В методах Ovo и Ex Ovo для изучения развития внутреннего уха птиц

Цыпленок является экономически эффективным, доступным и широко доступным модельным организмом для различных исследований. Здесь подробно описан ряд протоколов, чтобы понять молекулярные механизмы, лежащие в основе развития и регенерации внутреннего уха птиц.

Внутреннее ухо воспринимает звук и поддерживает равновесие с помощью улитки и преддверия. Он делает это, используя специальный тип механосенсорных клеток, известный как волосковая клетка. Фундаментальные исследования во внутреннем ухе привели к глубокому пониманию того, как функционируют волосковые клетки, и как дисрегуляция может привести к потере слуха и головокружению. Для этого исследования мышь была выдающейся модельной системой. Однако мыши, как и все млекопитающие, утратили способность заменять волосковые клетки. Таким образом, при попытке понять клеточную терапию для восстановления функции внутреннего уха, дополнительные исследования на других видах позвоночных могут дать дальнейшее понимание. Слуховой эпителий птиц, базилярный сосочек (АД), представляет собой лист эпителия, состоящий из механосенсорных волосковых клеток (ГК), интеркалированных поддерживающими клетками (СК). Хотя анатомическая архитектура базилярного сосочки и улитки млекопитающих отличается, молекулярные механизмы развития внутреннего уха и слуха схожи. Это делает базилярный сосочек полезной системой не только для сравнительных исследований, но и для понимания регенерации. Здесь мы описываем методы рассечения и манипуляции для внутреннего уха курицы. Методика показывает генетические методы и методы ингибирования малых молекул, которые предлагают мощный инструмент для изучения молекулярных механизмов развития внутреннего уха. В этой статье мы обсуждаем методы электропорации ovo для генетического возмущения базилярного сосочка с использованием делеций CRIPSR-Cas9 с последующим рассечением базилярного сосочки. Мы также демонстрируем культуру органов АД и оптимальное использование культуральных матриц, чтобы наблюдать за развитием эпителия и волосковых клеток.

Внутреннее ухо всех позвоночных получено из простого эпителия, известного как отический плакод ^1,2. Это приведет к появлению всех структурных элементов и типов клеток, необходимых для передачи механосенсорной информации, связанной со слухом и восприятием равновесия. Волосковые клетки (ГК), реснитчатый датчик внутреннего уха, окружены поддерживающими клетками (СК). ГК передают информацию слуховому заднему мозгу через нейроны восьмого черепного нерва. Они также генерируются из otic placode³. Первичная трансдукция звука достигается на апикальной поверхности слухового HC, через механически чувствительный пучок волос⁴. Это опосредовано через модифицированные протрузии на основе актина, называемые стереоцилиями, которые расположены в градуированном лестничном шаблоне⁵. Кроме того, модифицированная первичная ресничка, называемая киноцилиумом, организует образование пучков волос и примыкает к самому высокому ряду стереоцилий ^6,7,8. Архитектура стереоцилий имеет решающее значение для этой роли в преобразовании механических стимулов, полученных из акустической энергии, в электрические нейронные сигналы⁹. Повреждение слухового HC в результате старения, инфекции, отоакустической травмы или ототоксического шока может привести к частичной или полной потере слуха, которая у млекопитающих необратима¹⁰.

Была предложена клеточная заместительная терапия, которая может восстановить такое повреждение^11,12. Подход этого исследования заключался в том, чтобы понять нормальное развитие волосковых клеток млекопитающих и спросить, могут ли программы развития быть восстановлены в клетках-предшественниках, которые могут существовать во внутреннем ухе¹³. Второй подход заключался в том, чтобы смотреть за пределы млекопитающих, на позвоночных, не являющихся млекопитающими, у которых происходит надежная регенерация слуховых волосковых клеток, таких как птицы^14,15. У птиц регенерация волосковых клеток происходит преимущественно путем дедифференцировки поддерживающей клетки до состояния, подобного предшественнику, с последующим асимметричным митотическим делением для генерации волосковой клетки и поддерживающей клетки¹⁶. Кроме того, также наблюдалась прямая дифференцировка поддерживающей клетки для генерации волосковой^{клетки 17}.

В то время как механизмы развития слуха птиц действительно показывают значительное сходство с механизмами развития млекопитающих, существуют различия¹⁸. Дифференциация HC и SC у цыплят АД проявляется с эмбрионального дня (E) 7, становясь более отчетливой с течением времени. По E12 можно визуализировать хорошо структурированный и хорошо поляризованный базилярный сосочек (АД), а по E17 хорошо развитые волосковые клетки можно увидеть¹⁹. Эти временные точки обеспечивают окна в механизмы дифференцировки, паттерна и полярности, а также созревания волосковых клеток. Понимание того, сохраняются ли такие механизмы или расходятся, важно, поскольку они дают представление о глубокой гомологии происхождения механосенсорных волосковых клеток.

Здесь мы демонстрируем множество методов, выполняемых на ранних и поздних эмбриональных стадиях для изучения клеточных процессов, таких как пролиферация, спецификация судьбы, дифференциация, паттерн и поддержание на протяжении всего развития органа внутреннего уха. Это дополняет другие протоколы по пониманию развития внутреннего уха в культуре экспланта 20,21,22. Сначала мы обсудим введение экзогенной ДНК или РНК в предшественники АД в отоцисте Е3,5 с использованием в электропорации ово. Хотя генетические манипуляции могут дать ценную информацию, фенотипы, генерируемые таким образом, могут быть плейотропными и, следовательно, смешивать. Это особенно верно во время более позднего развития внутреннего уха, где фундаментальные процессы, такие как ретоскелетное ремоделирование, играют множество ролей в делении клеток, морфогенезе тканей и клеточной специализации. Мы представляем протоколы фармакологического ингибирования в культивируемых эксплантатах, которые предлагают преимущества в контроле дозировки, сроков и продолжительности лечения, предлагая точные пространственно-временные манипуляции с механизмами развития.

Различные методы культивирования органов могут быть использованы в зависимости от продолжительности лечения небольшими ингибиторами. Здесь мы демонстрируем два метода культуры органов, которые позволяют понять эпителиальный морфогенез и клеточную специализацию. Метод 3D-культуры с использованием коллагена в качестве матрицы для культивирования кохлеарного протока обеспечивает надежное культивирование и живую визуализацию развивающегося АД. Для понимания формирования стереоцилий мы представляем метод мембранной культуры, такой, что эпителиальная ткань культивируется на жесткой матрице, позволяющей актиновым протрузиям свободно расти. Оба метода позволяют проводить последующую обработку, такую как визуализация живых клеток, иммуногистохимия, сканирующая электронная микроскопия (SEM), запись клеток и т. Д. Эти методы обеспечивают дорожную карту для эффективного использования цыпленка в качестве модельной системы для понимания и манипулирования развитием, созреванием и регенерацией слухового эпителия птицы.

Протоколы, касающиеся закупки, культивирования и использования оплодотворенных куриных яиц и невылупившихся эмбрионов, были одобрены Институциональным комитетом по этике животных Национального центра биологических наук, Бангалор, штат Карнатака.

1. В ово электропорации слуховых предшественников цыплят

1. Проектирование и клонирование sgRNA для нокаута гена CRISPR/Cas9
   1. Для создания нокаутов генов разработайте направляющие РНК, чтобы разрушить экзонные области гена, предпочтительно ближе к 5'-концу кодирующей области.
   2. Выберите потенциальные направляющие РНК с помощью веб-инструмента CRISPOR²³. Задайте для данных браузера значение Gallus gallus , а для последовательности смежных мотивов протоспейсера (PAM) — значение 5'-NGG -3'. Программа определяет направляющие РНК из входной последовательности и присваивает различные оценки на основе целевой и внецелевой активности. Выберите четыре лучших руководства для дальнейшего изучения.
   3. Для проектирования шаблонных олиго для производства направляющей (g)РНК удалите последовательность PAM (5′- NGG -3') из вывода инструмента проектирования гРНК. Он не нужен для таргетинга, но содержит последовательность распознавания расщепления Cas9. Синтезируют два очищенных ВЭЖХ комплементарных олигоса с участком рестрикции BsmBI на обоих концах для каждой потенциальной гРНК.
   4. Клонирование направляющей последовательности в кадре с тракрРНК-каркасом вектора выбора (здесь использован pcU6_1sgRNA вектор²⁴).
   5. Растворяют олигонуклеотиды sgRNA в концентрации 100 мкМ в воде, свободной от ДНКазы/РНКазы. Выполняют отжиг двух сенсорных и антисмысловых олиговодов с помощью термоциклера со следующими параметрами: 95 °C в течение 3 мин, затем 37 °C в течение 15 мин, а затем уменьшают до 4 °C.
   6. Используя стандартные методы молекулярной биологии, как описано в²⁵, настройте ограничительное пищеварение отожженных олиго и pcU6_1sgRNA вектор клонирования ферментом BsmBI в течение ночи. Установка лигирования с помощью очищенного гелем линейного BsmBI-переваренного pcU6_1sgRNA вектора и переваренного олиго сгРНК. Трансформация в DH5-альфа компетентная клетка и последовательность подтверждают полученный клон.
2. Обработка яиц и окон
   1. Добывайте свежеотложенные яйца и очищайте их, протирая их 70% этанолом, чтобы предотвратить загрязнение. Инкубировать при 37-38 °C, с влажностью 45% в течение 3,5-4 дней.
   2. После инкубации поместите яйцо на бок не менее чем на 5 минут перед открытием. Это позволяет эмбриону переместиться в верхнюю часть желтка. Используйте щипцы, чтобы сделать небольшие отверстия в верхней части и тупом конце яйца, чтобы игла 21G могла пройти.
   3. Чтобы предотвратить повреждение во время окна, удалите альбумин, чтобы опустить эмбрион от оболочки. Для этого используйте шприц 5 мл и иглу 21G, чтобы аккуратно вытянуть 2 мл альбумина из отверстия на тупом конце яйца. Используйте прозрачную ленту, чтобы закрыть отверстие на тупом конце.
   4. Чтобы сделать яичное окно, прикрепите прозрачную ленту к верхней части яичной скорлупы. Отрежьте окно, около 2 см в длину и 1,5 см в ширину, используя пружинные ножницы-луки и обнажите эмбрион. Используйте щипцы, чтобы открыть хорионические мембраны, покрывающие эмбрион, обеспечивая доступ к эмбриону.
3. Микроинъекция плазмид
   1. Для эксперимента по нокауту генов приготовьте два решения: нокдаун-смесь, содержащую белок SpCas9 и направляющую плазмиду - pcU6_1sgRNA, и плазмидную смесь индикатора T2K-eGFP (это промотор 1-актина цыпленка, приводящий в движение кассету GFP, окруженную транспозонными сайтами Tol2) вместе с T2TP (транспоза Tol2, клонированная в конструкции Tol2^26,27). Индикатор используется для отслеживания эффективности электропорации.
   2. При электропорации нескольких плазмид убедитесь, что конечная концентрация ДНК составляет не менее 4 мкг/мкл. Смешайте три конструкции, направляющую плазмиду - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP и T2TP, в соотношении 1:1:1 с 1 мкг белка SpCas9, 30% сахарозы и 0,1% красителя Fast Green в конечном объеме 10 мкл.
   3. Вытягивайте иглы для микроинъекции из стандартных стеклянных капилляров (длина 3 дюйма, OD 1,0 мм) с помощью вертикального съемника пипетки. Используйте тонкие щипцы, чтобы отломить кончик капилляра после вытягивания, чтобы получить диаметр наконечника примерно 50 мкм с коническим концом.
   4. Положите эмбрионы в E3.5 на левую сторону головой вправо. Таким образом, для микроинъекции доступен только правильный отический пузырь. Микро-ввести нокдаун смесь в отический пузырь. Введите около 200 нл объема смеси раствора ДНК, чтобы заполнить отический пузырь.
   5. Определение эффективности направляющей с помощью эндонуклеазного анализа Т7²⁸.
4. Электропорация
   1. Добавьте несколько капель 0,719% физиологического раствора поверх эмбриона перед электропорацией, чтобы снизить электрическое сопротивление и предотвратить перегрев эмбриона.
   2. Поместите положительный электрод через отверстие, сделанное на тупой стороне яйца, когда альбумин был удален. Маневрируйте электродом так, чтобы он оказался под желтком. Поместите отрицательный электрод над заполненной отоцистой.
   3. Используйте электропорацию для трансфекции плазмид в клетки эмбриона. Используйте квадратный генератор импульсов и примените пять импульсов длительностью 25 В и 100 мс каждый, с интервалом 50 мс. Определите условия эмпирически на основе индивидуальной электропорационной установки.
   4. Увлажните эмбрион после электропорации, добавив несколько капель 0,719% физиологического раствора. Чтобы очистить денатурированный альбумин от поверхности электродов, тщательно промойте его дистиллированной водой. Повторно запечатайте яйцо прозрачной лентой и верните в увлажненный инкубатор при 37-38 °C для дальнейшего инкубирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы можно культивировать до вылупления после электропорации, однако наблюдается резкое снижение жизнеспособности.

2. Рассечение базилярного сосочка

1. Используйте 70% этанола для дезинфекции хирургического стола, стадии микроскопа и прилегающей области. Тепло или спирт стерилизуют оборудование для микродиссекции, которое включает в себя ножницы с пружинным смычком, микрокюретту и две пары тонких щипцов.
2. Приготовьте следующие рассеченные пластины: стеклянную чашку Петри с черной силиконовой основой, пластиковую чашку Петри толщиной 90 мм и чашку Петри 60 мм. Охладите либо фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), либо сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) для рассечения.
3. Аккуратно разбейте яйцо в чашку Петри толщиной 90 мм. Определите наружное ухо цыпленка. Обезглавить эмбрион, разрезав шею чуть ниже уровня нижней челюсти ножницами. Переложите голову на 60-миллиметровую чашку Петри, наполненную ледяным PBS.
4. Сориентируйте эмбрион верхней частью клюва, обращенной к экспериментатору, и удерживайте клюв с помощью одного из щипцов No 5. Вычерпывайте глаза, используя вторые щипцы No5. Перейдя от ростраля к каудальскому, вырежьте череп вдоль его средней линии. Вычерпните мозг.
5. Добавьте больше ледяного PBS или HBSS и найдите две блестящие структуры, близко к уровню ушной раковины. Это отолиты лагены на конце кохлеарного протока и находятся близко к средней линии.
6. Разрезайте примерно между двумя лагенами, а также значительно выше и ниже этой области, чтобы изолировать два внутренних уха. При косом освещении визуализируйте контур внутреннего уха. Удалить посторонние ткани и преддверие.
7. Переложите изолированную улитку на черную силиконовую опорную пластину с ледяным холодом PBS. Используя щипцы No 5, очистите хрящевую кохлеарную капсулу, чтобы получить кохлеарный проток. Найдите волнистый слой (тегментум) кохлеарного протока и удалите его с помощью щипцов No 55 для обнажения АД. Используя щипцы No 55, удалите текториальную мембрану, чтобы обнажить ГК и СК.

3. Культура базилярных сосочков эксплантов

1. Мембранная культура АД
   1. Возьмите тарелку для посева тканей с шестью лунками и расположите одну вставку культуральной мембраны на каждую лунку.
   2. Соберите рассеченный базилярный сосочек (эксплант) в пипетку объемом 200 мкл с 1 буфером HBSS и перенесите его на мембрану. Чтобы ткань не прилипла к стенке пипетки, вытяните некоторые среды перед аспирацией ткани.
   3. Ориентируйте эксплант так, чтобы базилярный сосочек был обращен вверх, чтобы волос и опорные клетки были видны с вершины²⁹. Как только эксплант позиционируется, аспирируйте буфер HBSS медленно с поверхности культуральной мембраны. В этом процессе эксплант будет прикрепляться к культуральной мембране.
   4. Добавьте 1,2 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle medium (DMEM) между мембранной вставкой и стенкой скважины, чтобы заполнить колодцы шестилуночной пластины. До шести эксплантов могут культивироваться на одной 30-миллиметровой культуральной мембране.
2. Коллагеновая культура кохлеарного протока
   1. Приготовьте коллагеновую смесь, добавив 400 мкл коллагена крысиного хвоста 3 мг/мл, 50 мкл 10x DMEM, 30 мкл 7,5% NaHCO₃ и 5 мкл HEPES в тканевую культуральную вытяжку.
   2. Возьмите тарелку из четырех лунок и добавьте в каждую лунку по три капли коллагеновой смеси. Переносите рассеченный кохлеарный проток на каждую каплю коллагена. Инкубируйте пластину в течение 10 мин при 37 °C, 5% CO₂ для отверждения коллагеновой матрицы.
3. Низкомолекулярная обработка культур
   1. Готовят питательные среды (DMEM, добавка N-2, пенициллин) либо с фармакологическим модулятором, либо только с его растворителем (для использования в качестве контроля). Заменить культуральную среду 700 мкл среды, дополненной ингибитором. Культивируйте экспланты в инкубаторе при 37 °C, 5% CO₂.
   2. Заменяйте 50% питательных сред каждый день. После соответствующего времени инкубации удалите питательные среды и используйте экспланты для последующих анализов.

4. Визуализация и анализ

1. Иммунофлуоресцентный анализ
   1. Удалите питательные среды из лунок и дважды промывайте экспланты 1x HBSS. Используя пипетку, добавьте в лунку 1 мл 4% параформальдегида (PFA) и инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре.
   2. Удалите PFA и промыть экспланты три раза с 1x PBS при комнатной температуре. Чтобы собрать экспланты с культуральной мембраны, сделайте небольшой разрез вокруг мембраны, содержащей кусок ткани, с помощью небольших пружинных ножниц и перенесите ткань вместе с мембраной на 48-луночную культуральную пластину с помощью щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткани плавают после фиксации, то аспирируют пипеткой 200 мкл и переносят ее на 48-луночные пластины для дальнейшей обработки. Избегайте насильственного отслоения ткани от мембраны.
   3. Для культивирования капли коллагена используйте щипцы для переноса всей капли коллагена на кремниевую пластину. Добавьте 200 мкл 1x PBS и удалите коллаген с помощью щипцов, а затем перенесите ткань на 48-луночную культуральную пластину.
   4. Пермеабилизируйте экспланты 1 мл 1x PBS с добавлением 0,3% Tween-20 (PBST) в течение 30 мин при комнатной температуре. Инкубировать экспланты с 200 мкл блокирующего буфера (10% козьей сыворотки + 1% бычьего сывороточного альбумина в ПБСТ) в течение 1 ч при комнатной температуре.
   5. Инкубировать экспланты с 200 мкл раствора первичного антитела (1:300, в блокирующем буфере) в течение ночи при 4 °C. Удалите первичный раствор антител и тщательно промыть экспланты 5 х 20 мин С PBST.
   6. Инкубируют экспланты с 200 мкл фаллоидина и раствором вторичных антител (в блокирующем буфере) в течение 1 ч при комнатной температуре в темное время суток. Удалите фаллоидин и раствор вторичных антител и тщательно промыть экспланты 5 х 20 мин ПБСТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация вторичных антител и длина промывки должны быть определены для каждого отдельного применения визуализации. Для визуализации с использованием микроскопии сверхвысокого разрешения мы обычно увеличиваем концентрацию вторичного антитела с 1:500 до 1:200 и увеличиваем концентрацию фаллоидина с 1:400 до 1:200.
   7. Инкубировать экспланты раствором DAPI (1:1000 в ПБСТ) в течение 15 мин при комнатной температуре. Удалите раствор DAPI и промыть экспланты 3 x 5 мин PBST.
   8. Используйте монтажный носитель для монтажа эксплантов на слайде с BP, обращенным в направлении вверх (против крышки). Для конфокальной визуализации используйте антизатухающие монтажные носители. Дайте монтажной среде высохнуть в течение ночи при комнатной температуре в темноте. Либо изображение непосредственно, либо храните слайды при температуре 4 °C до тех пор, пока не появится изображение.
2. Фиксация OTOTO для анализа SEM
   1. Приготовьте все растворы свежими и обработайте их в соответствии с местными правилами безопасности. Зафиксируйте мембранно-культивируемые экспланты (со стадии 4.1.4) в 2,5% глутаральдегида в буфере какодилата натрия 0,1 М (рН 7,3) с 3 мМ_CaCl2. Производят фиксацию при 4 °C в течение 24 - 72 ч со сменой фиксатора каждые 24 ч.
   2. Снять фиксатор и промыть ткань 0,1 М какодилата натрия 3 х 5 мин при комнатной температуре. Вторичная фиксация 1% OsO₄ (разбавленная из 4% OsO₄ запаса с использованием буфера 0,1 М какодилата натрия) в течение 1 ч при комнатной температуре. Выполняйте это и последующие шаги до обезвоживания в вытяжке.
   3. Промыть с использованием 0,1 М буфера какодилата натрия 3 х 5 мин при комнатной температуре. Затем промыть в двойной дистиллированной или сверхчистой воде 3 х 5 мин при комнатной температуре.
   4. Готовят 0,5% раствор тиокарбогидразида (ТКП) в сверхчистой воде. Перемешайте при 75 °C в течение 10 мин и процедите раствор, когда он остынет до комнатной температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ТКП чрезвычайно опасна. Использование должно быть одобрено местным комитетом по безопасности, и при обращении необходимо соблюдать осторожность.
   5. Удалите сверхчистую воду из образца и добавьте 0,5% TCH капля за каплей. Если раствор подрумянится, остановите и промойте образец сверхчистой водой, прежде чем осторожно добавить 0,5% раствор ТКП. Как только раствор станет прозрачным, замените его 0,5% TCH. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 мин^30,31.
   6. Промойте образец сверхчистой водой 3 х 5 мин при комнатной температуре. Повторите шаги 4.2.2, 4.2.3 и 4.2.5 еще два раза, заканчивая инкубацией OsO₄ с последующим промывкой.
   7. Обезвоживание образцов в серии этанола до 100% безводного этанола (EtOH). Инкубировать сначала в 25% ETOH в течение 10 мин, затем 50% ETOH в течение 10 мин, 75% EtOH в течение 10 мин, 95% ETOH в течение 10 мин, перед инкубацией в общей сложности 3x в течение 10 мин каждый в 100% ETOH.
   8. Выполните сушку в критической точке с использованием жидкого CO₂. Немедленно установите образцы на заглушку SEM с двусторонней углеродной клейкой лентой. Приступайте к напылению слоя, чтобы обеспечить 5-10 нм покрытия. Если это не сразу, храните образцы в осушителе под вакуумом.

В электропорационной установке позиционирование электрода может играть роль в области трансфекции. Положительный электрод помещают под желток, а отрицательный над эмбрионом (рисунок 1А). Это приводит к более высокой экспрессии GFP в большей части внутреннего уха и как вестибулярных органов (рисунок 1B), так и слухового базилярного сосочка (рисунок 1C, D), подтверждая трансфекцию.

При оценке фенотипа CRISPR-нокдаунов мы разработали направляющие РНК к фактору транскрипции волосковых клеток Атональный гомолог 1 (Atoh1). Мышиные мутанты Atoh1 не способны образовывать волосковые клетки³²; после электропорации направляющих РНК Atoh1 и инкубации до E10 мы обнаруживаем, что развитие HC нарушается по сравнению с контролем, контролем пустой плазмиды (рисунок 2). Хотя электропорация является мозаичной (рисунок 2E, F), управляющие электропорированные клетки способны образовывать волосковые клетки. В электропорированных образцах гРНК Atoh1 GFP-положительные клетки никогда не показывают маркеров развития HC (рисунок 2B).

Органная культура АД обеспечивает доступность к тканям. Культуры в 3D-матрице, такие как коллаген, обеспечивают отличное сохранение морфологии тканей на срок до 5 дней. Организация HC и SC поддерживается в этих условиях культуры (рисунок 3).

Культуры органов на мембране предпочтительнее для визуализации стереоцилий. Такие культуры можно культивировать до 5 дней, сохраняя при этом целостность пучка волос. Это видно по локализации белка с наконечником звена, протокадгерина 15³³ (Pcdh15) (рисунок 4). Для опроса о развитии пучка волос необходима визуализация с более высоким разрешением, и такие подходы, использующие либо микроскопию сверхвысокого разрешения (рисунок 4D), либо сканирующую электронную микроскопию (рисунок 4E), дают более полную информацию.

Рисунок 1. Экспрессия GFP видна при E10 после электропорации ovo при E4. (A) Принципиальная диаграмма, иллюстрирующая микроинъекцию ovo и электропорацию в pec otic vesicle цыпленка в E4. Инъекционная пипетка заполнена плазмидами Tol2-eGFP (T2K-eGFP) и Tol2-транспозазами (T2TP) вместе с быстрым зеленым красителем для визуализации. (B) Изображение электропорированного внутреннего уха на E10 с помощью объектива 0,63x на стереомикроскопе. Левое внутреннее ухо является внутренним органом управления. Красная стрелка отмечает выражение GFP в кохлеарном протоке правого внутреннего уха, а красная звездочка показывает экспрессию GFP в вестибулярных органах; Шкала бара составляет 2 см. (C) Широкоугольное флуоресцентное изображение поперечного сечения правого кохлеарного канала с использованием 20-кратного воздушного объектива 0,5 NA. Экспрессия GFP в основном ограничивается сенсорным эпителием; Шкала шкалы составляет 10 мкм. (D) Конфокальное изображение всего базилярного сосочка маунта, полученное с использованием 10x воздушного объектива 0,5 NA, окрашенного фаллоидином, сопряженным с флуорофором Alexa 647. Экспрессия GFP наблюдается от проксимального до дистального конца на нервной стороне АД; шкала 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Нокаут гена Atoh1, опосредованный CRISPR/Cas9, через электропорацию ово приводит к потере волосковых клеток (ГК). Направляющая плазмида гена Atoh1 pcU6_1-Atoh1sgRNA и индикаторные плазмиды Tol2-eGFP (T2K-eGFP) и Tol2-транспозазы (T2TP) с белком SpCas9 микроинъецируются и электропорируются в цыпленке отиков в E4. Все изображения взяты из базилярного сосочки цыпленка E10 с 10-мкм шкалой, снятой с помощью 60-кратного масляного погружного объектива 1,42 NA с помощью лазерного конфокального микроскопа. Увеличенные вставки предоставляются для всех изображений. (A,B,C,D) Левая панель содержит BP с волосковыми клетками (HCs), электропорированными пустыми pcU6_1sgRNA и T2K-eGFP, и T2TP с белком SpCas9. (E,F,G,H) Правая боковая панель содержит АД с потерей ГК, электропорированное направляющим Atoh1 (pcU6_1-Atoh1sgRNA) и T2K-eGFP, и T2TP с белком SpCas9. (А,Е) Объединенное изображение, показывающее волосковые клетки (ГК) в базилярном сосочке. Они являются иммунореактивными для Миозина 7а (синий); F-актин окрашен фаллоидином, сопряженным с Alexa 647 (красный); Экспрессия GFP от плазмид Tol2-eGFP обнаруживается с использованием антитела против GFP (зеленый). Потеря ГК очевидна из иммунореактивности миозина 7а при сравнении лечения с пустыми pcU6_1sgRNA (D) и pcU6_1-Atoh1sgRNA (H). Визуализация F-актина от обоих методов лечения подчеркивает пучок волос HC (B, F). (С,Г) T2K-eGFP и T2TP используются для измерения местоположения и эффективности трансфекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Органная культура кохлеарного протока в культуре капель 3D-коллагена поддерживает организацию сенсорного эпителия. АД в E10 культивируют в 3D-культуре капель коллагена в течение 1 дня и визуализируют с использованием 60-кратного масляного иммерсионного объектива 1,42 NA с использованием лазерного конфокального микроскопа. (A) Изображение целого АД Е10, культивируемого в течение 1 дня в капле коллагена и окрашенного антителами против антигена волосковых клеток (HCA)³⁴. Шкала бара составляет 100 мкм. (B) Объединенное изображение, показывающее сохранившуюся организацию сенсорного эпителия с дистальной стороны BP, окрашенного (C) фаллоидином (зеленый) и (D) HCA (синий); шкала 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4. Стереоцилиарные пучки базилярного сосочка под электронным и световым микроскопом. 0,1% АД, обработанные диметилсульфоксидом (ДМСО), эксплантировали в E10 и культивировали в течение 3 дней in vitro (DIV) на мембранных культуральных вставках. (A) Эксплант визуализируется с помощью 60-кратного масляного погружного объектива 1,42 NA с лазерным сканирующим конфокальным микроскопом. На объединенном изображении показана экспрессия протокадгерина 15 (Pcdh15) и стереоцилий, отмеченных фаллоидином, сопряженным с Alexa 488 (зеленый). Показаны одноканальные изображения F-актина (B) и Pcdh15 (C ). Шкала составляет 10 мкм. (D) Изображение стереоцилий со сверхвысоким разрешением, окрашенных фаллоидином, сопряженным с окрашиванием Alexa 488 в зеленый цвет. Изображение получено с помощью 63-кратного масляного погружного объектива 1,42 NA в режиме Airyscan лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Шкала бара составляет 5 мкм. (E) SEM-изображение было получено с увеличением 16340x с использованием напряжения электронного высокого напряжения (EHT) 7 кВ. Красная звездочка отмечает киноцилию, а красная клиновидная метка стереоцилия. Яркость и контрастность были настроены на автоматическое, а изображение было заточено с помощью FIJI. Шкала составляет 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Цыпленок является экономически эффективным и удобным дополнением к модельным организмам, которые лаборатория может использовать для исследования внутреннего уха. Методы, описанные здесь, обычно используются в нашей лаборатории и дополняют текущие исследования во внутреннем ухе млекопитающих. В ово электропорация используется для введения генетических манипуляций в геном цыпленка. Электропорация также может быть использована для введения конструкций, которые кодируют флуоресцентные белки, нацеленные на определенные органеллы или субклеточные структуры^35,36. Хотя это простая процедура, манипуляции с эмбрионами в ovo влияют на жизнеспособность. Для эффективной электропорации яйца следует закупать свежими (вскоре после откладывания). Рост смертности и / или аномальное развитие часто наблюдается в яйцах, которые хранились более 5 дней. Использование стерильной техники, обеспечение правильной герметизации яйцеклетки, чтобы оно не теряло влагу, и минимизация манипуляций, выполняемых на эмбрионе, повышают жизнеспособность.

Мы обнаружили, что нацеливание на отоцисту от E3.5 до E4 уменьшает травму, с которой сталкивается эмбрион, а использование тщательно расположенных электродов позволяет хорошо нацеливаться на сенсорные предшественники АД. Однако к этому этапу предшественники акустико-вестибулярного^{ганглия} уже мигрировали от внутреннего уха ^37,38. Чтобы нацелиться на эти клетки, необходимо выбрать более ранние временные точки для электропорации отоцистов и сделать аккомодации для соответствующего снижения жизнеспособности. Еще одним предостережением является возможность мозаицизма у электропорированных эмбрионов. Не все клетки занимают всю плазмиду, и, таким образом, мозаицизм может спутать интерпретацию. Использование индикаторных плазмид помогает в интерпретации данных и обеспечивает некоторый контроль над возможными мозаичными эффектами. Использование множественных повторов, тщательный анализ и статистические методы помогут в оценке мозаичных фенотипов. Альтернативным подходом является использование генетически модифицированных перепелов³⁹. В настоящее время эти цифры ограничены и не всегда доступны для многих лабораторий. Тем не менее, доступность будет увеличиваться, и эмбрионы перепелов, которые конститутивно экспрессируют субклеточные флуоресцентные белки, являются привлекательным предложением для экспериментов по визуализации.

В этом методе мы электропорируем белок и ДНК для опосредованных CRISPR нокдаунов через негомологичное соединение конца (NHEJ)²⁴. Опосредованная CRISPR/Cas9 генерация термоядерных конструкций с помощью гомологического репарации (HDR) остается неэффективной в этой конкретной парадигме (Singh et al., неопубликованные наблюдения). Метод электропорации может быть адаптирован для использования с другими типами конструкций ДНК (это могут быть конструкции, кодирующие слияния белков), а также для РНК и белка. Следует отметить, что во время развития (и деления клеток) конструкции экспрессии на основе ДНК будут разбавляться, если вектор не включает участки, которые опосредуют вставку экзогенной ДНК в геном этих клеток (например, Tol2 или PiggyBac). Это позволяет более стабильно выражать конструкцию.

После электропорации эмбрионы обычно культивируют в ово до стадии E10 для исследований дифференцировки и развития волосковых клеток. Но при необходимости в ово культуру можно продолжать до тех пор, пока яйца не вылупятся; однако с увеличением длины инкубации происходит соответствующее падение жизнеспособности. Чтобы обойти это, в ово электропорацию можно сочетать с рассечениями АД с последующим длительным ex ovo культурой. Культивирование эксплантов в 3D-матрице позволяет хорошо сохранить морфологию ткани. Этот метод может быть использован для изучения изменений в структуре тканей, полярности и дифференцировке. Культивирование АД на мембране позволяет визуализировать апикальную сторону ткани²⁷, в частности изображение стереоцилий с высоким разрешением.

В некоторых случаях ограничения генетической модификации могут быть преодолены с помощью различных методов лечения на основе малых молекул. Фармакологически активные соединения действуют как ингибиторы или агонисты для сигнальных путей или клеточных биологических процессов. Их применение особенно полезно при анализе временных требований. Однако точные способы доставки и оптимальные концентрации должны быть определены эмпирически, так как в некоторых случаях стандартизация, выполняемая в клеточных линиях, не сопоставима с дозировкой, требуемой в тканях. Роды внутри эмбриона могут быть проблематичными, и необходимое количество в сочетании с воздействием на другие системы органов может значительно поставить под угрозу жизнеспособность. Готовой альтернативой являются методы культивирования органов 20,21,22. Тем не менее, точный метод культивирования зависит от типов исследований и анализов, которые предназначены. В то время как коллагеновая культура сохраняет тканевую морфологию АД, мембранная культура лучше подходит для изучения апикальных волосяных пучков HC. Ткань может быть просто помещена поверх мембраны для визуализации апикальной поверхности с помощью сканирующей электронной микроскопии или микроскопии сверхвысокого разрешения. Вскрытия для культуры органов требуют хорошей практики. К ним относятся поддержание стерильного рабочего пространства и использование заточенных инструментов. Такие инструменты для микродиссекции чувствительны, и мы считаем использование силиконовой посуды важным для сохранения целостности микрохирургических инструментов.

Вместе эти методы представляют собой ценные подходы к дальнейшему пониманию развития внутреннего уха. Понимание сравнительной биологии и регенерации, которое предлагают эмбрионы цыплят, может дать значительное представление о развитии и функционировании волосковых клеток.

У авторов нет конкурирующих интересов для раскрытия.

Мы с благодарностью признаем поддержку со стороны NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB и Королевского национального института для глухих. Мы хотели бы поблагодарить Центральную организацию развития птицеводства и Учебный институт, Хесарагатта, Бангалор. Мы благодарны CIFF и EM и лабораторной поддержке в NCBS. Мы благодарим Йошико Такахаси и Коити Каваками за конструкции Tol2-eGFP и T2TP, а также Гая Ричардсона за антитела HCA и G19 Pcdh15. Мы благодарны членам Earlab за их постоянную поддержку и ценные отзывы о протоколе.