小鼠假体周围关节 白色念珠菌 感染模型

由危险病原体引起的假体周围关节感染 （PJI） 在临床骨科中很常见。现有的动物模型无法准确模拟PJI的实际情况。在这里，我们建立了一个 白色念珠菌 生物膜相关的PJI小鼠模型，以研究和开发PJI的新疗法。

假体周围关节感染 （PJI） 是由 白色念珠菌 （C. albicans） 引起的常见感染之一， 越来越受到外科医生和科学家的关注。通常，可以在感染部位形成可以保护 白色念珠菌 免受抗生素和免疫清除的生物膜。手术包括切除受感染的植入物、清创术、抗菌治疗和再植入术是治疗 PJI 的金标准。因此，建立动物PJI模型对于PJI新药或新疗法的研发具有重要意义。在这项研究中，将一根光滑的镍钛合金丝（骨科诊所广泛使用的植入物）插入 C57BL/6 小鼠的股骨关节，然后沿线将 白色念珠菌 接种到关节腔中。14天后，在扫描电子显微镜（SEM）下在植入物表面观察到成熟和厚厚的生物膜。在感染关节标本的H&E染色中发现骨小梁明显减少。综上所述，建立了具有操作简便、成功率高、重复性高、临床相关性高等优点的小鼠PJI模型。这有望成为白色 念珠菌 生物膜相关PJI预防临床研究的重要模型。

白色念珠菌（白色念珠菌）共存于人体的许多部位¹，这也是最常见的机会性病原体，可引起危及生命的侵袭性真菌感染，尤其是在免疫功能低下的患者^中2,3。白色念珠菌可以作为多态性真菌在酵母和菌丝体状态之间转化。菌丝体状态表现出更高的毒力、更强的粘附性以及对细胞和组织的侵袭 ^4,5。此外，白色念珠菌可以在假牙、导管和支架等生物医学材料的表面形成生物膜^1,6,7。生物膜致密的三维结构限制了抗真菌药物的浸润，表达耐药基因，下调真菌细胞的代谢以抵抗免疫系统清除^6,7。因此，与生物膜相关的感染在临床中非常具有挑战性⁸.

金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和肠杆菌是引起PJI⁹的主要病原体。虽然真菌PJI的发生率相对较低（约1%）¹⁰，但真菌PJI的治疗成本较高¹¹，治疗周期较长¹¹，治疗成功率低于细菌^PJI10。近年来，真菌PJI的发病率逐年增加¹⁰。念珠菌PJI占真菌^{PJI 10,12}的77%-84%，白色念珠菌是念珠菌中最常见（54%）。因此，需要研究真菌PJI。

目前，PJI 通过翻修手术进行治疗，包括 （1） 移除受感染的植入物、（2） 清创术、（3） 抗菌治疗和 （4） 再植入。彻底清创后，放置含有骨水泥的抗生素，并对患者进行全身抗生素治疗 6 周以上，以有效控制感染，然后再放置新的植入物¹³。然而，这种方法不能完全消除组织中的病原体，并且用长期抗菌治疗治疗的复发性感染极有可能在耐药菌株中发展14,15,16。

建立PJI的动物模型对于PJI新药或疗法的研发具有重要意义。在PJI的发展中，假体周围形成大的死腔，导致血肿的形成，血肿进一步阻塞周围组织的血液供应并损害抗生素^{的作用11,15}。由于难以模拟假体的周围环境，传统的动物模型无法准确模拟PJI^17,18的实际情况。

在本文中，通过使用临床上广泛使用的钛镍丝来模拟关节植入物，在小鼠中构建了白色念珠菌生物膜相关的PJI模型^19,20。该PJI模型具有操作简单、成功率高、重复性高、临床相关性高等优点。有望成为研究白色念珠菌生物膜相关PJI防治的重要模型。

这些动物是从习交通大学购买的。所有动物实验程序均经习交通大学动物伦理学委员会批准（批准号：SCXK [陕西] 2021-103）。将小鼠饲养一周，每个笼子饲养5只小鼠。他们被允许免费获得食物和水。在进行研究之前，将动物保持在室温（RT;24°C±1°C）和光/暗循环（12小时/12小时）下。

1.缓冲液和设备准备

1. 白色念珠菌 细胞培养
   1. 将酵母提取物蛋白胨葡萄糖 （YPD） 平板培养基 中的白色念珠菌 单克隆菌落 （SC5314） 接种到 5 mL YPD 液体培养基（YPD + 50 μg/mL 羧苄青霉素）中。
   2. 随后在30°C下以220rpm的速度摇动 白色念珠菌 细胞过夜。
   3. 在室温下以400× g 离心悬浮液5分钟，将 白色念珠菌 细胞重悬于生理盐水中，并通过目视调节浊度将细胞浓度稀释至1×10⁶ 个细胞/ mL与0.5McFarland相同。
2. 生理盐水的制备
   1. 称取 0.9 g 氯化钠，溶于 100 mL 去离子水中，制备 0.9% 生理盐水。
3. 手术器械制备
   1. 使用前高压灭菌（121°C，30分钟）手术器械（剪刀，镊子，止血钳，针架，缝合针）和钛镍合金丝（直径约0.5mm）。

2. 小鼠PJI模型建立

1. 将30只C57BL/6小鼠（雄性，15-20g）随机分为3组（10只小鼠/组），即对照组、空白植入组（钛镍丝植入无 白色念珠菌 感染）和PJI组（钛镍丝植入伴 白色念 珠菌感染）。
2. 用1-4%异氟烷吸入麻醉小鼠，然后去除左后肢上的毛发并用碘消毒。矫正反射的丧失和对脚趾刺激无反应证实了麻醉的深度。麻醉时，在双眼上涂抹眼药膏，以防止角膜干燥，并在手术和恢复期间补充热量。
3. 对于对照组中的小鼠，不提供任何治疗。为他们提供免费的水和食物。
4. 对于空白植入物组和PJI组的小鼠，用#5刀片或无菌剃须刀在每个左后肢的膝盖上做一个10毫米的纵向切口，以暴露关节。
5. 通过插入无菌注射器（26G）针头，在股骨髓内管上打一个5毫米长的孔。
6. 在用剪刀切割之前，将光滑的镍钛合金线（直径 0.5 毫米，长 5 毫米）插入孔中（图 1）。
7. 对于空白植入物组中的小鼠，在使用尼龙缝合线（直径0.15mm）逐层闭合伤口之前，沿着镍钛合金丝逐滴加入2μLYPD培养基。
8. 对于PJI组中的小鼠，将2μL白色 念珠菌 细胞（1×106^个细胞 / mL）沿镍钛合金丝逐滴接种到小鼠的关节空间中，然后使用尼龙缝合线逐层闭合伤口。
9. 将小鼠饲养 14 天，免费获得水和食物。每 24 小时皮下注射 （4 mg/kg） 给药美洛昔康，最多 3 天。
10. 14天后，用3%异氟醚麻醉小鼠，然后通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。

3. PJI模型评估

1. 主要器官感染的评估
   1. 安乐死后从小鼠身上收集肾脏、肝脏和脾脏。
   2. 在每个器官中加入500μL无菌生理盐水，并在4°C的匀浆器上研磨组织。
   3. 将步骤3.1.2中制备的100μL匀浆加入YPD板中，然后用弯曲的棒均匀铺开。
   4. 将YPD板倒置置在37°C培养箱中48小时。
   5. 目视观察并计算菌落数量。
2. 观察植入物上的 白色念珠菌 和生物膜
   1. 在用镊子收集植入物之前，用剪刀小心地剪开小鼠关节上的皮肤。
   2. 将植入物浸入2.5%戊二醛溶液中，以便在4°C下固定48小时。
   3. 用无菌PBS冲洗植入物三次，然后将其浸入1%锇酸溶液中3小时。
   4. 用无菌PBS冲洗植入物三次，然后将其浸入50%，70%，80%，90%和100%乙醇溶液中15分钟进行脱水。
   5. 在冷冻干燥植入物之前，将植入物浸入叔丁醇中 30 分钟三次。
   6. 将植入物样品固定在样品台上，用金（10 nm涂层）溅射涂覆植入物，并在高真空和1.5 kV的扫描电子显微镜（SEM）下观察它。
3. 股骨组织的病理分析
   1. 对小鼠实施安乐死后用剪刀收集股组织。
   2. 将股骨组织浸入4%多聚甲醛溶液中，在4°C下固定48小时。
   3. 将股骨组织置于10%福尔马林中1周。
   4. 将股组织分别浸入50%、70%、80%、90%和100%乙醇溶液中15分钟，使股组织脱水。
   5. 将脱水的股组织嵌入石蜡中，然后使用切片机将组织切成4μm样品。
   6. 在病理分析之前，按照标准方案用苏木精和伊红染色股骨切片²¹.

将样品转移到平板培养基上并在孵育过夜后计数菌落通常用于评估病灶附近的局部病原体载量^22,23。在我们的研究中，肝脏、肾脏和脾脏样本的微生物培养呈阴性，表明本研究中的模型仅导致小鼠的局部感染而不是全身感染²³。

植入物的SEM图像如 图2所示。在空白植入物组中，没有白色 念 珠菌粘附或定植在镍钛合金丝的表面。然而，在PJI组的镍钛合金线材表面观察到成熟而厚的生物膜，表明在手术后14天的小鼠中成功构建 了白色念珠菌 生物膜相关的PJI模型²³。

股组织的H&E染色如 图3所示。在对照组中观察到清晰完整的骨小梁结构，而在空白植入物组中可以看到股组织中的一些骨小梁组织缺损（图3，黄色箭头）。PJI组骨小梁数量显著减少²³个。这些结果表明，在股组织存在显著病理损伤的情况下，成功建立了小鼠白色 念珠菌 生物膜相关PJI模型。

图 1：植入过程。 左图中的红色方块显示了插入光滑镍钛合金线的手术部位。右边的面板显示了带有镍丝的股骨的一部分（红色圆圈）。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2：空白组和 PJI 组中植入物表面的 SEM 图像。 放大倍率 1000 倍（比例尺 = 500 μm）和 5000 倍（比例尺 = 100 μm）显示为代表性图像。该图经 Mo et ^al.23 许可修改。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3：股组织的H&E染色。 图中显示了植入物、PJI 模型和对照组的代表性 H&E 图像。对照组骨小梁结构清晰完整。空白种植体组在股组织中显示一些骨小梁组织缺损（黄色箭头）。然而，PJI组的骨小梁数量减少。显示的放大倍率为 200 倍（比例尺 = 150 μm）和 400 倍（比例尺 = 75 μm）。该图经 Mo et ^al.23 许可修改。 请点击这里查看此图的较大版本.

手术过程中手术器械或手术环境的污染引起的感染是大多数植入物感染的主要原因24,25,26,27。因此，本研究构建了小鼠白色念珠菌生物膜相关PJI模型。与传统的PJI模型相比，以悬浮在盐水中的无菌不锈钢颗粒为植入物，本研究使用常用的植入物材料镍钛合金丝来模拟白色念珠菌、植入物材料与骨骼之间的接触，这与临床情况更相似。

本文描述的PJI模型可以完美地模拟PJI在临床上的生理环境。该模型只能用于研究植入过程中的感染，而不是后来的血源性感染。

白色念珠菌可以通过两种方式接种。一种是在手术²⁸期间直接在植入部位接种白色念珠菌，另一种是用白色念珠菌培养植入物一段时间，以便在手术植入前在植入物表面形成成熟的生物膜²⁹。本研究之所以选择前一种方法，是因为其病原体的接种数量准确，导致组间差异最小，并对后续治疗进行更客观的评估。而且，前一种方法更符合临床情况。

在该协议中，植入物的插入很难执行。操作者必须多次练习，以确保植入物插入关节而不是皮下或肌肉注射。此外， 白色念珠菌 的接种数量对PJI模型的重复性至关重要。 白色念珠菌 应通过涡旋彻底混合，以确保接种数的准确性。此外，应沿合金丝添加 白色念珠菌 ，以模拟临床情况下的感染途径。

细菌感染后7天可检测到生物膜，之后生物膜逐渐增加，并在^第 14天^{达到平台期30}。因此，^在第 14天检查了已建立的PJI模型的成功。通过SEM检查 白色念珠菌 的定植和植入物表面生物膜的形成。H&E染色后通过病理分析评估植入物周围由局部感染引起的组织病变。研究表明，假体周围骨溶解是 PJI³¹ 的一个重要特征。因此，这些指标对于评估预防和治疗PJI³²的治疗方法也至关重要。

微生物培养通常用于检测诊所和实验室的微生物感染。因此，在这项研究中，对植入物、植入物周围的组织、肝脏和其他重要器官进行了微生物培养。对于植入物，应用超声波以去除粘附在钛镍合金线表面的 白色念珠菌 。接下来，在微生物培养前通过离心富集 白色念珠菌 。然而，发现结果为阴性，与SEM结果不一致（图2）。SEM结果表明， 白色念珠菌 粘附在钛镍合金线材表面。因此，微生物培养的结果是假阴性，这可能归因于 白色念珠菌 与钛镍合金丝的紧密粘附;超声波无法成功去除植入物中的 白色念珠菌 。同样，植入物和重要器官周围组织的微生物培养也是阴性的。可能的原因有二：（1）本研究接种的 白色念珠菌 数量仅为2000 CFU，在实验期间可能太小而无法侵入周围组织和系统;（2）从组织中提取分离病原体的方法灵敏度低。先前发表的一份报告表明，微生物培养很容易显示假阴性结果和延迟治疗³³。Grocott-Gomori染色可用于确定骨和关节中菌丝^的形成32。增加接种量，延长实验时间或在手术前使小鼠保持免疫抑制状态也可能有所帮助³²。但需要注意的是，长期感染可能导致深部感染甚至全身感染。因此，实验期应根据具体目的进行设计。

综上所述，本研究成功建立了 白色念珠 菌生物膜相关PJI小鼠模型，对白色 念珠菌 生物膜相关PIJ的防治具有重要意义。

作者声明，他们没有已知的相互竞争的经济利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本文所报告的工作。

感谢陕西省自然科学基金（批准号：2021SF-118）和国家自然科学基金（批准号：81973409,82204631）的财政支持。