בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

האוזן הפנימית קולטת צלילים ושומרת על איזון באמצעות השבלול והפרוזדור. הוא עושה זאת על ידי שימוש בסוג תא מכניו-חושי ייעודי המכונה תא השערה. מחקר בסיסי באוזן הפנימית הוביל להבנה עמוקה של האופן שבו תאי השערה מתפקדים, וכיצד חוסר ויסות יכול להוביל לליקוי שמיעה ולסחרחורת. לצורך מחקר זה, העכבר היה מערכת המודל הבולטת ביותר. עם זאת, עכברים, כמו כל היונקים, איבדו את היכולת להחליף תאי שערה. לכן, כאשר מנסים להבין טיפולים תאיים לשיקום תפקוד האוזן הפנימית, מחקרים משלימים במינים אחרים של בעלי חוליות יכולים לספק תובנות נוספות. האפיתל השמיעתי של ציפורים, הפפילה הבזילרית (BP), הוא יריעה של אפיתל המורכבת מתאי שערה מכנו-חושיים (HCs) המשולבים על ידי תאים תומכים (SCs). למרות שהארכיטקטורה האנטומית של הפפילה הבזילרית והשבלול של היונקים שונה, המנגנונים המולקולריים של התפתחות האוזן הפנימית והשמיעה דומים. זה הופך את הפפילה הבזילרית למערכת שימושית לא רק למחקרים השוואתיים אלא גם להבנת התחדשות. כאן נתאר טכניקות דיסקציה ומניפולציה לאוזן הפנימית של התרנגולת. הטכניקה מציגה שיטות עיכוב גנטיות ומולקולות קטנות, המציעות כלי רב עוצמה לחקר המנגנונים המולקולריים של התפתחות האוזן הפנימית. במאמר זה, אנו דנים בטכניקות אלקטרופורציה של ovo כדי להפריע גנטית לפפילה הבזילרית באמצעות מחיקות CRIPSR-Cas9, ולאחר מכן דיסקציה של הפפילה הבזילית. אנו גם מדגימים את תרבית איברי BP ושימוש אופטימלי במטריצות תרבית, כדי לבחון את התפתחות האפיתל ותאי השערה.

האוזן הפנימית של כל בעלי החוליות נגזרת מאפיתל פשוט המכונה placode^{otic 1,2}. זה יוליד את כל האלמנטים המבניים ואת סוגי התאים הדרושים כדי להמיר את המידע mechanosensory הקשורים שמיעה ותפיסת שיווי משקל. תאי השערה (HCs), החיישן הציליאטי של האוזן הפנימית, מוקפים בתאים תומכים (SCs). HCs מעבירים מידע למוח האחורי השמיעתי דרך הנוירונים של עצב הגולגולת השמיני. אלה נוצרים גם מן placode otic³. ההתמרה הראשונית של הצליל מושגת על פני השטח האפיקליים של HC השמיעתי, באמצעות צרור שיער רגיש מכנית⁴. זה מתווך באמצעות בליטות מבוססות אקטין מותאמות הנקראות סטריאוציליה, המסודרות בתבנית מדרגות מדורגת⁵. בנוסף, cilium ראשוני שונה, הנקרא kinocilium, מארגן היווצרות צרור שיער והוא צמוד לשורה הגבוהה ביותר של סטריאוציליה ^6,7,8. הארכיטקטורה של סטריאוציליה היא קריטית לתפקיד זה בהמרת גירויים מכניים הנגזרים מאנרגיה אקוסטית לאותות עצביים חשמליים⁹. נזק ל-HC השמיעתי כתוצאה מהזדקנות, זיהום, טראומה אוטואקוסטית או הלם אוטוטוקסי עלול לגרום לליקוי שמיעה חלקי או מלא, שביונקים הוא בלתי הפיך¹⁰.

הוצעו טיפולים תחליפיים תאיים שעשויים לתקן נזק כזה^11,12. הגישה של מחקר זה הייתה להבין את ההתפתחות התקינה של תאי השערה של יונקים ולשאול אם ניתן להתחיל מחדש תוכניות התפתחות בתאים דמויי אב שעשויים להתקיים בתוך האוזן הפנימית¹³. גישה שנייה הייתה להסתכל מחוץ ליונקים, אל בעלי חוליות שאינם יונקים שבהם מתרחשת התחדשות חזקה של תאי שערה שמיעתיים, כגון ציפורים^14,15. אצל ציפורים, התחדשות תאי השערה מתרחשת בעיקר באמצעות דה-דיפרנציאציה של תא תומך למצב דמוי אב, ולאחר מכן חלוקה מיטוטית אסימטרית ליצירת תא שערה ותא^{תומך 16}. בנוסף, הבחנה ישירה של תא תומך ליצירת תא שערה נצפתה גם¹⁷.

בעוד שהמנגנונים של התפתחות שמיעת העופות מראים דמיון משמעותי לזה של יונקים, ישנם הבדלים¹⁸. התמיינות HC ו-SC באפרוח BP ניכרת מיום עוברי (E) 7, והופכת מובחנת יותר עם הזמן. על ידי E12, ניתן לדמיין פפילה בזילרית (BP) מעוצבת ומקוטבת היטב, ועל ידי E17 ניתן לראות תאי שיער מפותחים היטב¹⁹. נקודות זמן אלה מספקות חלונות למנגנונים של התמיינות, דפוס וקוטביות, כמו גם התבגרות תאי שערה. ההבנה אם מנגנונים כאלה נשמרים או מסתעפים היא חשובה, שכן הם מספקים תובנות על ההומולוגיה העמוקה של מקורות תאי השערה המכנו-חושיים.

כאן אנו מדגימים מגוון טכניקות המבוצעות בשלבים עובריים מוקדמים ומאוחרים כדי לחקור תהליכים תאיים כגון התפשטות, אפיון גורל, התמיינות בתבניות ותחזוקה לאורך התפתחות איבר האוזן הפנימית. זה משלים פרוטוקולים אחרים על הבנת התפתחות האוזן הפנימית בתרבית explant^20,21,22. תחילה נדון בהחדרת דנ"א אקסוגני או רנ"א למבשרי BP בתוך האוטוציסט E3.5 באמצעות אלקטרופורציה של ovo. למרות שמניפולציות גנטיות יכולות לספק תובנות חשובות, הפנוטיפים שנוצרו כך יכולים להיות פליאוטרופיים וכתוצאה מכך מבלבלים. זה נכון במיוחד במהלך התפתחות מאוחרת יותר של האוזן הפנימית, שבה תהליכים בסיסיים כגון שיפוץ ציטוסקטלי ממלאים תפקידים רבים בחלוקת תאים, מורפוגנזה של רקמות והתמחות תאית. אנו מציגים פרוטוקולים לעיכוב פרמקולוגי במרגלים מתורבתים, המציעים יתרונות בשליטה על תזמון ומשך הטיפול והטיפול, ומציעים מניפולציה מרחבית-טמפורלית מדויקת של מנגנוני התפתחות.

ניתן להשתמש בשיטות שונות של תרבית איברים בהתאם למשך הטיפול במעכבים קטנים. כאן אנו מדגימים שתי שיטות של תרבית איברים המאפשרות תובנות על מורפוגנזה אפיתליאלית והתמחות תאית. שיטה לתרבית תלת-ממדית המשתמשת בקולגן כמטריצה לתרבית צינור השבלול מאפשרת התרבות החזקה והדמיה חיה של ה-BP המתפתח. להבנת היווצרות הסטריאוציליה, אנו מציגים שיטת תרבית ממברנה כך שרקמת האפיתל עוברת בתרבית על מטריצה נוקשה המאפשרת לבליטות אקטין לגדול בחופשיות. שתי השיטות מאפשרות עיבוד במורד הזרם כגון הדמיית תאים חיים, אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM), הקלטת תאים וכו '. טכניקות אלה מספקות מפת דרכים לשימוש יעיל בגוזל כמערכת מודל להבנה ולמניפולציה של ההתפתחות, ההבשלה וההתחדשות של אפיתל השמיעה של העופות.

פרוטוקולים הכוללים רכישה, תרבית ושימוש בביצי תרנגולות מופרות ובעוברים שלא נקטפו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים של המרכז הלאומי למדעי הביולוגיה, בנגלור, קרנטקה.

1. ב ovo electroporation של מבשרי השמיעה אפרוח

1. תכנון ושיבוט sgRNA עבור נוקאאוט הגן CRISPR/Cas9
   1. ליצירת נוקאאוטים של גנים, התכנון מנחה רנ"א לשבש את אזורי האקסון של הגן, רצוי קרוב יותר לקצה 5' של אזור הקידוד.
   2. בחר את ה-RNA המנחה הפוטנציאלי באמצעות כלי אינטרנט CRISPOR²³. הגדר את נתוני הדפדפן לגאלוס גאלוס ולרצף המוטיב הסמוך של הפרוטוספייסר (PAM) ל- 5'- NGG -3'. התוכנית קובעת רנ"א מנחה מרצף הקלט ומקצה ציונים שונים על סמך פעילות על המטרה ומחוצה לה. בחר את ארבעת המדריכים המובילים למחקרים נוספים.
   3. לתכנון אוליגוס ספציפיים לתבנית לייצור (g)RNA, הסר את רצף PAM (5′- NGG -3′) מפלט כלי התכנון gRNA. זה לא נחוץ למיקוד, אבל מכיל את רצף זיהוי המחשוף Cas9. סנתז שני אוליגואים משלימים מטוהרים של HPLC עם אתר הגבלת BsmBI בשני הקצוות, עבור כל gRNA פוטנציאלי.
   4. שכפל את רצף המדריך במסגרת עם פיגום tracrRNA של וקטור בחירה (כאן, וקטור pcU6_1sgRNA שימש²⁴).
   5. ממיסים את האוליגונוקלאוטידים של sgRNA בריכוז של 100 μM במים נטולי DNase/RNase. בצע חישול של שני מדריכי אוליגו חושים ואנטיסנס באמצעות תרמוציקלר עם הפרמטרים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואז 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן ירידה ל -4 מעלות צלזיוס.
   6. תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות כמתואר^ב-25, הגדרת עיכול הגבלת של אוליגוס מחושלים ושיבוט וקטור שיבוט pcU6_1sgRNA עם אנזים BsmBI בן לילה. קשירת התקנה עם וקטור pcU6_1sgRNA מעוכל BsmBI ליניארי מטוהר בג'ל ואוליגו sgRNA מעוכל. הפוך לתא מוכשר DH5-אלפא ורצף לאשר את השיבוט המתקבל.
2. טיפול בביצים וחלונות
   1. רכשו ביצים טריות וניקו אותן על ידי ניגוב שלהן ב-70% אתנול כדי למנוע זיהום. דגירה ב 37-38 מעלות צלזיוס, עם 45% לחות במשך 3.5-4 ימים.
   2. לאחר הדגירה, מניחים את הביצה על צדה לפחות 5 דקות לפני הפתיחה. זה מאפשר לעובר למקם מחדש את החלק העליון של החלמון. השתמשו במלקחיים כדי ליצור חורים קטנים בחלק העליון והקהה של הביצה, כך שמחט 21G יכולה לעבור דרכה.
   3. כדי למנוע נזק במהלך החלון, הסר אלבומין כדי להוריד את העובר הרחק מהקליפה. כדי לעשות זאת, להשתמש מזרק 5 מ"ל מחט 21G כדי לצייר בזהירות 2 מ"ל של אלבומין מחור בקצה קהה של הביצה. השתמש בסרט שקוף כדי לכסות את החור בקצה הקהה.
   4. כדי להפוך את חלון הביצה, להדביק סרט שקוף על החלק העליון של קליפת הביצה. חותכים פתח חלון, באורך של כ-2 ס"מ וברוחב 1.5 ס"מ, באמצעות מספריים של קשת קפיצית וחושפים את העובר. השתמש במלקחיים כדי לפתוח את הקרומים הכוריוניים מעל העובר, ולאפשר גישה לעובר.
3. פלסמידים למיקרו-הזרקה
   1. לניסוי נוקאאוט הגנים, הכינו שני פתרונות: תערובת הנוק-דאון המכילה חלבון SpCas9 ופלסמיד מנחה - pcU6_1sgRNA, ותערובת הפלסמיד העוקבת של T2K-eGFP (זהו מקדם צ'יק ß-אקטין המניע קלטת GFP המוקפת באתרי הטרנספוזון של Tol2) יחד עם T2TP (הטרנספוזאז Tol2 משובט ב- Tol2 בונה^26,27). העקיבה משמשת למעקב אחר יעילות האלקטרופורציה.
   2. בעת אלקטרופולציה של פלסמידים מרובים, ודא שהריכוז הסופי של הדנ"א הוא לפחות 4 מיקרוגרם / μL. ערבבו את שלושת המבנים, הנחו פלסמיד - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP ו- T2TP, ביחס של 1:1:1 עם 1 מיקרוגרם של חלבון SpCas9, 30% סוכרוז וצבע ירוק מהיר של 0.1% בנפח סופי של 10 μL.
   3. משוך מחטים למיקרו הזרקה מנימי זכוכית סטנדרטיים (אורך 3 אינץ ', OD 1.0 מ"מ) באמצעות מושך פיפטה אנכי. השתמשו במלקחיים עדינים כדי לנתק את הקצה הנימי לאחר המשיכה כדי לקבל קוטר קצה של כ-50 מיקרומטר עם קצה מחודד.
   4. הניחו את העוברים ב-E3.5 בצד שמאל כשהראש פונה ימינה. בדרך זו רק שלפוחית השחלות הימנית נגישה להזרקת מיקרו. מיקרו-להזריק את תערובת הנוק-דאון לתוך שלפוחית otic. להזריק סביב נפח של 200 nL של תערובת תמיסת DNA כדי למלא את שלפוחית otic.
   5. קבע את יעילות המדריך באמצעות מבחן אנדונוקלאז T7²⁸.
4. אלקטרופורציה
   1. יש להוסיף כמה טיפות של 0.719% מלוחים על גבי העובר לפני האלקטרופורציה כדי להוריד את ההתנגדות החשמלית ולמנוע התחממות יתר של העובר.
   2. מניחים את האלקטרודה החיובית דרך החור שנוצר בצד הבוטה של הביצה כאשר האלבומין הוסר. תמרן את האלקטרודה כך שתהיה מתחת לחלמון. מניחים את האלקטרודה השלילית מעל האוטוציסטה המלאה.
   3. השתמש באלקטרופורציה כדי להעביר פלסמידים לתאי העובר. השתמש במחולל פולסים מרובע והחל חמש פולסים של 25 וולט ומשך זמן של 100 אלפיות השנייה כל אחת, בהפרש של 50 אלפיות השנייה זו מזו. קבע את התנאים באופן אמפירי בהתבסס על מערך אלקטרופורציה בודד.
   4. לחות את העובר לאחר אלקטרופורציה על ידי הוספת כמה טיפות של 0.719% מלוחים. כדי לנקות אלבומין שעבר דנטורציה מפני השטח של האלקטרודות, שטפו אותו היטב במים מזוקקים. אטמו מחדש את הביצה עם סרט שקוף וחזרו לחממה הלחה בטמפרטורה של 37-38 מעלות צלזיוס להמשך הדגירה.
      הערה: ניתן לתרבת את העוברים עד לבקיעה לאחר האלקטרופורציה, אולם יש ירידה תלולה בכדאיות.

2. דיסקציה של פפילה בזילאר

1. השתמש ב-70% אתנול כדי לחטא את שולחן הניתוחים, שלב המיקרוסקופ והסביבה. מחממים או אלכוהוליים מעקרים ציוד מיקרו-דיסקציה הכולל מספריים עם קפיץ מינימלי, מיקרו-קורט ושני זוגות מלקחיים עדינים.
2. הכינו את לוחות הדיסקציה הבאים: צלחת פטרי זכוכית עם בסיס סיליקון שחור, צלחת פטרי מפלסטיק 90 מ"מ וצלחת פטרי 60 מ"מ. יש לצנן את תמיסת המלח החצובה בפוספט (PBS) או את תמיסת המלח המאוזנת (HBSS) של הנקס לנתיחות.
3. מפצחים בעדינות את הביצה לתוך צלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ. זהה את האוזן החיצונית של הגוזל. ערפו את העובר על ידי חיתוך הצוואר ממש מתחת לגובה הלסת התחתונה באמצעות מספריים. מעבירים את הראש לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ מלאה ב-PBS קר כקרח.
4. כוון את העובר כאשר החלק העליון של המקור פונה לכיוון הנסיין והחזק את המקור באמצעות אחד המלקחיים #5. הוציאו את העיניים בעזרת המלקחיים השניים #5. עוברים מרוסטרל לקאודל, חותכים את הגולגולת לאורך קו האמצע שלה. הוציאו את המוח.
5. הוסיפו עוד PBS או HBSS קרים כקרח ואתרו את שני המבנים המבריקים, קרוב לרמת הפינה. אלה הם האוטוליטים של הלגנה בקצה צינור השבלול ונמצאים קרוב לקו האמצע.
6. חותכים בערך בין שתי הלגנות, והרבה מעל ומתחת לאזור זה כדי לבודד שתי אוזניים פנימיות. תחת תאורה אלכסונית, דמיינו את קווי המתאר של האוזן הפנימית. הסר רקמות חיצוניות ואת הפרוזדור.
7. העבירו את השבלול המבודד לצלחת בסיס מסיליקון שחור עם PBS קר כקרח. באמצעות מלקחיים #5, יש לקלף את כמוסת השבלול הסחוסית כדי לקבל את צינור השבלול. אתר את השכבה הגלית (tegmentum) של צינור השבלול והסר באמצעות #55 מלקחיים כדי לחשוף את BP. באמצעות #55 מלקחיים, להסיר את הממברנה הטקטוריאלית כדי לחשוף HCs ו- SCs.

3. תרבות של צמחי פפילה בזילריים

1. תרבית הממברנה של BP
   1. קח צלחת תרבית רקמה בת שש בארות וסדר ממברנת תרבית אחת לכל באר.
   2. אספו את הפפילה הבזילרית המנותקת (explant) בפיפטה של 200 μL עם חיץ HBSS 1x והעבירו אותה על ממברנה. כדי למנוע מהרקמה להידבק לדופן הפיפטה, ציירו מעט מדיה לפני שאתם שואפים את הרקמה.
   3. כוון את הצמח כך שהפפילה הבזילרית פונה כלפי מעלה, כך שהשיער ותאי התמיכה נראים^מ-29 הראשונים. לאחר מיקום היציאה, שאפו את חיץ ה-HBSS באיטיות מפני השטח של קרום התרבית. בתהליך זה, האקסצ'יל יתחבר לקרום התרבית.
   4. הוסף 1.2 מ"ל של מדיית תרבית הנשר המתוקנת של דולבקו (DMEM) בין תוסף הממברנה לדופן הבאר כדי למלא את הבארות של צלחת שש הבארות. ניתן לתרבת עד שישה צמחים על קרום תרבית יחיד בקוטר 30 מ"מ.
2. תרבית הקולגן של צינור השבלול
   1. הכינו את תערובת הקולגן על ידי הוספת 400 מיקרו-ליטר של קולגן 3 מ"ג/מ"ל זנב חולדה, 50 מיקרו-ליטר של 10x DMEM, 30 מיקרו-ליטר של 7.5% NaHCO₃ ו-5 מיקרו-ליטר של HEPES במכסה של תרבית רקמה.
   2. קחו צלחת של ארבע בארות והוסיפו שלוש טיפות של תערובת קולגן לכל באר. העבירו את צינור השבלול המנותק לכל טיפת קולגן. לדגום את הצלחת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ כדי לרפא את מטריצת הקולגן.
3. טיפול במולקולות קטנות בתרביות
   1. הכן מדיה תרבותית (DMEM, תוסף N-2, פניצילין) עם אפנן פרמקולוגי או ממס שלה לבד (לשימוש כבקרה). החלף את מדיה תרבותית עם 700 μL של מדיה בתוספת המעכב. תרבית את הצמחים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
   2. החלף 50% מהתקשורת התרבותית מדי יום. לאחר זמן הדגירה המתאים, הסר את מדיית התרבית והשתמש בצמחים לבדיקות במורד הזרם.

4. הדמיה וניתוח

1. אנליזה אימונופלואורסצנטית
   1. יש להסיר את מדיית התרבית מהבארות ולשטוף את הצמחים פעמיים עם HBSS אחד. באמצעות פיפטה, להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) לבאר דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. הסר PFA ושטוף את הצמחים שלוש פעמים עם 1x PBS בטמפרטורת החדר. כדי לאסוף את הצמחים מממברנת התרבית, בצע חתך קטן סביב הממברנה המכילה את פיסת הרקמה באמצעות מספריים קטנים של קשת קפיצית והעבר את הרקמה יחד עם הממברנה לצלחת תרבית בת 48 בארות באמצעות מלקחיים.
      הערה: אם הרקמות צפות לאחר הקיבוע, שאפו עם פיפטה של 200 μL והעבירו אותה לצלחות של 48 בארות לעיבוד נוסף. הימנע ניתוק כוחני של הרקמה מן הממברנה.
   3. עבור תרבית טיפות קולגן, השתמשו במלקחיים כדי להעביר את כל טיפת הקולגן לצלחת סיליקון. הוסף 200 μL של 1x PBS ולהסיר קולגן בעזרת מלקחיים, ולאחר מכן להעביר את הרקמה לצלחת תרבית 48 באר.
   4. חלחלו לצמחים עם 1 מ"ל של PBS 1x בתוספת 0.3% Tween-20 (PBST) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. דגרו את הצמחים עם 200 μL של מאגר חוסם (10% סרום עיזים + 1% אלבומין בסרום בקר ב- PBST) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   5. דגרו את האקספלורציה עם 200 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית (1:300, בחיץ חוסם) במשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטוף היטב את הצמחים 5 x 20 דקות עם PBST.
   6. דגרו את האקספלורציה עם 200 מיקרו-ליטר של פלואידין ותמיסת נוגדנים משנית (בחיץ חוסם) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך. הסר את תמיסת הפלואידין והנוגדן המשני ושטוף היטב את הצמחים 5 x 20 דקות עם PBST.
      הערה: יש לקבוע את ריכוז הנוגדנים המשני ואת אורך הכביסה עבור כל יישום הדמיה בנפרד. עבור הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, אנו בדרך כלל מגדילים את ריכוז הנוגדן המשני מ-1:500 ל-1:200 ומעלים את ריכוז הפלואידין מ-1:400 ל-1:200.
   7. דגרו את הצמחים עם תמיסה של DAPI (1:1000 ב-PBST) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תמיסת DAPI ושטוף את היציאות 3 x 5 דקות עם PBST.
   8. השתמש במדיית ההרכבה כדי להרכיב את הקצוות על מגלשה כאשר BP פונה כלפי מעלה (כנגד הכיסוי). עבור הדמיה confocal להשתמש במדיה הרכבה antifade. הניחו למדיית ההרכבה להתייבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך. צלם ישירות או אחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4 °C עד להדמיה.
2. קיבוע OTOTO לניתוח SEM
   1. הכינו את כל הפתרונות טריים וטפלו בהתאם להנחיות הבטיחות המקומיות. תיקון צמחים בתרבית קרום (משלב 4.1.4) ב-2.5% גלוטראלדהיד ב-0.1 M נתרן קקודילאט בופר (pH 7.3) עם 3 mM CaCl₂. בצע קיבוע ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 72 שעות עם שינוי של קיבוע כל 24 שעות.
   2. הסר את המקבע ולשטוף את הרקמה עם 0.1 M נתרן cacodylate 3 x 5 דקות בטמפרטורת החדר. תיקון משני עם 1% OsO 4 (מדולל ממלאי 4% OsO₄ באמצעות חיץ נתרן קקודילאט 0.1 M) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בצע את זה ואת השלבים הבאים עד התייבשות במכסה אדים.
   3. יש לשטוף באמצעות חיץ נתרן קקודילאט 0.1 M 3 x 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשטוף במים מזוקקים כפולים או אולטרה-טהורים בגודל 3X5 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. הכן פתרון של 0.5% של תיאוקרבוהידראזיד (TCH) במים טהורים במיוחד. מערבבים בטמפרטורה של 75°C למשך 10 דקות ומסננים את התמיסה לאחר שהתקררה לטמפרטורת החדר.
      הערה: TCH מסוכן ביותר. השימוש חייב להיות מאושר על ידי ועדת הבטיחות המקומית, ויש לנקוט משנה זהירות בעת הטיפול.
   5. הסר מים אולטרה-פוריים מהדגימה והוסף 0.5% TCH טיפה אחר טיפה. אם התמיסה הופכת חומה, עצרו ושטפו את הדגימה במים אולטרה-טהורים, לפני שתוסיפו בזהירות את תמיסת ה-TCH של 0.5%. ברגע שהפתרון ברור, החלף אותו ב-0.5% TCH. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות^30,31.
   6. יש לשטוף את הדגימה במים אולטרה-טהורים בגודל 3X5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלבים 4.2.2, 4.2.3 ו- 4.2.5 פעמיים נוספות המסתיימות בדגירת OsO₄ ואחריה שטיפה.
   7. לייבש את הדגימות בסדרת אתנול ל-100% אתנול נטול מים (EtOH). דגירה תחילה ב-25% ETOH למשך 10 דקות, לאחר מכן 50% ETOH למשך 10 דקות, 75% EtOH למשך 10 דקות, 95% ETOH למשך 10 דקות, לפני דגירה עבור סך של 3x במשך 10 דקות כל אחד ב-100% ETOH.
   8. בצע ייבוש נקודה קריטית באמצעות CO₂ נוזלי. מיד להרכיב את הדגימות על stub SEM עם סרט דבק פחמן דו צדדי. המשך לציפוי sputter כדי לספק 5-10 ננומטר של ציפוי. אם לא הדמיה מיידית, לאחסן את הדגימות במייבש תחת ואקום.

במערך האלקטרופורציה, מיקום אלקטרודות יכול למלא תפקיד בתחום הטרנספקציה. האלקטרודה החיובית ממוקמת מתחת לחלמון, והשלילית מעל העובר (איור 1A). התוצאה היא ביטוי GFP גבוה יותר בחלק גדול מהאוזן הפנימית ובשני איברי שיווי המשקל (איור 1B), ופפילה בזילרית שמיעתית (איור 1C,D), המאשרת את הטרנספקציה.

כדי להעריך את הפנוטיפ של קריספר-נוק-דאונים, עיצבנו רנ"א מנחים לגורם השעתוק של תאי השערה Atonal homolog 1 (Atoh1). מוטציות עכבר של Atoh1 אינן מסוגלות ליצור תאי שערה³²; לאחר שאלקטרופורציה של Atoh1 מנחה רנ"א ודגירה עד E10, אנו מוצאים שהתפתחות HC נפגעת בהשוואה לבקרה ולבקרת פלסמידים ריקה (איור 2). אף על פי שאלקטרופורציה היא פסיפס (איור 2E,F), תאי בקרה אלקטרופואטיים מסוגלים ליצור תאי שערה. בדגימות אלקטרופורציה של Atoh1 gRNA, תאים חיוביים של GFP לעולם לא מראים את הסמנים של התפתחות HC (איור 2B).

תרבית איברים של BP מספק נגישות לרקמה. תרביות במטריצה תלת-ממדית, כגון קולגן, מספקות שימור מצוין של מורפולוגיה של רקמות למשך עד 5 ימים. הארגון של HC ו-SC נשמר בתנאי התרבות האלה (איור 3).

תרביות איברים על קרום עדיפות להדמיית סטריאוציליה. תרבויות כאלה יכולות להיות מתורבתות עד 5 ימים תוך שמירה על שלמות צרור השיער. ניתן לראות זאת על-ידי לוקליזציה של חלבון קצה הקישור, פרוטוקדהרין 15³³ (Pcdh15) (איור 4). כדי לחקור את הפיתוח של צרור השיער, יש צורך בהדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, וגישות כאלה, באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יותר (איור 4D) או מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (איור 4E), מספקות מידע מלא יותר.

איור 1. ביטוי GFP נראה ב- E10 לאחר אלקטרופורציה של ovo ב- E4. (A) דיאגרמה סכמטית הממחישה במיקרו-הזרקה של ovo ואלקטרופורציה בשלפוחית השיבולת של אפרוח ב-E4. פיפטה ההזרקה מלאה בפלסמידים Tol2-eGFP (T2K-eGFP) ו- Tol2-transposases (T2TP), יחד עם צבע ירוק מהיר להדמיה. (B) תמונה של האוזן הפנימית האלקטרופואטית ב-E10 באמצעות עדשת מטרת אוויר 0.63x בסטריאומיקרוסקופ. האוזן הפנימית השמאלית היא הבקרה הפנימית. החץ האדום מסמן את ביטוי ה-GFP בצינור השבלול של האוזן הפנימית הימנית, והכוכבית האדומה מראה ביטוי GFP באיברי שיווי משקל; סרגל קנה המידה הוא 2 ס"מ. (C) תמונה פלואורסצנטית של שדה רחב של חתך רוחב של צינור שבלול ימני באמצעות מטרת אוויר של פי 20 של 0.5 NA. ביטוי GFP מוגבל בעיקר לאפיתל החושי; סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. (D) תמונה קונפוקלית של פפילה בזילרית שלמה שצולמה באמצעות 10x מטרת אוויר של 0.5 NA מוכתמת בפלואידין מצומד עם אלקסה 647 פלואורופור. ביטוי GFP נצפה מסוף פרוקסימלי עד דיסטלי בצד העצבי של BP; סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2. נוקאאוט הגן Atoh1 בתיווך CRISPR/Cas9 באמצעות אלקטרופורציה של OVO גורם לאובדן תאי שערה (HCs). גן Atoh1 מדריך פלסמיד pcU6_1-Atoh1sgRNA ופלסמידים עוקבים Tol2-eGFP (T2K-eGFP) ו Tol2-transposases (T2TP) עם חלבון SpCas9 הם microinjected ו electroporated בשלפוחית שיבולת אפרוח ב E4. כל התמונות הן מפפילה בזילרית אפרוח E10 עם מוט בקנה מידה של 10 מיקרומטר, שצולמה עם יעד טבילת שמן פי 60 של 1.42 NA באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר. כניסות מוגדלות מסופקות עבור כל התמונות. (א,ב,ג,ד) הפאנל השמאלי מכיל BP עם תאי שערה (HCs), אלקטרופוטציה עם pcU6_1sgRNA ריקות ו-T2K-eGFP, ו-T2TP עם חלבון SpCas9. (E,F,G,H) הפאנל הצדדי הימני מכיל BP עם אובדן HCs, אלקטרופוזה עם מדריך Atoh1 (pcU6_1-Atoh1sgRNA) ו- T2K-eGFP, ו- T2TP עם חלבון SpCas9. (א,ה) תמונה ממוזגת המציגה תאי שערה (HCs) בפפילה הבזילירית. אלה הם אימונואקטיביים עבור מיוזין 7a (כחול); F-אקטין מוכתם עם פלוידין מצומד עם אלקסה 647 (אדום); ביטוי GFP מפלסמידי Tol2-eGFP מזוהה באמצעות נוגדן נגד GFP (ירוק). אובדן HCs ניכר מהפעילות החיסונית של מיוזין 7a כאשר משווים טיפולים עם pcU6_1sgRNA ריק (D) ו- pcU6_1-Atoh1sgRNA (H). הדמיית F-actin משני הטיפולים מדגישה את צרור השיער של HC (B,F). (ג,ז) T2K-eGFP ו- T2TP משמשים למדידת מיקום ויעילות ההעברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3. תרבית איברים של צינור השבלול בתרבית טיפות קולגן תלת-ממדית שומרת על הארגון של אפיתל חושי. ה-BP ב-E10 מתורבת בתרבית של טיפות קולגן תלת-ממדיות למשך יום אחד ומצולמת באמצעות יעד טבילת שמן פי 60 של 1.42 NA באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. (A ) תמונה של BP שלם של E10 בתרבית במשך יום אחד בטיפת קולגן ומוכתם בנוגדנים נגד אנטיגן תאי שיער (HCA)³⁴. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. ( B ) תמונה ממוזגת המציגה את הארגון המשומר של אפיתל חושי מהצד הדיסטלי של BP מוכתם ב -(C ) פלואידין (ירוק) ו -(D) HCA (כחול); סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תרשים 4. צרורות סטריאוציליאריים של פפילה בזילרית תחת מיקרוסקופ אלקטרונים ואור. 0.1% דימתילסולפוקסיד (DMSO) שטופלו ב-BP הושתלו ב-E10 וגודלו בתרבית במשך 3 ימים במבחנה (DIV) על תוספות תרבית ממברנה. (A) Explant מצולם באמצעות יעד טבילת שמן פי 60 של 1.42 NA עם מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. התמונה הממוזגת מציגה את הביטוי של פרוטוקדהרין 15 (Pcdh15) וסטריאוציליה המסומנת על ידי פאלוידין המצומד לאלכסה 488 (ירוק). מוצגות תמונות חד-ערוציות של F-אקטין ( B) ו- Pcdh15 (C). סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. (D) תמונה ברזולוציה גבוהה במיוחד של סטריאוציליה מוכתמת בפלוידין מצומדת ל-Alexa 488 מכתים בירוק. התמונה התקבלה באמצעות יעד טבילת שמן 63x של 1.42 NA במצב Airyscan של מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר. סרגל קנה המידה הוא 5 מיקרומטר. (E) תמונת SEM צולמה בהגדלה של 16340x באמצעות מתח גבוה של 7 kV אלקטרונים (EHT). כוכבית אדומה מסמנת קינוציליה וטריז אדום מסמן סטריאוציליה. הבהירות והניגודיות הותאמו לאוטומטי והתמונה חודדה באמצעות FIJI. סרגל קנה המידה הוא 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הגוזל הוא תוספת חסכונית ונוחה לאורגניזמי המודל שמעבדה עשויה להשתמש בהם כדי לחקור את האוזן הפנימית. השיטות המתוארות כאן משמשות באופן שגרתי במעבדה שלנו ומשלימות מחקר מתמשך באוזן הפנימית של היונקים. ב ovo אלקטרופורציה משמש כדי להציג מניפולציות גנטיות לתוך הגנום אפרוח. אלקטרופורציה יכולה לשמש גם כדי להציג מבנים המקודדים חלבונים פלואורסצנטיים המיועדים לאברונים מסוימים או למבנים תת-תאיים^35,36. אמנם מדובר בהליך פשוט, אך מניפולציה של עוברים ב- ovo אכן משפיעה על הכדאיות. עבור electroporation יעיל, ביצים יש לרכוש טרי (זמן קצר לאחר ההטלה). עלייה בתמותה ו/או התפתחות חריגה נצפית לעתים קרובות בביצים שאוחסנו במשך יותר מ-5 ימים. השימוש בטכניקה סטרילית, הבטחת הביצית אטומה כראוי כך שהיא לא תאבד לחות, ומזעור המניפולציות המבוצעות על העובר משפרים את הכדאיות.

מצאנו שהתמקדות באוטוציסט ב-E3.5 עד E4 מפחיתה את הטראומה שהעובר מתמודד איתה, ושימוש באלקטרודות הממוקמות בקפידה מאפשר מיקוד טוב של המבשרים התחושתיים של ה-BP. עם זאת, בשלב זה, מבשרי הגנגליון האקוסטי-וסטיבולרי כבר נדדו הרחק מהאוזן הפנימית^37,38. כדי להתמקד בתאים אלה, יש לבחור נקודות זמן מוקדמות יותר לאלקטרופורציה של אוטוציסט, ולבצע התאמות לירידה המקבילה בכדאיות. הערה נוספת של זהירות היא האפשרות של פסיפס בעוברים אלקטרופוטיים. לא כל התאים תופסים את כל הפלסמיד, ולכן הפסיפס יכול לבלבל את הפרשנות. השימוש בפלסמידים עוקבים מסייע בפענוח נתונים ומספק שליטה מסוימת על אפקטים אפשריים של פסיפס. שימוש במספר רב של חזרות, ניתוחים זהירים ושיטות סטטיסטיות יסייעו בהערכת הפנוטיפים של הפסיפס. גישה חלופית היא להשתמש בשליו מהונדס גנטית³⁹. נכון לעכשיו, מספרים אלה מוגבלים ולא תמיד זמינים למעבדות רבות. עם זאת, הזמינות תגדל, ועוברי שליו, המבטאים באופן מרכיב חלבונים פלואורסצנטיים תת-תאיים ממוקדים, הם הצעה אטרקטיבית לניסויי הדמיה.

בשיטה זו, אנו מבצעים אלקטרופולציה של חלבונים ודנ"א עבור חיסולים בתיווך קריספר באמצעות צירוף קצוות לא הומולוגי (NHEJ)²⁴. הדור המתווך של קריספר/Cas9 של מבני היתוך באמצעות תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) נותר לא יעיל בפרדיגמה המסוימת הזו (Singh et al., תצפיות שלא פורסמו). שיטת האלקטרופורציה יכולה להיות מותאמת לשימוש עם סוגים אחרים של מבני דנ"א (אלה יכולים להיות מבנים המקודדים חלבוני היתוך), כמו גם עבור RNA וחלבון. יש לציין כי במהלך הפיתוח (וחלוקת התא) מבני ביטוי מבוססי דנ"א ידוללו אלא אם כן הווקטור ישלב אתרים המתווכים החדרה של הדנ"א האקסוגני לגנום של תאים אלה (למשל, Tol2 או PiggyBac). זה מאפשר ביטוי יציב יותר של המבנה.

לאחר האלקטרופורציה, העוברים בדרך כלל מתורבתים ב-ovo עד שלב E10 לצורך התמיינות תאי שיער ומחקרי התפתחות. אבל במידת הצורך, בתרבות אובו ניתן להמשיך עד שהביצים בוקעות; עם זאת, עם אורכי הדגירה ההולכים וגדלים יש ירידה מקבילה בכדאיות. כדי לעקוף את זה, ב ovo אלקטרופורציה ניתן לשלב עם דיסקציות BP ואחריו תרבית ex ovo לטווח ארוך. גידול צמחים בתוך מטריצה תלת-ממדית מאפשר שימור טוב של מורפולוגיה של רקמות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור שינויים בדפוסי רקמות, קוטביות ובידול. התרבית של BP על קרום מאפשרת הדמיה של הצד האפי של הרקמה²⁷, במיוחד הדמיה ברזולוציה גבוהה של הסטריאוציליה.

במקרים מסוימים, ניתן להתגבר על מגבלות השינוי הגנטי באמצעות טיפולים שונים המבוססים על מולקולות קטנות. התרכובות הפעילות פרמקולוגית פועלות כמעכבים או אגוניסטים למסלולי איתות או לתהליכים ביולוגיים של תאים. היישום שלהם שימושי במיוחד בניתוח הדרישה הזמנית. עם זאת, יש לקבוע באופן אמפירי את דרכי האספקה המדויקות ואת הריכוזים האופטימליים, שכן במקרים מסוימים סטנדרטיזציה המבוצעת בקווי תאים אינה דומה למינון הנדרש ברקמות. לידה בתוך העובר יכולה להיות בעייתית, והכמות הדרושה בשילוב עם ההשפעה על מערכות איברים אחרות עלולה לפגוע בכדאיות באופן משמעותי. חלופה מוכנה היא שיטות תרבות איברים^20,21,22. עם זאת, שיטת התרבות המדויקת תלויה בסוגי המחקר והניתוחים המיועדים. בעוד שתרבית קולגן משמרת את מורפולוגיית הרקמה של BP, תרבית ממברנה מתאימה יותר לחקר צרורות השיער האפיקליים של HC. ניתן פשוט להניח את הרקמה על גבי הממברנה כדי לדמיין את המשטח האפיקלי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק או מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. ניתוחים לתרבות איברים אכן דורשים תרגול טוב. אלה כוללים שמירה על סביבת עבודה סטרילית ושימוש במכשירים מחודדים. כלי מיקרו-דיסקציה כאלה הם רגישים, ואנו מוצאים את השימוש בצלחות סיליקון חשוב בשמירה על שלמות הכלים המיקרו-כירורגיים.

יחד, הטכניקות מייצגות גישות חשובות לקידום ההבנה של התפתחות האוזן הפנימית. התובנות בביולוגיה השוואתית ובהתחדשות שמציעים עוברי האפרוחים יכולות לספק תובנות משמעותיות על התפתחות ותפקוד תאי השיער.

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

אנו מודים על תמיכה מ-NCBS, TIFR, מענק מחקר מוביל של Infosys-TIFR, DST-SERB והמכון הלאומי המלכותי לחירשים. ברצוננו להודות לארגון פיתוח עופות מרכזי ומכון הכשרה, Hesaraghatta, בנגלור. אנו אסירי תודה לתמיכת המתקן והמעבדה של CIFF ו- EM ב- NCBS. אנו מודים ליושיקו טקהאשי וקויצ'י קוואקאמי על בניית Tol2-eGFP ו- T2TP, ולגיא ריצ'רדסון על נוגדן HCA ו- G19 Pcdh15. אנו מודים לחברי ארלאב על תמיכתם המתמדת והמשוב החשוב שלהם על הפרוטוקול.