan koruyabilen biyofilmler oluşur. Enfekte implantın çıkarılması, debridman, antimikrobiyal tedavi ve reimplantasyonu içeren cerrahi, PEE tedavisinde altın standarttır. Bu nedenle, hayvan PJI modellerinin oluşturulması, PJI için yeni ilaçların veya terapötiklerin araştırılması ve geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada, ortopedi kliniklerinde yaygın olarak kullanılan bir implant olan pürüzsüz bir nikel-titanyum alaşımlı tel, C. albicans tel boyunca eklem boşluğuna aşılanmadan önce bir C57BL/6 faresinin femoral eklemine yerleştirildi. 14 gün sonra, taramalı elektronik mikroskop (SEM) altında implantların yüzeyinde olgun ve kalın biyofilmler gözlendi. Enfekte eklem örneklerinin H&E boyamasında önemli ölçüde azalmış bir kemik trabekülü bulundu. Özetlemek gerekirse, kolay kullanım, yüksek başarı oranı, yüksek tekrarlanabilirlik ve yüksek klinik korelasyon avantajlarına sahip bir fare PEE modeli oluşturulmuştur. Bunun, C. albicans biyofilm ile ilişkili PEE önlemenin klinik çalışmaları için önemli bir model olması beklenmektedir.

Candida albicans (C. albicans) insan vücudunun birçok yerinde yaygın olarak bulunur¹, bu aynı zamanda özellikle bağışıklığı baskılanmış hastalarda hayatı tehdit eden invaziv mantar enfeksiyonlarına neden olan en yaygın fırsatçı patojendir ^2,3. C. albicans, polimorfik bir mantar olarak maya ve miselyum durumları arasında dönüşebilir. Miselyum durumu daha yüksek virülans, daha güçlü yapışma ve hücre ve dokuların istilası^{sergiler 4,5}. Ayrıca C. albicans, takma dişler, kateterler ve stentler gibi biyomedikal malzemelerin yüzeylerinde biyofilm oluşturabilir ^1,6,7. Biyofilmlerin yoğun üç boyutlu yapısı, antifungal ilaçların infiltrasyonunu kısıtlar, ilaca dirençli genleri eksprese eder ve bağışıklık sistemi klerensine direnmek için mantar hücrelerinin metabolizmasını aşağı regüle eder ^6,7. Bu nedenle biyofilmlere bağlı enfeksiyonlar kliniklerde oldukça zorlayıcıdır⁸.

Staphylococcus aureus, koagülaz negatif stafilokok ve enterobakter PEE^9'a neden olan başlıca patojenlerdir. Fungal PEE insidansı nispeten düşük (yaklaşık% 1) olmasına ^rağmen10, fungal PEE'nin tedavi maliyeti daha yüksektir¹¹, tedavi döngüsü daha uzundur¹¹ ve tedavi başarı oranı bakteriyel PEE'den daha düşüktür¹⁰. Son yıllarda fungal PEE görülme sıklığı her geçen yıl artmaktadır¹⁰. Candida PJI, mantar PJI^10,12'nin %77-84'ünü oluşturur ve C. albicans Candida'da en yaygın olanıdır (%54). Bu nedenle, mantar PJI'nin incelenmesi gerekir.

Şu anda PEE, (1) enfekte implantın çıkarılması, (2) debridman, (3) antimikrobiyal tedavi ve (4) reimplantasyon ile revizyon cerrahisi ile tedavi edilmektedir. Kapsamlı bir debridmandan sonra, kemik çimentosu içeren bir antibiyotik yerleştirilir ve yeni bir implant yerleştirilmeden önce enfeksiyonu etkili bir şekilde kontrol etmek için hasta 6 haftadan fazla bir süre boyunca sistemik olarak antibiyotiklerle tedavi edilir¹³. Bununla birlikte, bu yöntem dokulardaki patojenleri tamamen ortadan kaldıramaz ve ilaca dirençli suşlarda uzun süreli antimikrobiyal tedavi ile tedavi edilen tekrarlayan enfeksiyonların gelişme olasılığı yüksektir 14,15,16.

PJI'nin hayvan modellerinin oluşturulması, PJI için yeni ilaçların veya terapötiklerin araştırılması ve geliştirilmesi için önemlidir. PEE gelişiminde, protez çevresinde geniş ölü boşluklar oluşur, bu da çevre dokuların kanlanmasını daha da engelleyen ve antibiyotiklerin etkisini bozan hematomların oluşumuna yol açar^11,15. Protezin çevresindeki ortamı taklit etmenin zorluğu nedeniyle, geleneksel hayvan modelleri PJI^17,18'in gerçek durumunu doğru bir şekilde simüle edemez.

Bu yazıda, eklem implantlarını simüle etmek için klinik olarak yaygın olarak kullanılan bir titanyum-nikel tel kullanılarak farelerde bir C. albicans biyofilm ile ilişkili PJI modeli^{oluşturulmuştur 19,20}. Bu PJI modeli, kolay kullanım, yüksek başarı oranı, yüksek tekrarlanabilirlik ve yüksek klinik korelasyon avantajlarını sergiler. C. albicans biyofilm ile ilişkili PJI'nin önlenmesi ve tedavisinin incelenmesi için önemli bir model olması beklenmektedir.

Hayvanlar Xi'an Jiaotong Üniversitesi'nden satın alındı. Tüm hayvan deneyi prosedürleri, Xi'an Jiaotong Üniversitesi Kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası: SCXK [Shaanxi] 2021-103). Fareler, kafes başına 5 fare ile bir hafta boyunca tutuldu. Yiyecek ve suya ücretsiz erişimlerine izin verildi. Hayvanlar, çalışma yapılmadan önce oda sıcaklığında (RT; 24 °C ± 1 °C) ve aydınlık/karanlık döngüsünde (12 saat/12 saat) tutuldu.

1. Tampon ve ekipman hazırlığı

1. C. albicans hücre kültürü
   1. Bir monoklonal C . albicans kolonisini (SC5314) bir maya özütü pepton dekstroz (YPD) plaka ortamından bir aşılama halkası ile 5 mL YPD sıvı ortamına (YPD + 50 μg / mL karbenisilin) aşılayın.
   2. C. albicans hücrelerini daha sonra gece boyunca 30 ° C'de 220 rpm hızında çalkalayın.
   3. Süspansiyonu RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. C. albicans hücrelerini normal salin içinde yeniden süspanse edin ve bulanıklığı 0.5 McFarland ile aynı olacak şekilde görsel olarak ayarlayarak hücre konsantrasyonunu 1 x 10⁶ hücre / mL'ye seyreltin.
2. Normal salin hazırlanması
   1. 0.9 g sodyum klorürü tartın ve% 0.9 normal salin hazırlamak için 100 mL deiyonize suda çözün.
3. Cerrahi aletlerin hazırlanması
   1. Kullanmadan önce cerrahi aletler (makas, forseps, hemostatik forseps, iğne tutucular, dikiş iğneleri) ve titanyum-nikel alaşımlı tel (yaklaşık 0,5 mm çapında) otoklavlayın (121 °C, 30 dk).

2. Fare PJI modelinin kurulması

1. 30 C57BL / 6 fareyi (erkek, 15-20 g) rastgele 3 gruba (10 fare / grup), yani kontrol grubu, boş implant grubu ( C. albicans enfeksiyonu olmadan titanyum-nikel tel implantasyonu) ve PJI grubu ( C. albicans enfeksiyonu ile titanyum-nikel tel implantasyonu).
2. Sol arka bacaktaki kılları çıkarmadan ve iyotla dezenfekte etmeden önce% 1-4 izofluran inhalasyonu ile fareleri uyuşturun. Doğrultma refleksinin kaybı ve ayak parmağı uyarımına yanıt verilmemesi anestezinin derinliğini doğrular. Anestezi yaparken, kornea kuruluğunu önlemek ve ameliyat ve iyileşme sırasında ısıyı yenilemek için her iki göze de oftalmik merhem sürün.
3. Kontrol grubundaki fareler için herhangi bir tedavi sağlamayınız. Suya ve yiyeceğe ücretsiz erişim sağlayın.
4. Boş implant grubundaki ve PJI grubundaki fareler için, eklemleri ortaya çıkarmak için #10 bıçak veya steril bir tıraş bıçağı ile her bir sol arka ayağın dizinde 5 mm uzunlamasına bir kesi yapın.
5. Steril bir şırınga (26 G) iğnesi sokarak femoral intramedüller kanalda 5 mm uzunluğunda bir delik açın.
6. Makasla kesmeden önce deliğe pürüzsüz bir nikel-titanyum alaşımlı tel (0.5 mm çapında, 5 mm uzunluğunda) yerleştirin (Şekil 1).
7. Boş implant grubundaki fareler için, naylon bir sütür (0,15 mm çapında) kullanarak yarayı katman katman kapatmadan önce nikel-titanyum alaşımlı tel boyunca damla damla 2 μL YPD ortamı ekleyin.
8. PJI grubundaki fareler için, 2 μL C. albicans hücrelerini (1 × 10⁶ hücre / mL) nikel-titanyum alaşımlı tel boyunca farelerin eklem boşluğuna damla damla aşılayın ve ardından yarayı bir naylon sütür kullanarak katman katman kapatın.
9. Fareleri 14 gün boyunca suya ve yiyeceğe ücretsiz erişimi olan bir yerde barındırın. Meloksikamı 3 güne kadar her 24 saatte bir deri altı enjeksiyonla (4 mg / kg) uygulayın.
10. 14 gün sonra, farelere servikal çıkık ile ötenazi yapmadan önce fareleri% 3 izofluran ile uyuşturun.

3. PJI modeli değerlendirmesi

1. Majör organlardaki enfeksiyonların değerlendirilmesi
   1. Ötenazi yaptıktan sonra farelerden böbrekleri, karaciğeri ve dalağı toplayın.
   2. Her organa 500 μL steril normal salin ekleyin ve dokuları 4 °C'de bir homojenizatörde öğütün.
   3. Adım 3.1.2'de hazırlanan homojenatı 100 μL'lik bir YPD plakasına ekleyin ve ardından bükülmüş bir çubukla eşit şekilde yayın.
   4. YPD plakalarını 48 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre ters çevirerek yerleştirin.
   5. Koloni sayısını görsel olarak gözlemleyin ve sayın.
2. İmplantlarda C. albicans ve biyofilmlerin gözlenmesi
   1. İmplantı cımbızla toplamadan önce cildi farelerin eklemi üzerinde makasla dikkatlice kesin.
   2. İmplantları 48 saat boyunca 4 ° C'de fiksasyon için% 2,5'lik bir glutaraldehit çözeltisine daldırın.
   3. İmplantları 3 saat boyunca% 1 osmiyum asit çözeltisine daldırmadan önce steril PBS ile üç kez durulayın.
   4. İmplantları dehidrasyon için 15 dakika boyunca %50, %70, %80, %90 ve %100 etanol solüsyonlarına daldırmadan önce steril PBS ile üç kez durulayın.
   5. İmplantları dondurarak kurutmadan önce implantları üç kez 30 dakika boyunca tert-bütanol içine daldırın.
   6. İmplant örneklerini numune aşamasına sabitleyin, implantı altınla (10 nm kaplama) püskürtün ve yüksek vakum ve 1,5 kV altında taramalı elektronik mikroskop (SEM) altında gözlemleyin.
3. Femur dokularının patolojik analizi
   1. Farelere ötenazi yaptıktan sonra femur dokularını makasla toplayın.
   2. Femur dokularını 48 saat boyunca 4 ° C'de fiksasyon için% 4 paraformaldehit çözeltisine daldırın.
   3. Femur dokularını 1 hafta boyunca% 10 formalin içine yerleştirin.
   4. Femur dokularını sırasıyla %50, %70, %80, %90 ve %100 etanol solüsyonlarına 15 dakika daldırarak kurutun.
   5. Susuz kalmış femur dokularını, dokuları bir mikrotom kullanarak 4 μm numunelere ayırmadan önce parafine gömün.
   6. Patolojik analizden önce standart bir protokol izleyerek femur bölümlerini hematoksilen ve eozin ile boyayın²¹.

Örneklerin bir plaka ortamına aktarılması ve gece boyunca inkübasyondan sonra kolonilerin sayılması, lezyonun yakınındaki lokal patojen yükünü değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır ^22,23. Çalışmamızda, karaciğer, böbrek ve dalak örneklerinin mikrobiyal kültürü negatifti, bu da bu çalışmadaki modelin farelerde sistemik enfeksiyon yerine sadece lokal enfeksiyona yol açtığını gösteriyor²³.

İmplantların SEM görüntüleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Boş implant grubundaki nikel-titanyum alaşımlı telin yüzeyine hiçbir C. albicans yapışmamış veya kolonize olmamıştır. Bununla birlikte, PJI grubunda nikel-titanyum alaşımlı telin yüzeyinde olgun ve kalın biyofilm gözlendi, bu da ameliyattan 14 gün sonra farelerde C. albicans biyofilm ile ilişkili PJI modelinin başarılı bir şekilde oluşturulduğunu gösteriyor²³.

Femoral dokuların H&E boyaması Şekil 3'te gösterilmiştir. Kontrol grubunda berrak ve tam bir kemik trabeküler yapı gözlenirken, boş implant grubunda femoral dokularda birkaç kemik trabeküler doku defekti görülebiliyordu (Şekil 3, sarı oklar). PEE grubunda kemik trabekülü sayısı anlamlı olarak azaldı²³. Bu sonuçlar, farelerde C. albicans biyofilm ile ilişkili PJI modelinin, femur dokusunun önemli bir patolojik yaralanması ile başarılı bir şekilde kurulduğunu göstermektedir.

Şekil 1: İmplantasyon prosedürü. Sol paneldeki kırmızı kare, pürüzsüz nikel-titanyum alaşımlı telin yerleştirildiği ameliyat bölgesini göstermektedir. Sağdaki panel, nikel tel ile femurun bir kısmını (kırmızı daire) göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İmplantın boş ve PJI gruplarındaki yüzeyinin SEM görüntüleri. 1000x (ölçek çubuğu = 500 μm) ve 5000x (ölçek çubuğu = 100 μm) büyütmeler temsili görüntüler olarak gösterilir. Bu rakam Mo ve ^ark.23'ün izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Femoral dokunun H & E boyaması. İmplantın, PJI modelinin ve kontrol gruplarının temsili H&E görüntüleri şekilde gösterilmiştir. Kontrol grubu berrak ve eksiksiz bir kemik trabeküler yapı gösterir. Boş implant grubunda femoral dokularda birkaç kemik trabeküler doku defekti (sarı oklar) görüldü. Bununla birlikte, PEE grubunda kemik trabeküllerinin sayısı azaldı. Gösterilen büyütmeler 200x (ölçek çubuğu = 150 μm) ve 400x'tir (ölçek çubuğu = 75 μm). Bu rakam Mo ve ^ark.23'ün izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ameliyat sırasında cerrahi aletlerin veya cerrahi ortamın kontaminasyonundan kaynaklanan enfeksiyon, çoğu implant enfeksiyonunun ana nedenidir 24,25,26,27. Bu nedenle, bu çalışmada bir fare C. albicans biyofilm ile ilişkili PJI modeli oluşturulmuştur. İmplant olarak salin içinde süspanse edilmiş steril paslanmaz çelik partiküllerin kullanıldığı geleneksel PEE modeliyle karşılaştırıldığında, bu çalışmada yaygın olarak kullanılan bir implant materyali olan nikel-titanyum alaşımlı bir tel kullanılarak C. albicans, implant materyalleri ve kemik arasındaki temas simüle edilmiştir.

Bu makalede açıklanan PJI modeli, kliniklerde PEE'nin fizyolojik ortamını mükemmel bir şekilde simüle edebilir. Bu model, daha sonra kan yoluyla bulaşan enfeksiyon yerine yalnızca implantasyon sırasındaki enfeksiyonu incelemek için kullanılabilir.

C. albicans iki şekilde aşılanabilir. Biri ameliyat sırasında C. albicans'ın implant bölgesine doğrudan aşılanmasıdır²⁸, diğeri ise cerrahi implantasyondan önce implantın yüzeyinde olgun biyofilmlerin oluşması için implantların bir süre C. albicans ile kültürlenmesidir²⁹. Bu çalışmada ilk yöntem, patojenlerin doğru aşılama sayısı nedeniyle seçilmiştir, bu da gruplar arasında minimum farklılıklar ve sonraki tedavilerin daha objektif bir şekilde değerlendirilmesi ile sonuçlanmıştır. Ayrıca, eski yöntem klinik durumla daha tutarlıdır.

Bu protokolde implantın yerleştirilmesi zordur. Operatör, implantın deri altı veya kas içi yerine eklem içine yerleştirildiğinden emin olmak için birkaç kez pratik yapmalıdır. Ayrıca, C. albicans'ın aşılama sayısı, PEE modelinin tekrarlanabilirliği için hayati önem taşımaktadır. C. albicans , aşılama sayısının doğruluğunu sağlamak için vorteks yoluyla iyice karıştırılmalıdır. Ek olarak, klinik durumda enfeksiyon yolunu simüle etmek için C. albicans alaşımlı tel boyunca eklenmelidir.

Biyofilmler bakteriyel enfeksiyondan 7 gün sonra tespit edilebildi, daha sonra biyofilmler yavaş yavaş arttı ve 14^. günde bir platoya ulaştı³⁰. Bu nedenle, kurulan PJI modelinin başarısı 14^{. günde} denetlendi. C. albicans'ın kolonizasyonu ve implant yüzeyinde biyofilm oluşumu SEM ile incelendi. Lokal enfeksiyonun neden olduğu implant çevresindeki doku lezyonları H&E boyaması sonrası patolojik analiz ile değerlendirildi. Çalışmalar, periprostetik osteolizin PJI^31'e bağlı önemli bir özellik olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu göstergeler PEE^32'nin önlenmesi ve tedavisi için terapötik yöntemlerin değerlendirilmesinde de hayati öneme sahiptir.

Mikrobiyal kültür, kliniklerde ve laboratuvarlarda mikrobiyal enfeksiyonu tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, bu çalışmada implantın mikrobiyal kültürü, implantların etrafındaki dokular, karaciğer ve diğer hayati organlar yapılmıştır. İmplant için, titanyum-nikel alaşımlı telin yüzeyine yapışan C. albicans'ı çıkarmak için ultrasonikasyon uygulandı. Daha sonra, C. albicans mikrobiyal kültürden önce santrifüjleme ile zenginleştirildi. Bununla birlikte, SEM sonucu ile tutarsız negatif bir sonuç bulunmuştur (Şekil 2). SEM sonucu, C. albicans'ın titanyum-nikel alaşımlı telin yüzeyine yapıştığını gösterdi. Bu nedenle, mikrobiyal kültürün sonucu, C. albicans'ın titanyum-nikel alaşımlı tele sıkı bir şekilde yapışmasına atfedilebilecek yanlış bir negatifti; ultrasonik, C. albicans'ı implanttan başarılı bir şekilde pul pul dökemedi. Benzer şekilde, implantların ve hayati organların etrafındaki dokuların mikrobiyal kültürü de negatifti. Bunun iki olası nedeni vardır: (1) Bu çalışmada aşılanan C. albicans sayısı sadece 2000 CFU idi ve bu, deney süresi boyunca çevre dokuyu ve sistemi istila etmek için çok küçük olabilir; (2) Patojenlerin dokulardan çıkarılması ve ayrılması için yöntemin duyarlılığı düşüktür. Daha önce yayınlanmış bir rapor, mikrobiyal kültürün kolayca yanlış negatif sonuçlar gösterebileceğini ve tedavileri geciktirebileceğini öne sürmektedir³³. Grocott-Gomori boyama, kemik ve eklemde hif oluşumunu belirlemek için kullanılabilir³². Ameliyattan önce aşı miktarını arttırmak, deney süresini uzatmak veya fareleri bağışıklığı baskılanmış bir durumda tutmak da yararlı olabilir³². Bununla birlikte, uzun süreli enfeksiyonun derin enfeksiyona ve hatta sistemik enfeksiyona yol açabileceği unutulmamalıdır. Bu nedenle, deney süresi özel amaca göre tasarlanmalıdır.

Özetle, bu çalışma, C. albicans biyofilm ile ilişkili PIJ'nin önlenmesi ve tedavisinin araştırılması için büyük önem taşıyabilecek başarılı bir C . albicans biyofilm ilişkili PJI fare modeli oluşturmuştur.

Yazarlar, bu yazıda bildirilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek bilinen hiçbir rakip mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.

Shaanxi Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (hibe numarası 2021SF-118) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (hibe numaraları 81973409, 82204631) gelen mali destek için minnettarız.