Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

İç kulak sesi algılar ve koklea ve antreyi kullanarak dengeyi korur. Bunu, saç hücresi olarak bilinen özel bir mekanosensoriyel hücre tipi kullanarak yapar. İç kulaktaki temel araştırmalar, saç hücresinin nasıl çalıştığının ve düzensizliğin işitme kaybına ve vertigoya nasıl yol açabileceğinin derinlemesine anlaşılmasını sağlamıştır. Bu araştırma için, fare önde gelen model sistemi olmuştur. Bununla birlikte, fareler, tüm memeliler gibi, saç hücrelerini değiştirme yeteneğini kaybetmişlerdir. Bu nedenle, iç kulak fonksiyonunu geri kazanmak için hücresel tedavileri anlamaya çalışırken, diğer omurgalı türlerinde tamamlayıcı çalışmalar daha fazla bilgi sağlayabilir. Kuşların işitsel epiteli olan baziler papilla (BP), destekleyici hücreler (SC'ler) tarafından interkalize edilmiş mekanosensoriyel saç hücrelerinden (HC'ler) oluşan bir epitel tabakasıdır. Baziller papilla ve memeli kokleanın anatomik mimarisi farklı olsa da, iç kulak gelişimi ve işitmenin moleküler mekanizmaları benzerdir. Bu, baziler papillayı sadece karşılaştırmalı çalışmalar için değil, aynı zamanda rejenerasyonu anlamak için de yararlı bir sistem haline getirir. Burada, tavuk iç kulağı için diseksiyon ve manipülasyon tekniklerini açıklıyoruz. Teknik, iç kulak gelişiminin moleküler mekanizmalarını incelemek için güçlü bir araç sunan genetik ve küçük molekül inhibisyon yöntemlerini gösterir. Bu yazıda, CRIPSR-Cas9 delesyonları kullanılarak baziler papillayı genetik olarak bozmak için ovo elektroporasyon tekniklerini, ardından baziler papillanın diseksiyonunu tartıştık. Ayrıca epitel ve saç hücrelerinin gelişimini gözlemlemek için BP organ kültürünü ve kültür matrislerinin optimal kullanımını da gösteriyoruz.

Tüm omurgalıların iç kulağı, otik plakod ^1,2 olarak bilinen basit bir epitelden türetilmiştir. Bu, işitme ve denge algısı ile ilişkili mekanosensoriyel bilgiyi dönüştürmek için gerekli tüm yapısal elemanlara ve hücre tiplerine yol açacaktır. İç kulağın siliyer sensörü olan saç hücreleri (HC'ler), destekleyici hücrelerle (SC'ler) çevrilidir. HC'ler, sekizinci kranial sinirin nöronları aracılığıyla işitsel arka beyne bilgi iletir. Bunlar ayrıca otik placode^3'ten de üretilir. Sesin birincil iletimi, işitsel HC'nin apikal yüzeyinde, mekanik olarak hassas bir saç demeti⁴ aracılığıyla elde edilir. Buna, stereocilia adı verilen modifiye aktin bazlı çıkıntılar aracılık eder ve bunlar derecelendirilmiş, merdiven deseni^5'te düzenlenir. Ek olarak, kinocilium adı verilen modifiye edilmiş bir birincil siliyum, saç demeti oluşumunu düzenler ve en uzun stereosilia ^6,7,8 sırasına bitişiktir. Stereosilia mimarisi, akustik enerjiden türetilen mekanik uyaranların elektriksel nöral sinyallere dönüştürülmesindeki bu rol için kritik öneme sahiptir⁹. Yaşlanma, enfeksiyon, otoakustik travma veya ototoksik şok yoluyla işitsel HC'nin hasar görmesi, memelilerde geri dönüşü olmayan kısmi veya tam işitme kaybına neden olabilir¹⁰.

Bu tür hasarları onarabilecek hücresel replasman tedavileri önerilmiştir^11,12. Bu araştırmanın yaklaşımı, memeli kıl hücresinin normal gelişimini anlamak ve iç kulakta bulunabilecek progenitör benzeri hücrelerde gelişim programlarının yeniden başlatılıp başlatılamayacağını sormak olmuştur¹³. İkinci bir yaklaşım, memelilerin dışına, kuşlar gibi işitsel saç hücrelerinin sağlam bir şekilde yenilenmesinin gerçekleştiği memeli olmayan omurgalılara bakmak olmuştur^14,15. Kuşlarda, saç hücresi rejenerasyonu ağırlıklı olarak destekleyici bir hücrenin progenitör benzeri bir duruma farklılaşması yoluyla gerçekleşir, bunu bir saç hücresi ve destekleyici hücre¹⁶ oluşturmak için asimetrik mitotik bölünme izler. Ek olarak, bir saç hücresi oluşturmak için bir destekleyici hücrenin doğrudan farklılaşması da gözlenmiştir¹⁷.

Kuş işitsel gelişim mekanizmaları memelilerinkiyle önemli benzerlikler gösterirken, farklılıklar vardır¹⁸. Civciv BP'deki HC ve SC farklılaşması, embriyonik gün (E) 7'den belirgindir ve zamanla daha belirgin hale gelir. E12 ile iyi desenli ve iyi polarize olmuş bir baziler papilla (BP) görselleştirilebilir ve E17 ile iyi gelişmiş saç hücreleri görülebilir¹⁹. Bu zaman noktaları, saç hücresi olgunlaşmasının yanı sıra farklılaşma, modelleme ve polarite mekanizmalarına pencereler sağlar. Bu tür mekanizmaların korunmuş mu yoksa farklı mı olduğunu anlamak, mekanosensoriyel saç hücrelerinin kökenlerinin derin homolojisine dair içgörüler sağladıkları için önemlidir.

Burada, iç kulak organının gelişimi boyunca proliferasyon, kader spesifikasyonu, farklılaşma, modelleme ve bakım gibi hücresel süreçleri incelemek için erken ve geç embriyonik aşamalarda gerçekleştirilen bir dizi tekniği gösteriyoruz. Bu, eksplant kültüründe iç kulak gelişimini anlamaya yönelik diğer protokolleri tamamlar^20,21,22. İlk olarak, ovo elektroporasyonunda kullanılan E3.5 otokist içindeki BP öncüllerine eksojen DNA veya RNA'nın sokulması tartışılmıştır. Genetik manipülasyonlar değerli bilgiler sağlayabilse de, bu şekilde üretilen fenotipler pleiotropik ve sonuç olarak kafa karıştırıcı olabilir. Bu, özellikle hücre iskeleti yeniden şekillenmesi gibi temel süreçlerin hücre bölünmesi, doku morfogenezi ve hücresel uzmanlaşmada çoklu rol oynadığı daha sonraki iç kulak gelişimi sırasında geçerlidir. Kültürlü eksplantlarda farmakolojik inhibisyon için protokoller sunuyoruz, bu da dozaj ve tedavi zamanlamasını ve süresini kontrol etmede avantajlar sunuyor ve gelişimsel mekanizmaların hassas mekansal zamansal manipülasyonunu sunuyor.

Küçük inhibitörlerin tedavi süresine bağlı olarak farklı organ kültürü yöntemleri kullanılabilir. Burada, epitelyal morfogenez ve hücresel uzmanlaşma hakkında fikir sahibi olmayı sağlayan iki organ kültürü yöntemi gösterilmektedir. Koklear kanalı kültürlemek için bir matris olarak kollajen kullanan 3D kültür için bir yöntem, gelişmekte olan BP'nin sağlam kültürlenmesini ve canlı görselleştirilmesini sağlar. Stereosilia oluşumunu anlamak için, epitel dokusunun aktin çıkıntılarının serbestçe büyümesini sağlayan sert bir matris üzerinde kültürlendiği bir membran kültürü yöntemi sunuyoruz. Her iki yöntem de canlı hücre görüntüleme, immünohistokimya, taramalı elektron mikroskobu (SEM), hücre kaydı vb. gibi aşağı akış işlemlerine izin verir. Bu teknikler, kuş işitsel epitelinin gelişimini, olgunlaşmasını ve yenilenmesini anlamak ve manipüle etmek için civcivin model bir sistem olarak etkili kullanımı için bir yol haritası sağlar.

Döllenmiş tavuk yumurtası ve yumurtadan çıkmamış embriyoların tedariki, kültürü ve kullanımını içeren protokoller, Bengaluru, Karnataka Ulusal Biyolojik Bilimler Merkezi Kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Civciv işitsel öncüllerinin ovo elektroporasyonunda

1. CRISPR/Cas9 gen nakavtı için sgRNA tasarımı ve klonlama
   1. Gen nakavtları oluşturmak için, DNA'ları genin ekzon bölgelerini, tercihen kodlama bölgesinin 5' ucuna daha yakın olacak şekilde bozmak için kılavuz haline getirin.
   2. Bir web aracı CRISPOR²³ kullanarak potansiyel kılavuz RNA'ları seçin. Tarayıcı verilerini Gallus gallus'a ve protospacer bitişik motif (PAM) dizisini 5'- NGG -3' olarak ayarlayın. Program, giriş dizisinden kılavuz RNA'ları belirler ve hedef içi ve hedef dışı aktiviteye göre farklı puanlar atar. Daha ileri çalışmalar için en iyi dört kılavuzu seçin.
   3. Kılavuz (g)RNA üretimi için şablona özgü oligoların tasarımı için, gRNA tasarım aracı çıktısından PAM dizisini (5′- NGG -3′) çıkarın. Bu, hedefleme için gerekli değildir, ancak Cas9 bölünme tanıma sırasını içerir. Her potansiyel gRNA için her iki ucunda BsmBI kısıtlama bölgesi olan iki HPLC saflaştırılmış tamamlayıcı oligo sentezleyin.
   4. Kılavuz dizisini, seçilen bir vektörün tracrRNA iskelesi ile çerçevede klonlayın (burada, pcU6_1sgRNA vektör kullanıldı²⁴).
   5. SgRNA oligonükleotidlerini DNaz / RNaz içermeyen suda 100 μM konsantrasyonda çözün. Aşağıdaki parametrelere sahip bir termosikler kullanarak iki duyu ve antisens oligo kılavuzunun tavlanmasını gerçekleştirin: 3 dakika boyunca 95 ° C, daha sonra 15 dakika boyunca 37 ° C ve ardından 4 ° C'ye düşürün.
   6. ^25'te açıklandığı gibi standart moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak, tavlanmış oligoların kısıtlama sindirimini ve pcU6_1sgRNA klonlama vektörünü bir gecede BsmBI enzimi ile ayarlayın. Jel saflaştırılmış lineer BsmBI sindirilmiş pcU6_1sgRNA vektörü ve sindirilmiş sgRNA oligoları ile ligasyonu kurun. DH5-alfa yetkin bir hücreye dönüştürün ve sekans elde edilen klonu onaylayın.
2. Yumurta taşıma ve pencereleme
   1. Taze serilmiş yumurtaları tedarik edin ve kontaminasyonu önlemek için% 70 etanol ile silerek temizleyin. 37-38 ° C'de, 3.5-4 gün boyunca% 45 nem ile inkübe edin.
   2. Kuluçkadan sonra, yumurtayı açmadan önce en az 5 dakika yan tarafına yerleştirin. Bu, embriyonun yumurta sarısının tepesine yeniden konumlandırılmasını sağlar. Yumurtanın üst kısmında ve kör ucunda küçük delikler açmak için forseps kullanın, böylece 21G iğnesi geçebilir.
   3. Pencereleme sırasında hasarı önlemek için, embriyoyu kabuktan uzaklaştırmak için albümini çıkarın. Bunu yapmak için, yumurtanın künt ucundaki bir delikten 2 mL albümini dikkatlice çekmek için 5 mL'lik bir şırınga ve 21G iğne kullanın. Kör uçtaki deliği kapatmak için şeffaf bant kullanın.
   4. Yumurta penceresini yapmak için, yumurta kabuğunun üstüne şeffaf bant yapıştırın. Yaylı yay makası kullanarak yaklaşık 2 cm uzunluğunda ve 1,5 cm genişliğinde bir pencere açın ve embriyoyu ortaya çıkarın. Embriyonun üzerindeki koryonik zarları açmak için forseps kullanın ve embriyoya erişime izin verin.
3. Mikroenjeksiyon plazmidleri
   1. Gen nakavt deneyi için iki çözüm hazırlayın: SpCas9 proteini ve kılavuz plazmid içeren knock-down karışımı - pcU6_1sgRNA ve T2K-eGFP'nin izleyici plazmid karışımı (bu, Tol2'nin transpozon bölgeleriyle çevrili GFP kasetini süren bir civciv ß-aktin promotörüdür) ve T2TP (Tol2'de klonlanan Tol2 transpozazı yapı^26,27). İzleyici, elektroporasyon verimliliğini izlemek için kullanılır.
   2. Birden fazla plazmidi elektroporize ederken, DNA'nın nihai konsantrasyonunun en az 4 μg / μL olduğundan emin olun. Üç yapıyı, kılavuz plazmidi - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP ve T2TP'yi, 1 μg SpCas9 proteini,% 30 sakkaroz ve% 0.1 Hızlı Yeşil boya ile 10 μL'lik son bir hacimde 1: 1 oranında karıştırın.
   3. Dikey pipet çektirme makinesi kullanarak standart cam kılcal damarlardan (uzunluk 3 inç, OD 1,0 mm) mikroenjeksiyon için iğneler çekin. Konik bir uçla yaklaşık 50 μm'lik bir uç çapı elde etmek için çektikten sonra kılcal ucu kırmak için ince forseps kullanın.
   4. Embriyoları E3.5'te sol taraflarında, baş sağa bakacak şekilde yerleştirin. Bu şekilde mikro enjeksiyon için sadece doğru otik vezikül erişilebilir. Knock-down karışımını otik veziküle mikro enjekte edin. Otik vezikülü doldurmak için yaklaşık 200 nL hacimli bir DNA çözeltisi karışımı enjekte edin.
   5. Bir T7 endonükleaz testi²⁸ kullanarak kılavuz verimliliğini belirleyin.
4. Elektroporasyon
   1. Elektrik direncini düşürmek ve embriyonun aşırı ısınmasını önlemek için elektroporasyondan önce embriyonun üzerine birkaç damla% 0.719 salin ekleyin.
   2. Albümin çıkarıldığında pozitif elektrotu yumurtanın künt tarafında yapılan delikten geçirin. Elektrotu yumurta sarısının altında olacak şekilde manevra yapın. Negatif elektrodu doldurulmuş otokistin üzerine yerleştirin.
   3. Plazmidleri embriyonun hücrelerine transfekte etmek için elektroporasyon kullanın. Bir kare darbe üreteci kullanın ve her biri 50 ms arayla 25 V ve 100 ms süreli beş darbe uygulayın. Bireysel bir elektroporasyon kurulumuna dayanarak koşulları ampirik olarak belirleyin.
   4. Elektroporasyondan sonra embriyoyu% 0.719 salin birkaç damla ekleyerek nemlendirin. Denatüre albümini elektrotların yüzeyinden temizlemek için, damıtılmış suyla iyice durulayın. Yumurtayı şeffaf bantla tekrar kapatın ve daha fazla inkübasyon için nemlendirilmiş inkübatöre 37-38 ° C'de geri dönün.
      NOT: Embriyolar elektroporasyondan sonra yumurtadan çıkana kadar kültürlenebilir, ancak canlılıkta dik bir azalma vardır.

2. Bariler papilla diseksiyonu

1. Ameliyat masasını, mikroskop aşamasını ve çevresini dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın. Isı veya alkol, minimal yaylı yaylı makas, mikro küret ve iki çift ince forseps içeren mikrodiseksiyon ekipmanını sterilize eder.
2. Aşağıdaki diseksiyon plakalarını hazırlayın: siyah silikon tabanlı bir cam Petri kabı, 90 mm plastik Petri kabı ve 60 mm Petri kabı. Diseksiyonlar için fosfat tamponlu salin (PBS) veya Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) soğutulur.
3. Yumurtayı yavaşça 90 mm'lik Petri kabına kırın. Civcivin dış kulağını tanımlayın. Makas kullanarak boynu alt çene seviyesinin hemen altında keserek embriyonun başını kesin. Kafayı buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
4. Embriyoyu, gaganın üst kısmı deneyciye bakacak şekilde yönlendirin ve gagayı #5 forsepslerden birini kullanarak tutun. İkinci #5 forseps'i kullanarak gözleri çıkarın. Rostralden kaudal'a giderek, kafatasını orta çizgisi boyunca kesin. Beyni dışarı çıkarın.
5. Daha fazla buz gibi PBS veya HBSS ekleyin ve pinna seviyesine yakın iki parlak yapıyı bulun. Bunlar koklear kanalın sonundaki lagena'nın otolitleridir ve orta hatta yakın bulunurlar.
6. İki iç kulağı izole etmek için kabaca iki lagena arasında ve bu bölgenin çok üstünde ve altında kesin. Eğik aydınlatma altında, iç kulağın ana hatlarını görselleştirin. Yabancı dokuyu ve antreyi çıkarın.
7. İzole kokleanı buz gibi soğuk PBS'li siyah silikon taban plakasına aktarın. #5 forseps kullanarak, koklear kanalı elde etmek için kıkırdaklı koklear kapsülü soyun. Koklear kanalın dalgalı tabakasını (tegmentum) bulun ve BP'yi açığa çıkarmak için #55 forseps kullanarak çıkarın. #55 forseps kullanarak, HC'leri ve SC'leri açığa çıkarmak için tektoryal membranı çıkarın.

3. Bazil papilla eksplantlarının kültürü

1. BP'nin membran kültürü
   1. Altı delikli bir doku kültürü plakası alın ve kuyucuk başına bir kültür membran eki yerleştirin.
   2. Disseke edilmiş baziler papillayı (eksplant) 1x HBSS tamponlu 200 μL'lik bir pipette toplayın ve bir membrana aktarın. Dokunun pipetin duvarına yapışmasını önlemek için, dokuyu aspire etmeden önce bir miktar ortam çekin.
   3. Eksplantı, baziler papilla yukarı bakacak şekilde yönlendirin, böylece saç ve destek hücreleri üst^29'dan görülebilir. Eksplant yerleştirildikten sonra, HBSS tamponunu kültür membranı yüzeyinden yavaşça aspire edin. Bu işlemde, eksplant kültür membranına bağlanacaktır.
   4. Altı delikli plakanın kuyularını doldurmak için membran eki ile kuyu duvarı arasına 1,2 mL Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle medium (DMEM) kültür ortamını ekleyin. Tek bir 30 mm'lik kültür membranı üzerinde altı adede kadar eksplant kültürlenebilir.
2. Koklear kanalın kollajen kültürü
   1. Bir doku kültürü başlığına 400 μL 3 mg / mL sıçan kuyruğu kollajeni, 50 μL 10x DMEM, 30 μL% 7.5 NaHCO₃ ve 5 μL HEPES ekleyerek kollajen karışımı hazırlayın.
   2. Dört delikli bir tabak alın ve her bir oyuğa üç damla kollajen karışımı ekleyin. Disseke koklear kanalı her kollajen damlasına aktarın. Kollajen matrisini iyileştirmek için plakayı 37 ° C'de 10 dakika, % 5 CO₂ olarak inkübe edin.
3. Kültürlerin küçük moleküllü tedavisi
   1. Kültür ortamını (DMEM, N-2 takviyesi, Penisilin) farmakolojik modülatör veya çözücüsü ile tek başına (kontrol olarak kullanılmak üzere) hazırlayın. Kültür ortamını, inhibitör ile desteklenmiş 700 μL ortam ile değiştirin. Eksplantları bir inkübatörde 37 ° C'de,% 5 CO_{2'de kültürleyin}.
   2. Kültür medyasının %50'sini her gün değiştirin. Uygun inkübasyon süresinden sonra, kültür ortamını çıkarın ve eksplantları aşağı akış analizleri için kullanın.

4. Görüntüleme ve analiz

1. İmmünofloresan analizi
   1. Kültür ortamını kuyulardan çıkarın ve eksplantları 1x HBSS ile iki kez yıkayın. Bir pipet kullanarak, kuyuya 1 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
   2. PFA'yı çıkarın ve eksplantları oda sıcaklığında 1x PBS ile üç kez yıkayın. Eksplantları kültür zarından toplamak için, küçük yaylı yay makası kullanarak doku parçasını içeren zarın etrafında küçük bir kesim yapın ve dokuyu zarla birlikte forseps kullanarak 48 delikli bir kültür plakasına aktarın.
      NOT: Fiksasyondan sonra dokular yüzüyorsa, 200 μL'lik bir pipetle aspire edin ve daha sonraki işlemler için 48 delikli plakalara aktarın. Dokunun zardan zorla ayrılmasını önleyin.
   3. Kollajen damlacık kültürü için, tüm kollajen damlasını bir silikon plakaya aktarmak için forseps kullanın. 200 μL 1x PBS ekleyin ve forseps yardımıyla kollajeni çıkarın ve ardından dokuyu 48 delikli bir kültür plakasına aktarın.
   4. Eksplantları, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0,3 Tween-20 (PBST) ile desteklenmiş 1 mL 1x PBS ile geçirgenleştirin. Eksplantları oda sıcaklığında 1 saat boyunca 200 μL bloke tampon (PBST'de %10 keçi serumu + %1 sığır serumu albümini) ile inkübe edin.
   5. Eksplantları gece boyunca 4 °C'de 200 μL birincil antikor çözeltisi (1:300, bloke edici tamponda) ile inkübe edin. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve eksplantları PBST ile 5 x 20 dakika iyice yıkayın.
   6. Eksplantları karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca 200 μL falloidin ve ikincil antikor çözeltisi (bloke edici tamponda) ile inkübe edin. Falloidin ve ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve eksplantları PBST ile 5 x 20 dakika iyice yıkayın.
      NOT: Her bir görüntüleme uygulaması için ikincil antikor konsantrasyonu ve yıkama uzunluğu belirlenmelidir. Süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak görüntüleme için, tipik olarak ikincil antikorun konsantrasyonunu 1:500'den 1:200'e çıkarırız ve falloidin konsantrasyonunu 1:400'den 1:200'e çıkarırız.
   7. Eksplantları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir DAPI çözeltisi (PBST'de 1:1000) ile inkübe edin. DAPI çözeltisini çıkarın ve eksplantları PBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.
   8. Eksplantları BP yukarı doğru bakacak şekilde (kapak kaymasına karşı) bir kızağa monte etmek için montaj ortamını kullanın. Konfokal görüntüleme için antifade montaj ortamı kullanın. Montaj ortamının karanlıkta oda sıcaklığında gece boyunca kurumasını bekleyin. Doğrudan görüntü alın veya görüntülemeye kadar slaytları 4 °C'de saklayın.
2. SEM analizi için OTOTO fiksasyonu
   1. Tüm çözümleri taze olarak hazırlayın ve yerel güvenlik kurallarına göre işleyin. Membran kültürlü eksplantları (adım 4.1.4'ten itibaren) 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7,3) %2,5 glutaraldehit içinde 3 mM CaCl₂ ile sabitleyin. Her 24 saatte bir fiksatif değişimi ile 24 ila 72 saat boyunca 4 ° C'de sabitleme gerçekleştirin.
   2. Fiksatifi çıkarın ve dokuyu oda sıcaklığında 3 x 5 dakika 0.1 M sodyum kakodilat ile yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca %1 OsO 4 (0,1 M sodyum kakodilat tamponu kullanılarak %4 OsO₄ stoğundan seyreltilmiş) ile ikincil düzeltme. Bunu ve sonraki adımları bir duman davlumbazındaki dehidrasyona kadar gerçekleştirin.
   3. Oda sıcaklığında 0,1 M sodyum kakodilat tamponu 3 x 5 dakika kullanarak durulayın. Daha sonra oda sıcaklığında çift damıtılmış veya ultra saf suda 3 x 5 dakika durulayın.
   4. Ultra saf suda% 0.5'lik bir tiyokarbohidrazit (TCH) çözeltisi hazırlayın. 75 °C'de 10 dakika karıştırın ve oda sıcaklığına soğuduğunda çözeltiyi filtreleyin.
      NOT: TCH son derece tehlikelidir. Kullanım yerel güvenlik komitesi tarafından onaylanmalı ve kullanım sırasında dikkatli olunmalıdır.
   5. Ultra saf suyu numuneden çıkarın ve damla damla% 0,5 TCH ekleyin. Çözelti kahverengiye dönerse,% 0.5 TCH çözeltisini dikkatlice eklemeden önce numuneyi ultra saf suyla durdurun ve durulayın. Çözelti temizlendikten sonra,% 0,5 TCH ile değiştirin. Oda sıcaklığında 20 dk^{30,31 kuluçkaya yatırın}.
   6. Numuneyi oda sıcaklığında 3 x 5 dakika ultra saf suyla durulayın. 4.2.2, 4.2.3 ve 4.2.5 adımlarını OsO₄ inkübasyonu ve ardından durulama ile biten iki kez daha tekrarlayın.
   7. Bir etanol serisindeki numuneleri %100 susuz etanol (EtOH) olarak dehidre edin. İlk önce 10 dakika boyunca% 25 ETOH'da, daha sonra% 10 dakika için% 50 ETOH, 10 dakika için% 75 EtOH, 10 dakika için% 95 ETOH'da, her biri% 100 ETOH'da her biri 10 dakika boyunca toplam 3x kuluçkaya yatmadan önce inkübe edin.
   8. Sıvı CO 2 kullanarak kritik noktada kurutma_{gerçekleştirin}. Numuneleri hemen çift taraflı karbon yapışkan bantlı bir SEM saplamasına monte edin. 5-10 nm kaplama sağlamak için püskürtme kaplamasına geçin. Hemen görüntüleme yapılmazsa, numuneleri vakum altında bir kurutucuda saklayın.

Elektroporasyon kurulumunda, elektrot konumlandırma transfeksiyon alanında rol oynayabilir. Pozitif elektrot yumurta sarısının altına, negatif ise embriyonun üstüne yerleştirilir (Şekil 1A). Bu, iç kulağın çoğunda ve hem vestibüler organlarda (Şekil 1B) hem de işitsel baziler papillada (Şekil 1C, D) daha yüksek GFP ekspresyonuna neden olur ve transfeksiyonu doğrular.

CRISPR-knockdown'ların fenotipini değerlendirirken, saç hücresi transkripsiyon faktörü Atonal homolog 1'e (Atoh1) kılavuz RNA'lar tasarladık. Atoh1'in fare mutantları saç hücreleri oluşturamaz³²; Atoh1 kılavuz RNA'larının elektroporasyonu ve E10'a kadar inkübasyonundan sonra, kontrol, boş plazmid kontrolü ile karşılaştırıldığında HC gelişiminin bozulduğunu görüyoruz (Şekil 2). Elektroporasyon mozaik olmasına rağmen (Şekil 2E,F), kontrol elektroporasyonlu hücreler saç hücrelerini oluşturabilir. Atoh1 gRNA elektroporated örneklerde, GFP pozitif hücreler hiçbir zaman HC gelişiminin belirteçlerini göstermez (Şekil 2B).

BP'nin organ kültürü dokuya erişilebilirliği sağlar. Kollajen gibi bir 3D matristeki kültürler, doku morfolojisinin 5 güne kadar mükemmel korunmasını sağlar. HC ve SC'nin organizasyonu bu kültür koşullarında sürdürülmektedir (Şekil 3).

Stereosili görüntüleme için membran üzerindeki organ kültürleri tercih edilir. Bu tür kültürler, saç demeti bütünlüğünü korurken 5 güne kadar kültürlenebilir. Bu, uç bağlantı proteini protokadherin 15^33'ün (Pcdh15) lokalizasyonu ile görülebilir (Şekil 4). Saç demetinin gelişimini sorgulamak için, daha yüksek çözünürlüklü görüntüleme gereklidir ve süper çözünürlüklü mikroskopi (Şekil 4D) veya taramalı elektron mikroskobu (Şekil 4E) kullanan bu tür yaklaşımlar daha eksiksiz bilgi sağlar.

Şekil 1. GFP ekspresyonu, E4'te ovo elektroporasyonundan sonra E10'da görülebilir. (A) E4'te civciv otik vezikülünde ovo mikroenjeksiyon ve elektroporasyonda gösteren şematik diyagram. Enjeksiyon pipeti, Tol2-eGFP (T2K-eGFP) ve Tol2-transpozazlar (T2TP) plazmidleri ve görselleştirme için hızlı yeşil boya ile doldurulur. (B) Bir stereomikroskop üzerinde 0.63x hava objektif lens kullanılarak E10'daki elektroporated iç kulağın görüntüsü. Sol iç kulak iç kontroldür. Kırmızı ok, sağ iç kulağın koklear kanalındaki GFP ekspresyonunu işaretler ve kırmızı yıldız işareti vestibüler organlarda GFP ekspresyonunu gösterir; ölçek çubuğu 2 cm'dir. (C) 0,5 NA'lık 20x hava hedefi kullanılarak sağ koklear kanalın kesitinin geniş alan floresan görüntüsü. GFP ekspresyonu çoğunlukla duyusal epitel ile sınırlıdır; ölçek çubuğu 10 μm'dir. (D) Alexa 647 florofor ile konjuge edilmiş falloidin ile boyanmış 0,5 NA'lık 10x hava hedefi kullanılarak görüntülenen tüm mount basilar papillanın konfokal görüntüsü. GFP ekspresyonu, BP'nin nöral tarafında proksimal uçtan distal uca kadar gözlenir; ölçek çubuğu 100 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. CRISPR / Cas9 aracılı Atoh1 gen nakavtı viain ovo elektroporasyonu saç hücrelerinin (HC'ler) kaybına neden olur. SpCas9 proteinli Atoh1 gen kılavuzu plazmid pcU6_1-Atoh1sgRNA ve izleyici plazmidleri Tol2-eGFP (T2K-eGFP) ve Tol2-transpozazlar (T2TP) mikroenjekte edilir ve E4'te civciv otik vezikülüne elektroporate edilir. Tüm görüntüler, lazer konfokal mikroskop kullanılarak 1.42 NA'lık 60x yağ daldırma hedefi ile yakalanan 10 μm ölçekli bir çubuğa sahip civciv E10 baziler papilla'dan alınmıştır. Tüm görüntüler için yakınlaştırılmış iç kısımlar sağlanır. (A,B,C,D) Sol panel, saç hücreleri (HC'ler) içeren BP, boş pcU6_1sgRNA ve T2K-eGFP ile elektropore ve SpCas9 proteini ile T2TP içerir. (E,F,G,H) Sağ taraftaki panel, HC kaybı olan BP, Atoh1 kılavuzu (pcU6_1-Atoh1sgRNA) ve T2K-eGFP ile elektroporated ve SpCas9 proteini ile T2TP içerir. (A,E) Baziller papilladaki saç hücrelerini (HC'ler) gösteren birleştirilmiş görüntü. Bunlar Myosin 7a (mavi) için immünoreaktiftir; Alexa 647 (kırmızı) ile konjuge edilmiş falloidin ile boyanmış F-aktin; Tol2-eGFP plazmidlerinden GFP ekspresyonu, bir anti-GFP antikoru (yeşil) kullanılarak tespit edilir. HC'lerin kaybı, boş pcU6_1sgRNA (D) ve pcU6_1-Atoh1sgRNA (H) ile yapılan tedaviler karşılaştırıldığında Myosin 7a immünoreaktivitesinden belirgindir. Her iki tedaviden elde edilen F-aktin görüntüleme, HC'nin (B, F) saç demetini vurgular. (C,G) T2K-eGFP ve T2TP, transfeksiyon yerini ve verimliliğini ölçmek için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. 3D-kollajen damlacık kültüründe koklear kanalın organ kültürü, duyusal epitelin organizasyonunu korur. E10'daki BP, 1 gün boyunca bir 3D kollajen damlacık kültüründe kültürlenir ve lazer konfokal mikroskop kullanılarak 1.42 NA'lık 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak görüntülenir. (A) E10'un tüm BP'sinin bir kollajen damlacığında 1 gün boyunca kültürlenmiş ve saç hücresi antijenine (HCA) karşı antikorlarla boyanmış ^{görüntüsü34}. Ölçek çubuğu 100 μm'dir. (B) BP'nin distal tarafından (C) falloidin (yeşil) ve (D) HCA (mavi) ile boyanmış duyusal epitelin korunmuş organizasyonunu gösteren birleştirilmiş görüntü; ölçek çubuğu 10 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. Elektron ve ışık mikroskobu altında baziler papillanın stereosiliyer demetleri. %0.1 dimetilsülfoksit (DMSO) ile muamele edilmiş BP, E10'da ektiler ve membran kültürü eklerinde 3 gün boyunca in vitro (DIV) olarak kültürlendi. (A) Explant, lazer taramalı konfokal mikroskop ile 1.42 NA'lık 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak görüntülenir. Birleştirilmiş görüntü, protocadherin 15 (Pcdh15) ve Alexa 488 (yeşil) ile konjuge edilmiş faloidin ile işaretlenmiş stereocilia'nın ifadesini göstermektedir. F-aktin ( B) ve Pcdh15 (C)' nin tek kanallı görüntüleri gösterilir. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. (D) Yeşil renkte Alexa 488 boyaması ile konjuge edilmiş falloidin ile boyanmış stereosilianın süper çözünürlüklü görüntüsü. Görüntü, lazer taramalı konfokal mikroskobun Airyscan modunda 1.42 NA'lık 63x yağ daldırma hedefi kullanılarak elde edildi. Ölçek çubuğu 5 μm'dir. ( E ) SEM görüntüsü 7 kV elektron yüksek gerilim (EHT) voltajı kullanılarak 16340x büyütmede alınmıştır. Kırmızı yıldız işareti kinocilia ve kırmızı kama stereocilia işaretleri. Parlaklık ve kontrast otomatik olarak ayarlandı ve görüntü FIJI kullanılarak keskinleştirildi. Ölçek çubuğu 1 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Civciv, bir laboratuvarın iç kulağı araştırmak için kullanabileceği model organizmalara uygun maliyetli ve kullanışlı bir ektir. Burada açıklanan yöntemler laboratuvarımızda rutin olarak kullanılmaktadır ve memeli iç kulağında devam eden araştırmaları tamamlamaktadır. Ovo'da elektroporasyon, civciv genomuna genetik manipülasyonlar sokmak için kullanılır. Elektroporasyon, belirli organellere veya hücre altı yapılara hedeflenen floresan proteinleri kodlayan yapıları tanıtmak için de kullanılabilir^35,36. Bu basit bir prosedür olsa da, ovo'daki embriyoların manipülasyonu yaşayabilirliği etkiler. Etkili elektroporasyon için, yumurtalar taze olarak tedarik edilmelidir (döşemeden hemen sonra). Mortalitede ve / veya anormal gelişimde bir artış, 5 günden fazla saklanan yumurtalarda sıklıkla gözlenir. Steril tekniğin kullanılması, yumurtanın nem kaybetmemesi için uygun şekilde kapatılmasını sağlamak ve embriyo üzerinde yapılan manipülasyonları en aza indirmek canlılığı arttırır.

Otokistin E3.5 ila E4 arasında hedeflenmesinin embriyonun karşılaştığı travmayı azalttığını ve dikkatlice yerleştirilmiş elektrotların kullanılmasının BP'nin duyusal öncüllerinin iyi hedeflenmesine izin verdiğini bulduk. Bununla birlikte, bu aşamada, akustik-vestibüler ganglionun öncüleri zaten iç kulaktan uzaklaşmıştır^37,38. Bu hücreleri hedeflemek için, otokist elektroporasyonu için daha erken zaman noktaları seçilmeli ve canlılıkta karşılık gelen azalma için konaklama yapılmalıdır. Bir başka dikkat notu, elektroporat embriyolarda mozaikçilik olasılığıdır. Tüm hücreler tüm plazmidi almaz ve bu nedenle mozaikçilik yorumu karıştırabilir. İzleyici plazmidlerinin kullanımı, verilerin yorumlanmasına yardımcı olur ve olası mozaik etkileri üzerinde bir miktar kontrol sağlar. Çoklu tekrarların, dikkatli analizlerin ve istatistiksel yöntemlerin kullanılması, mozaik fenotiplerin değerlendirilmesinde yardımcı olacaktır. Alternatif bir yaklaşım, genetiği değiştirilmiş bıldırcınları kullanmaktır³⁹. Şu anda bu sayılar sınırlıdır ve birçok laboratuvarda her zaman kullanılamamaktadır. Bununla birlikte, kullanılabilirlik artacaktır ve hücre altı hedefli floresan proteinlerini yapısal olarak eksprese eden bıldırcın embriyoları, görüntüleme deneyleri için çekici bir önermedir.

Bu yöntemde, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ²⁴ yoluyla CRISPR aracılı nakavtlar için elektroporat protein ve DNA kullanıyoruz. CRISPR / Cas9 aracılı füzyon yapılarının homolojiye yönelik onarım (HDR) yoluyla üretilmesi, bu özel paradigmada verimsiz kalmaktadır (Singh ve ark., yayınlanmamış gözlemler). Elektroporasyon yöntemi, diğer DNA yapıları (bunlar füzyon proteinlerini kodlayan yapılar olabilir) ile birlikte RNA ve protein için kullanılmak üzere uyarlanabilir. Gelişim (ve hücre bölünmesi) sırasında, vektör, eksojen DNA'nın bu hücrelerin genomuna (örneğin, Tol2 veya PiggyBac) yerleştirilmesine aracılık eden bölgeleri içermediği sürece, DNA tabanlı ekspresyon yapılarının seyreltileceği belirtilmelidir. Bu, yapının daha kararlı bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Elektroporasyondan sonra embriyolar genellikle saç hücresi farklılaşması ve gelişim çalışmaları için E10 aşamasına kadar ovoda kültürlenir. Ancak gerekirse, ovo kültüründe yumurtalar yumurtadan çıkana kadar devam edilebilir; Bununla birlikte, artan inkübasyon uzunlukları ile canlılıkta karşılık gelen bir düşüş vardır. Bunu atlatmak için, ovo'da elektroporasyon, BP diseksiyonları ve ardından uzun süreli ex ovo kültürü ile birleştirilebilir. Eksplantların bir 3D matris içinde kültürlenmesi, doku morfolojisinin iyi korunmasını sağlar. Bu yöntem, doku modelleme, polarite ve farklılaşmadaki değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. BP'nin bir membran üzerindeki kültürü, dokunun apikal tarafının görselleştirilmesine izin verir²⁷, özellikle stereosilin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi.

Bazı durumlarda, genetik modifikasyonun sınırlamaları, farklı küçük molekül bazlı tedaviler kullanılarak aşılabilir. Farmakolojik olarak aktif bileşikler, sinyal yolları veya hücre biyolojik süreçleri için inhibitörler veya agonistler olarak işlev görür. Uygulamaları, zamansal gereksinimin incelenmesinde özellikle yararlıdır. Bununla birlikte, kesin doğum şekillerinin ve optimal konsantrasyonların ampirik olarak belirlenmesi gerekir, çünkü bazı durumlarda hücre hatlarında yapılan standardizasyon, dokularda gerekli olan dozajla karşılaştırılamaz. Embriyo içindeki doğum sorunlu olabilir ve diğer organ sistemleri üzerindeki etkiyle birlikte ihtiyaç duyulan miktar, canlılığı önemli ölçüde tehlikeye atabilir. Hazır bir alternatif organ kültürü yöntemleridir^20,21,22. Bununla birlikte, kesin kültür yöntemi, amaçlanan çalışma türlerine ve analizlere bağlıdır. Kollajen kültürü BP'nin doku morfolojisini korurken, membran kültürü HC'nin apikal saç demetlerini incelemek için daha uygundur. Doku, taramalı elektron mikroskobu veya süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak apikal yüzeyi görselleştirmek için zarın üstüne yerleştirilebilir. Organ kültürü için diseksiyonlar iyi uygulama gerektirir. Bunlar arasında steril bir çalışma alanının korunması ve keskinleştirilmiş aletlerin kullanılması yer alır. Bu tür mikrodiseksiyon aletleri hassastır ve mikrocerrahi aletlerin bütünlüğünü korumada silikon kapların kullanımını önemli bulmaktayız.

Birlikte, teknikler iç kulak gelişiminin daha iyi anlaşılması için değerli yaklaşımları temsil eder. Civciv embriyolarının sunduğu karşılaştırmalı biyoloji ve rejenerasyondaki içgörüler, saç hücresi gelişimi ve işlevi hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

Yazarların ifşa etmek için rakip çıkarları yoktur.

NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB ve Royal National Institute for the Deaf'ın desteğini minnetle kabul ediyoruz. Merkezi Kanatlı Geliştirme Organizasyonu ve Eğitim Enstitüsü, Hesaraghatta, Bengaluru'ya teşekkür ederiz. NCBS'deki CIFF ve EM tesisine ve laboratuvar desteğine minnettarız. Tol2-eGFP ve T2TP yapıları için Yoshiko Takahashi ve Koichi Kawakami'ye, HCA ve G19 Pcdh15 antikoru için Guy Richardson'a teşekkür ederiz. Earlab üyelerine protokol hakkındaki sürekli destekleri ve değerli geri bildirimleri için minnettarız.