מודל זיהום במפרק פריפרוסתי קנדידה אלביקנס בעכבר

זיהום מפרק פריפרוסתטי (PJI) הנגרם על ידי פתוגנים מסוכנים נפוץ באורתופדיה קלינית. מודלים קיימים של בעלי חיים אינם יכולים לדמות במדויק את המצב האמיתי של PJI. כאן, הקמנו מודל עכבר PJI הקשור לביופילם קנדידה אלביקנס כדי לחקור ולפתח טיפולים חדשים עבור PJI.

זיהום מפרק פריפרוסתטי (PJI) הוא אחד הזיהומים הנפוצים הנגרמים על ידי קנדידה אלביקנס (C. albicans), אשר מדאיג יותר ויותר מנתחים ומדענים. באופן כללי, ביופילמים שיכולים להגן על C. albicans מפני אנטיביוטיקה ופינוי חיסוני נוצרים באתר הזיהום. ניתוח הכולל הסרת השתל הנגוע, הטריה, טיפול אנטי מיקרוביאלי והשתלה מחדש הוא תקן הזהב לטיפול ב- PJI. לפיכך, לביסוס מודלים של PJI בבעלי חיים יש משמעות רבה למחקר ופיתוח של תרופות או טיפולים חדשים עבור PJI. במחקר זה, חוט סגסוגת ניקל-טיטניום חלק, שתל בשימוש נרחב במרפאות אורתופדיות, הוחדר למפרק הירך של עכבר C57BL/6 לפני שחוסנו C. albicans לחלל המפרקי לאורך החוט. לאחר 14 יום, ביופילמים בוגרים ועבים נצפו על פני השטח של שתלים תחת מיקרוסקופ אלקטרוני סורק (SEM). נמצאה ירידה משמעותית בטרבקולה של העצם בצביעת H&E של דגימות המפרקים הנגועות. לסיכום, הוקם מודל PJI עכברי עם יתרונות של הפעלה קלה, שיעור הצלחה גבוה, חזרתיות גבוהה ומתאם קליני גבוה. זה צפוי להיות מודל חשוב למחקרים קליניים של מניעת PJI הקשורה לביופילם של C. albicans.

קנדידה אלביקנס (C. albicans) מתגוררת בחלקים רבים של גוף האדם¹, שהוא גם הפתוגן האופורטוניסטי הנפוץ ביותר הגורם לזיהומים פטרייתיים פולשניים מסכני חיים, במיוחד בחולים מדוכאי חיסון ^2,3. C. albicans יכול להשתנות בין מצב שמרים ותפטיר כפטרייה פולימורפית. מצב התפטיר מציג אלימות גבוהה יותר, הידבקות חזקה יותר, ופלישה של תאים ורקמות ^4,5. חוץ מזה, C. albicans יכול ליצור ביופילמים על פני השטח של חומרים ביו-רפואיים כגון תותבות, קטטרים וסטנטים ^1,6,7. המבנה התלת-ממדי הצפוף של ביופילמים מגביל את חדירת התרופות האנטי-פטרייתיות, מבטא גנים עמידים לתרופות, ומווסת מטה את חילוף החומרים של תאים פטרייתיים כדי להתנגד לסילוק מערכת החיסון ^6,7. לכן, זיהומים הקשורים לביופילמים הם די מאתגרים במרפאות⁸.

Staphylococcus aureus, staphylococcus שלילי coagulase, ו enterobacter הם הפתוגנים העיקריים הגורמים PJI⁹. למרות ששכיחות PJI פטרייתי נמוכה יחסית (כ-1%)¹⁰, עלות הטיפול ב-PJI פטרייתי גבוהה יותר¹¹, מחזור הטיפול ארוך יותר¹¹, ושיעור הצלחת הטיפול נמוך^ב-10 מאשר PJI חיידקי. בשנים האחרונות, שכיחות PJI פטרייתי עולה משנה לשנה¹⁰. קנדידה PJI מהווה 77%-84% מהפטריות PJI^10,12, ו- C. albicans הוא הנפוץ ביותר בקנדידה (54%). לכן, PJI פטרייתי צריך להילמד.

נכון לעכשיו, PJI מטופל באמצעות ניתוח רוויזיה על ידי (1) הסרת השתל הנגוע, (2) הטריה, (3) טיפול מיקרוביאלי, ו (4) השתלה מחדש. לאחר הטריה יסודית, אנטיביוטיקה המכילה מלט עצם ממוקם, והחולה מטופל באנטיביוטיקה באופן סיסטמי במשך יותר מ -6 שבועות כדי לשלוט ביעילות בזיהום לפני הצבת שתל חדש¹³. עם זאת, שיטה זו אינה יכולה לחסל באופן מלא פתוגנים ברקמות, וזיהומים חוזרים המטופלים בטיפול אנטי-מיקרוביאלי ארוך טווח נוטים מאוד להתפתח בזנים עמידים לתרופות 14,15,16.

ביסוס מודלים של PJI בבעלי חיים חשוב למחקר ופיתוח של תרופות או טיפולים חדשים עבור PJI. בהתפתחות PJI נוצרים חללים מתים גדולים סביב התותבת, מה שמוביל להיווצרות המטומות, אשר חוסמות עוד יותר את אספקת הדם של הרקמות הסובבות ופוגעות בהשפעת אנטיביוטיקה^11,15. בשל הקושי לחקות את הסביבה הסובבת את התותבת, מודלים מסורתיים של בעלי חיים אינם יכולים לדמות במדויק את המצב האמיתי של PJI^17,18.

במאמר זה, מודל PJI הקשור לביופילם של C. albicans בעכברים נבנה על ידי שימוש בחוט טיטניום-ניקל הנמצא בשימוש קליני נרחב כדי לדמות שתלי מפרקים^19,20. מודל PJI זה מציג את היתרונות של הפעלה קלה, שיעור הצלחה גבוה, חזרתיות גבוהה ומתאם קליני גבוה. הוא צפוי להיות מודל חשוב לחקר מניעה וטיפול ב-PJI הקשור לביופילם של C. albicans.

החיות נרכשו מאוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג. כל הליכי הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה האתית המוסדית לבעלי חיים של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג (מספר אישור: SCXK [שאאנשי] 2021-103). העכברים הוחזקו במשך שבוע עם 5 עכברים בכל כלוב. הותרה להם גישה חופשית למזון ולמים. בעלי החיים הוחזקו בטמפרטורת החדר (RT; 24 ° C ± 1 ° C) ובמחזור בהיר / כהה (12 שעות / 12 שעות) לפני ביצוע המחקר.

1. חיץ והכנת ציוד

1. C. albicans תרבית תאים
   1. יש לחסן מושבה חד-שבטית של C. albicans (SC5314) מצלחת פפטון דקסטרוז (YPD) תמצית שמרים עם לולאה מחסנת ל-5 מ"ל של מדיום נוזלי YPD (YPD + 50 מיקרוגרם/מ"ל קרבניצלין).
   2. לאחר מכן נערו את תאי C. albicans במהירות של 220 סל"ד ב-30°C למשך הלילה.
   3. צנטריפוגה את המתלה ב 400 x g במשך 5 דקות ב RT. להשעות מחדש את תאי C. albicans במי מלח רגילים ולדלל את ריכוז התאים ל 1 x 10⁶ תאים / מ"ל באמצעות התאמה חזותית של העכירות להיות זהה 0.5 McFarland.
2. הכנת מי מלח רגילים
   1. שוקלים 0.9 גרם נתרן כלורי וממיסים ב -100 מ"ל של מים נטולי יונים, כדי להכין 0.9% מלוחים רגילים.
3. הכנת כלי ניתוח
   1. Autoclave (121°C, 30 דקות) כלי הניתוח (מספריים, מלקחיים, מלקחיים המוסטטיים, מחזיקי מחט, מחטי תפרים) וחוט סגסוגת טיטניום-ניקל (כ-0.5 מ"מ קוטר) לפני השימוש.

2. הקמת מודל PJI עכבר

1. חלקו באופן אקראי 30 עכברי C57BL/6 (זכר, 15-20 גרם) לשלוש קבוצות (10 עכברים לקבוצה), כלומר, קבוצת ביקורת, קבוצת שתל ריק (השתלת חוט טיטניום-ניקל ללא זיהום C. albicans ), וקבוצת PJI (השתלת חוטי טיטניום-ניקל עם זיהום C. albicans ).
2. מרדימים את העכברים בשאיפת איזופלורן 1-4% לפני הסרת השיער בגפה האחורית השמאלית ומחטאים אותו ביוד. אובדן רפלקס הימין ואי תגובה לגירוי הבוהן מאשרים את עומק ההרדמה. בזמן ההרדמה יש למרוח משחה אופתלמית על שתי העיניים כדי למנוע יובש בקרנית ולחדש את החום במהלך הניתוח וההתאוששות.
3. עבור העכברים בקבוצת הביקורת, אין לספק כל טיפול. לספק להם גישה חופשית למים ולמזון.
4. עבור עכברים בקבוצת השתלים הריקים ובקבוצת PJI, בצע חתך אורכי 5 מ"מ בברך של כל גפה אחורית שמאלית עם להב #10 או סכין גילוח סטרילי כדי לחשוף מפרקים.
5. צור חור באורך 5 מ"מ בתעלה התוך-מדולרית של עצם הירך על ידי החדרת מזרק סטרילי (26 גרם) מחט.
6. הכניסו חוט סגסוגת ניקל-טיטניום חלק (קוטר 0.5 מ"מ, אורך 5 מ"מ) לתוך החור לפני חיתוך במספריים (איור 1).
7. עבור עכברים בקבוצת השתלים הריקים, יש להוסיף 2 μL של תווך YPD לאורך חוט סגסוגת ניקל-טיטניום טיפה אחר טיפה לפני סגירת שכבת הפצע שכבה אחר שכבה באמצעות תפר ניילון (קוטר 0.15 מ"מ).
8. עבור עכברים בקבוצת PJI, יש לחסן 2 μL של תאי C. albicans (1 × 10⁶ תאים/מ"ל) לחלל המפרק של עכברים לאורך חוט סגסוגת ניקל-טיטניום טיפה אחר טיפה לפני סגירת הפצע שכבה אחר שכבה באמצעות תפר ניילון.
9. שכן את העכברים עם גישה חופשית למים ומזון למשך 14 יום. מתן meloxicam על ידי הזרקה תת עורית (4 מ"ג / ק"ג) כל 24 שעות עד 3 ימים.
10. לאחר 14 יום, יש להרדים את העכברים עם איזופלורן 3% לפני המתת העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם.

3. הערכת מודל PJI

1. הערכת זיהומים באיברים מרכזיים
   1. אספו את הכליות, הכבד והטחול מהעכברים לאחר המתת חסד.
   2. הוסף 500 μL של מלוחים נורמליים סטריליים בכל איבר ולטחון את הרקמות על הומוגנייזר ב 4 ° C.
   3. הוסף 100 μL של הומוגנט מוכן בשלב 3.1.2 לצלחת YPD לפני פיזור אותו באופן שווה עם מוט כפוף.
   4. מניחים את לוחות YPD הפוכים לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
   5. התבוננו וספרו את מספר המושבות באופן חזותי.
2. תצפית של C. albicans וביופילמים על השתלים
   1. בזהירות לחתוך את העור מעל המפרק של העכברים עם מספריים לפני איסוף השתל עם פינצטה.
   2. שמור את השתלים שקועים בתמיסת גלוטראלדהיד 2.5% לקיבוע ב-4°C למשך 48 שעות.
   3. שטפו את השתלים עם PBS סטרילי שלוש פעמים לפני טבילתם בתמיסת חומצת אוסמיום 1% למשך 3 שעות.
   4. שטפו את השתלים עם PBS סטרילי שלוש פעמים לפני טבילתם בתמיסות אתנול 50%, 70%, 80%, 90% ו-100% אתנול למשך 15 דקות להתייבשות.
   5. שמור את השתלים שקועים בטרט-בוטנול למשך 30 דקות שלוש פעמים לפני ייבוש בהקפאה של השתלים.
   6. קיבעו את דגימות השתל לשלב הדגימה, צפו את השתל בזהב (ציפוי 10 ננומטר) והתבוננו בו תחת מיקרוסקופ אלקטרוני סורק (SEM) תחת ואקום גבוה ו-1.5 קילו-וולט.
3. ניתוח פתולוגי של רקמות הירך
   1. לאסוף את רקמות הירך עם מספריים לאחר המתת העכברים.
   2. לטבול את רקמות עצם הירך בתמיסת פרפורמלדהיד 4% לקיבוע ב 4 ° C למשך 48 שעות.
   3. מניחים את רקמות עצם הירך בפורמלין 10% למשך שבוע אחד.
   4. יש לייבש את רקמות עצם הירך על ידי טבילתן בתמיסות אתנול 50%, 70%, 80%, 90% ו-100% אתנול למשך 15 דקות, בהתאמה.
   5. הטמע את רקמות עצם הירך המיובשות בפרפין לפני חלוקת הרקמות לדגימות של 4 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום.
   6. לצבוע את קטעי הירך עם hematoxylin ו eosin על ידי ביצוע פרוטוקול סטנדרטי לפני ניתוח פתולוגי²¹.

העברת הדגימות לצלחת בינונית וספירת מושבות לאחר דגירה לילית משמשת בדרך כלל להערכת עומס הפתוגן המקומי ליד הנגע^22,23. במחקר שלנו, התרבית המיקרוביאלית של דגימות כבד, כליות וטחול הייתה שלילית, מה שמצביע על כך שהמודל במחקר זה הוביל רק להדבקה מקומית במקום זיהום מערכתי בעכברים²³.

תמונות SEM של השתלים מוצגות באיור 2. אף C. albicans לא נדבק או התיישב על פני השטח של חוט סגסוגת ניקל-טיטניום בקבוצת השתלים הריקים. עם זאת, ביופילם בוגר ועבה נצפה על פני השטח של חוט סגסוגת ניקל-טיטניום בקבוצת PJI, מה שמצביע על בנייה מוצלחת של מודל PJI הקשור לביופילם C. albicans בעכברים 14 יום לאחר הניתוח²³.

צביעת H&E של רקמות הירך מוצגת באיור 3. בקבוצת הביקורת נצפה מבנה טרבקולרי ברור ושלם, בעוד שבקבוצת השתלים הריקים ניתן היה לראות כמה פגמים ברקמת עצם הירך (איור 3, חיצים צהובים). בקבוצת PJI, מספר קנה הנשימה של העצם ירד באופן משמעותי²³. תוצאות אלה מצביעות על כך שמודל PJI הקשור לביופילם של C. albicans בעכברים הוכח בהצלחה עם פגיעה פתולוגית משמעותית ברקמת עצם הירך.

איור 1: הליך ההשתלה. הריבוע האדום בלוח השמאלי מראה את אתר הניתוח שבו מוכנס חוט סגסוגת ניקל-טיטניום חלק. הלוח מימין מראה חלק מעצם הירך (עיגול אדום) עם חוט ניקל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונות SEM של פני השטח של השתל בקבוצות הריקות וה-PJI. הגדלות 1000x (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר) ו- 5000x (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר) מוצגות כתמונות מייצגות. נתון זה שונה באישור Mo et ^al.23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: צביעת H&E של רקמת הירך. תמונות H&E מייצגות של השתל, מודל PJI וקבוצות ביקורת מוצגות באיור. קבוצת הביקורת מראה מבנה טרבקולרי עצם ברור ושלם. קבוצת השתלים הריקים הראתה כמה פגמים ברקמת עצם העצם ברקמות הירך (חיצים צהובים). עם זאת, מספר קנה הנשימה של העצם ירד בקבוצת PJI. ההגדלות המוצגות הן 200x (סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר) ו- 400x (סרגל קנה מידה = 75 מיקרומטר). נתון זה שונה באישור Mo et ^al.23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הזיהום הנגרם על ידי זיהום של כלי ניתוח או הסביבה הכירורגית במהלך הניתוח הוא הסיבה העיקרית לרוב זיהומים שתלים 24,25,26,27. לכן, במחקר זה נבנה מודל PJI הקשור לביופילם של עכבר C. albicans. בהשוואה למודל PJI המסורתי שבו נעשה שימוש בחלקיקי נירוסטה סטריליים המרחפים במי מלח כשתל, במחקר זה נעשה שימוש בחוט סגסוגת ניקל-טיטניום, חומר שתל נפוץ, כדי לדמות את המגע בין C. albicans, חומרי השתל והעצם, הדומה יותר למצב במרפאות.

מודל PJI המתואר במאמר זה יכול לדמות באופן מושלם את הסביבה הפיזיולוגית של PJI במרפאות. מודל זה יכול לשמש רק כדי לחקור את הזיהום במהלך ההשתלה במקום זיהום מאוחר יותר המועבר בדם.

C. albicans ניתן לחסן בשתי דרכים. האחד הוא חיסון ישיר של C. albicans באתר השתל במהלך ניתוח²⁸, והשני הוא טיפוח השתלים עם C. albicans לתקופה של זמן, כך ביופילמים בוגרים נוצרים על פני השטח של השתל לפני השתלה כירורגית²⁹. השיטה הראשונה נבחרה במחקר זה בשל מספר החיסון המדויק של פתוגנים, שהביא להבדלים מינימליים בין קבוצות והערכה אובייקטיבית יותר של הטיפולים הבאים. יתר על כן, השיטה הראשונה עקבית יותר עם המצב הקליני.

בפרוטוקול זה, החדרת השתל קשה לביצוע. על המפעיל להתאמן מספר פעמים כדי לוודא שהשתל מוכנס למפרק במקום תת עורית או תוך שרירית. חוץ מזה, מספר החיסון של C. albicans חיוני לחזרתיות של מודל PJI. C. albicans יש לערבב היטב באמצעות מערבולת כדי להבטיח את דיוק מספר החיסון. בנוסף, יש להוסיף את C. albicans לאורך חוט הסגסוגת כדי לדמות את מסלול הזיהום במצב הקליני.

ביופילמים יכולים להיות מזוהים 7 ימים לאחר זיהום חיידקי, ולאחר מכן ביופילמים גדל בהדרגה והגיע לרמה ביום ה^- 14³⁰. לכן, ההצלחה של מודל PJI הוקמה נבדקה ביום ה^- 14. ההתיישבות של C. albicans והיווצרות ביופילם על פני השטח של השתל נבדקו על ידי SEM. נגעי הרקמה סביב השתל שנגרמו על ידי זיהום מקומי הוערכו על ידי ניתוח פתולוגי לאחר צביעת H&E. מחקרים הראו כי אוסטאוליזה פריפרוסתטית היא תכונה חשובה עקב PJI³¹. לפיכך, אינדיקטורים אלה חיוניים גם בהערכת שיטות טיפוליות למניעה וטיפול ב- PJI³².

תרבית מיקרוביאלית משמשת בדרך כלל לאיתור זיהום מיקרוביאלי במרפאות ובמעבדות. לכן, במחקר זה בוצעה התרבית המיקרוביאלית של השתל, רקמות סביב שתלים, כבד ואיברים חיוניים אחרים. עבור השתל, אולטרסוניקציה הוחלה כדי להסיר את C. albicans דבק על פני השטח של חוט סגסוגת טיטניום-ניקל. לאחר מכן, C. albicans הועשרו על ידי צנטריפוגות לפני תרבית מיקרוביאלית. עם זאת, נמצאה תוצאה שלילית, שאינה עולה בקנה אחד עם תוצאת SEM (איור 2). תוצאת SEM הראתה כי C. albicans נדבק לפני השטח של חוט סגסוגת טיטניום-ניקל. לכן, התוצאה של תרבית מיקרוביאלית הייתה שלילי כוזב, אשר ניתן לייחס להידבקות הדוקה של C. albicans לחוט סגסוגת טיטניום-ניקל; אולטרסאונד לא הצליח לקלף בהצלחה את C. albicans מהשתל. באופן דומה, גם התרבית המיקרוביאלית של הרקמות סביב שתלים ואיברים חיוניים הייתה שלילית. ישנן שתי סיבות אפשריות: (1) מספר C. albicans שחוסנו במחקר זה היה רק 2000 CFU, אשר עשוי להיות קטן מכדי לפלוש לרקמה שמסביב ולמערכת במהלך תקופת הניסוי; (2) רגישות השיטה לחילוץ והפרדת פתוגנים מרקמות נמוכה. דו"ח שפורסם בעבר מצביע על כך שתרבית מיקרוביאלית יכולה בקלות להראות תוצאות שליליות כוזבות ועיכוב טיפולים³³. ניתן להשתמש בצביעת גרוקוט-גומורי כדי לקבוע את היווצרות הקורים בעצם ובמפרק³². זה עשוי גם להיות מועיל להגדיל את כמות החיסון, להאריך את משך הניסוי או לשמור על העכברים במצב מדוכא חיסון לפני ניתוח³². עם זאת, יש לציין כי הדבקה ממושכת עלולה להוביל להדבקה עמוקה או אפילו מערכתית. לפיכך, יש לתכנן את תקופת הניסוי בהתאם למטרה הספציפית.

לסיכום, מחקר זה יצר מודל עכברי מוצלח של PJI הקשור לביופילם של C. albicans , אשר עשוי להיות בעל משמעות רבה לחקר המניעה והטיפול ב- PIJ הקשור לביופילם של C. albicans .

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

אנו אסירי תודה על התמיכה הכספית מהקרן למדעי הטבע של מחוז שאאנשי (מענק מספר 2021SF-118) ומהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספרי מענק 81973409, 82204631).