Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitin İndüksiyonu ve Çeşitli Değerlendirme Göstergeleri

Bu protokol, miyelin oligodendrosit glikoprotein kullanılarak bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelitin indüklenmesini ve klinik bir skorlama sistemi kullanılarak hastalık sürecinin izlenmesini açıklamaktadır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit ile ilişkili semptomlar, hastalık sürecini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için fare femur mikro-bilgisayarlı tomografi analizi ve açık alan testi kullanılarak analiz edilir.

Multipl skleroz (MS), inflamatuar infiltrasyon, demiyelinizasyon ve aksonal hasar ile karakterize tipik bir santral sinir sistemi (SSS) otoimmün hastalığıdır. Şu anda, MS'i tamamen tedavi etmek için herhangi bir önlem yoktur, ancak hastalığın ilerlemesini kontrol etmek ve hafifletmek için çoklu hastalık modifiye edici tedaviler (DMT) mevcuttur. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) ile MS hastalarının SSS patolojik özellikleri arasında anlamlı benzerlikler vardır. EAE, MS ilaçlarının etkinliğini belirlemek ve MS hastalığı için yeni tedavilerin geliştirilmesini araştırmak için temsili bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Farelerde EAE'nin aktif indüksiyonu stabil ve tekrarlanabilir bir etkiye sahiptir ve özellikle ilaçların veya genlerin otoimmün nöroinflamasyon üzerindeki etkilerini incelemek için uygundur. C57BL/6J farelerin miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG_35-55) ile bağışıklanması yöntemi ve klinik skorlama sistemi kullanılarak hastalık semptomlarının günlük değerlendirilmesi esas olarak paylaşılmaktadır. MS'in çeşitli klinik bulgularla karmaşık etiyolojisi göz önüne alındığında, mevcut klinik skorlama sistemi hastalık tedavisinin değerlendirilmesini karşılayamamaktadır. Tek bir müdahalenin eksikliklerini önlemek için, MS hastalarında anksiyete benzeri ruh hallerinin ve osteoporozun klinik belirtilerine dayanarak EAE'yi değerlendirmek için yeni göstergeler, MS tedavisinin daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlamak için oluşturulmuştur.

Otoimmün hastalıklar, bağışıklık sisteminin kendi antijenlerine karşı bağışıklık tepkisinin neden olduğu, doku hasarı veya işlev bozukluğu ile sonuçlanan bir bozukluk spektrumudur¹. Multipl skleroz (MS), santral sinir sisteminde (SSS) polinöropatinin kronik otoimmün bir hastalığı olup, inflamatuar infiltrasyon, demiyelinizasyon ve nöronal aksonal dejenerasyon ile^{karakterizedir 2,3}. Şu anda, MS dünya çapında 2,5 milyon kadar insanı, çoğunlukla ailelerinin ve toplumun bel kemiği olan 20-40 yaş arası genç ve orta yaşlı insanları etkilemiştir. Bu durum aileler ve toplum üzerinde önemli etki ve zararlara yol açmıştır ^2,4.

MS, çeşitli ve kompleks klinik bulguları olan multifaktöriyel bir hastalıktır. İnflamatuar infiltrasyon ve demiyelinizasyon ile karakterize klasik nörolojik bozukluklara ek olarak, MS sıklıkla görme bozukluğu, ekstremite diskinezisi ve bilişsel ve duygusal bozukluklar gösterir ^5,6,7. MS hastaları doğru ve doğru tedaviyi alamazlarsa, yarısı 20 yıl sonra tekerlekli sandalyede yaşayacak ve neredeyse yarısı depresif ve anksiyete belirtileri yaşayacak ve bu da genel popülasyondan çok daha yüksek intihar düşüncesine yol açacaktır ^8,9.

Uzun bir araştırma süresine rağmen, MS'in etiyolojisi belirsizliğini korumaktadır ve MS'in patogenezi henüz aydınlatılamamıştır. MS'in hayvan modelleri, kemirgen ve insan bağışıklık sistemleri arasındaki önemli farklılıklara rağmen, aynı zamanda bazı temel ilkeleri paylaşırken, hastalık gelişimini ve yeni terapötik yaklaşımları keşfetmek için test araçları olarak hizmet etmeye izin vermiştir. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) şu anda, duyarlı farelerde CNS bileşenlerine otoimmüniteyi indüklemek için miyelin proteinlerinden otoantijen bağışıklığı kullanan MS'i incelemek için ideal bir hayvan modelidir ve humoral immün yanıtı arttırmak için tam Freund adjuvanı (CFA) ve boğmaca toksini (PTX) ilavesi ile birlikte. Genetik arka plana ve immün antijenlere bağlı olarak, MS^10,11,12'nin çeşitli klinik formlarını taklit etmek için akut, relapsing-remitting veya kronik dahil olmak üzere farklı hastalık süreçleri elde edilir. EAE modellerinin yapımında yaygın olarak kullanılan ilgili immünojenler, miyelin bazik proteini (MBP), proteolipid proteini (PLP) veya miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG) gibi kendinden CNS proteinlerinden gelir. MBP veya PLP ile aşılanmış SJL / L fareleri relapsing-remitting bir seyir geliştirir ve MOG, C57BL / 6 farelerde^11,12,13'te kronik ilerleyici ^EAE'yi tetikler.

Hastalık modifiye edici tedavinin (DMT) temel amacı, hastalık semptomlarını en aza indirmek ve fonksiyon^6'yı iyileştirmektir. MS'i hafifletmek için klinik olarak çeşitli ilaçlar kullanılmaktadır, ancak henüz tamamen tedavi etmek için hiçbir ilaç kullanılmamıştır, bu da sinerjik tedavinin gerekliliğini ortaya koymaktadır. C57BL / 6 fareleri şu anda transgenik fareleri oluşturmak için en yaygın kullanılanlardır ve bu çalışmada, hastalığın ilerlemesini izlemek için C57BL / 6J farelerde MOG_35-55 tarafından indüklenen 5 noktalı bir EAE modeli kullanılmıştır. EAE modelleri ayrıca anksiyete benzeri ruh halleri ve kemik kaybı ve yaygın olarak bilinen demiyelinizan lezyonlardan muzdariptir. Burada, EAE semptomlarını açık alan testi ve mikro-bilgisayarlı tomografi (Mikro-BT) analizi kullanarak çoklu perspektiflerden değerlendirme yöntemi de açıklanmaktadır.

Tongji Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi mevcut çalışmayı onayladı ve tüm hayvan bakım kurallarına uyuldu. Deneyler için 8-12 haftalık erkek veya dişi C57BL/6J fareler kullanıldı. Deney gruplarında yaş ve cinsiyetin aynı olması sağlanmış; aksi takdirde, hastalığa duyarlılık etkilendi. Fareler, sabit koşullar altında (oda sıcaklığı 23 ± 1 ° C, nem% 50 ±% 10) alternatif 12 saat açık ve karanlık döngülere sahip patojensiz belirli bir ortamda barındırıldı.

1. MOG_35-55 emülsiyonunun hazırlanması

1. Freund'un adjuvanını (kendisi 1 mg / mL ısı ile inaktive edilmiş MTB, H37Ra içeren) tamamlamak için ısıda inaktive edilmiş liyofilize Mycobacterium tuberculosis (MTB, H37Ra) ekleyin, bu da 5 mg / mL'lik nihai bir MTB konsantrasyonu ile sonuçlanır (bkz.
   NOT: Tüm operasyon biyogüvenlik kabininde tamamlanmalıdır; üfleme havasını açmayın.
2. Liyofilize MOG_35-55 peptidini ( bakınız Malzeme Tablosu) steril önceden soğutulmuş Fosfat Tamponlu Salin (PBS) (kalsiyum ve magnezyum iyonları olmadan, pH 7.4) ile çözün ve antijen çözeltisini 2 mg / mL konsantrasyonunda hazırlayın.
3. Temiz bir 2 mL mikrosantrifüj tüpü alın ve her tüpe bir adet sterilize edilmiş 5 mm çelik bilye ekleyin ( bkz.
4. Bir çelik bilye içeren yukarıdaki mikrosantrifüj tüpüne 5 mg / mL MTB ve 500 μL MOG_35-55 antijen çözeltisi içeren 500 μL komple Freund adjuvanı ekleyin.
5. Yukarıdaki tüpü 10 dakika boyunca bir TissueLyser üzerinde salıncaklayın ( Malzeme Tablosuna bakınız), 10 dakika boyunca buz üzerinde soğutun ve iyice karıştırmak ve sonunda beyaz viskoz bir çözelti oluşturmak için dört kez tekrarlayın.
   NOT: İyi emülsifikasyon, MOG_35-55 emülsiyonunun hazırlanmasında önemli bir adımdır, bu nedenle kapsamlı bir karıştırma gereklidir. TissueLyser 28 Hz hıza ayarlanmıştır.

2. Boğmaca toksininin hazırlanması (PTX)

1. PTX'i ddH₂O ile 100 μg/mL konsantrasyona hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
2. PTX stok çözeltisini steril 1x PBS (kalsiyum ve magnezyum iyonları olmadan, pH 7.4) ile 50 kez seyrelterek kullanım için 200 ng/100 μL çözelti elde edin.

3. EAE hayvan modelinin kurulması

1. EAE modelini 8-12 haftalık erkek veya dişi C57BL/6J fareleri kullanarak oluşturun. Aşılamadan önce farelerin beslenme ortamına yeterince alıştığından emin olun.
2. Hazırlanan MOG_35-55 emülsiyonunu (adım 1) 4 °C'de 2-3 s için santrifüjleyin, tüpün altındaki tüm emülsiyonları çökeltmek için ekipmanın Darbe düğmesine basarak (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: MOG_35-55 emülsiyonu -20 °C'de birkaç gün saklanabilir. İlaç başarısızlığını önlemek için, mümkün olan en kısa sürede kullanılması önerilir.
3. 1 mL'lik bir şırınga namlusuna 22 G'lik bir iğne takın, MOG 35-55 emülsiyonunu aspire edin ve MOG_35-55 emülsiyonunu yeni bir 1 mL şırınga namlusuna aktarın. 1 mL şırınga namlusu ile 26 G'lik iğne arasındaki bağlantıyı sızdırmazlık filmi ile sabitleyin (bkz.
   NOT: MOG_35-55 emülsiyonunu 1 mL şırınga varillerine yüklerken hava kabarcıklarından kaçının.
4. Enjeksiyon bölgesini %70 etanol ile silin ve dezenfekte edin.
5. MOG_35-55 emülsiyonunu, farelerin dorsal omurgasının her iki tarafına, her iki tarafa 100 μL'ye deri altından enjekte edin. Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra farelerin dorsumunun derisi altında soğanlı kütlelerin otomatik oluşumunu gözlemleyin.
   NOT: Deneyimli deneycilerin bağışıklama işlemini gerçekleştirdiğinden ve fareler üzerindeki baskıyı en aza indirmek için enjeksiyonun nazikçe ve yavaşça yapıldığından emin olun.
6. Yukarıdaki fareleri intraperitoneal olarak 100 μL PTX ile enjekte edin (adım 2).
   NOT: Aşılama günü 0. gündür. Ayrıca, farelerin kuyruğunda bir renk işaretleyicisi kullanmak gibi sonraki günlük değerlendirme için farelerin doğru bir şekilde tanımlanabildiğinden emin olun.
7. Bağışıklamadan sonraki 2. günde aynı dozda PTX enjekte edin.
8. Bir grup aşılanmamış fareyi vahşi tip (WT) fareler olarak hazırlayın.

4. Farelerin klinik olarak izlenmesi

1. EAE ve WT farelerinin vücut ağırlığını günlük olarak kaydedin.
   NOT: EAE'nin şiddeti, farelerin kilo kaybı ile pozitif ilişkilidir, bu nedenle vücut ağırlığı da çok önemli bir izleme indeksidir.
2. Tablo 1'de listelenen 0-5 puanlama sistemini kullanarak aşılamadan 0-21 gün sonra farelerin durumunu izleyin.
   NOT: Aradaki belirtiler artı veya eksi 0,5 puan olarak sayılır.

5. Açık alan testi

NOT: Bu adım için seçilen deney hayvanları, erken başlangıç, tepe ve remisyon dönemlerinde EAE fareleridir. Ek olarak, WT fareleri kontrol olarak kullanılmıştır. EAE modellemesi için anksiyete bozukluğu olan fareleri dışlamak için modellemeden önce tüm farelerin anksiyete benzeri davranışlar için test edildiği belirtilmelidir. Ek olarak, tam motor yetersizliği olan pik ve remisyon dönemlerinde EAE fareleri testin dışında bırakıldı.

1. 40 × 40 × 40^cm3 açık alan reaksiyon odası ve bir hareket aktivitesi (açık alan) video analiz sistemi hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu).
   NOT: Kamera kutuyu tamamen kaplayacak bir konuma monte edilmiştir, reaksiyon odası eşit şekilde aydınlatılmıştır ve test odasının sessiz bir alan olması gerekmektedir.
2. Test farelerini deneye başlamadan 1 saat önce alışkanlık için test odasına yerleştirin.
3. Teste başlamadan önce reaksiyon odasının temiz olduğundan emin olmak için tüm alana% 70 etanol püskürtün ve temiz bir kağıt havluyla silin.
4. Her fareyi kafesinden ayrı ayrı çıkarın ve keşfetmeye başlamadan önce arenanın aynı köşesine yerleştirin.
   NOT: Kutunun alt kısmı, ortadaki dört ızgara alanı merkezi alan ve çevresindeki alan periferik alan olan 16 ızgaraya bölünmüştür.
5. Video analiz sisteminin menü çubuğundaki Yakalamayı Başlat düğmesine tıklayın, zaman kaydedin ve çekime başlayın.
6. Sınav salonunda sessiz kalın.
7. Kayıt işlemi sırasında farenin 5 dakika boyunca serbestçe hareket etmesine izin verin.
8. Edinme sistemini durdurun ve videoyu kaydedin.
9. Fareyi arenadan çıkarın, kafese geri koyun ve bir sonraki fareye geçin.
   NOT: Kokuları ve diğer maddeleri gidermek için test alanını çalışmalar arasında% 70 etanol ile temizleyin.
10. Video analiz sistemini kullanarak sonuçları analiz edin.

6. Kemik fenotipinin analizi

1. EAE ve WT farelerini 21. günde servikal çıkık ile ötenazileştirin.
   NOT: Servikal çıkık ameliyatları yapan personel, hayvanın ölümü sırasında katlanılan ağrıyı en aza indirmek için iyi eğitilmelidir.
2. Fareyi diseksiyon tepsisinde düz bir şekilde yatırın ve ekstremiteleri sabitleyin.
3. Farenin arka ekstremite derisini forseps ile tutun ve fare derisini ve kas dokusunu makasla açın.
4. Femuru tibia ve kalça kemiğinden makasla dikkatlice ayırın.
5. Femura yapışan kası makasla çıkarın ve femuru oda sıcaklığında% 70 etanol içine yerleştirin.
6. Distal femuru, 10 μm izotropik voksel boyutunda, 70 kV'luk bir tepe X-ışını tüp voltajı ve 0.114 mA'lık bir X-ışını yoğunluğu olan bir mikro-BT sistemi kullanarak tarayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Bir 3B Gauss filtresi, 2B eşik görüntülerinin gürültüsünün giderilmesine izin verir.
7. Kemik hacmi, doku hacmi, kemik mineral yoğunluğu, trabeküler ayırma, trabeküler sayı, trabeküler bağlantı yoğunluğu, trabeküler ve kortikal kalınlık dahil olmak üzere femur parametrelerini ölçmek için orta femur milinden taranan 100 dilimi analiz edin.
   NOT: Farelerde distal femur büyüme plağının proksimal ucundan başlayarak, epifizyal kapak yapılarından tamamen yoksun kesitler bulundu ve epifizyal trabekülleri tanımlamak için iç kortikal yüzeyden uzaktaki birkaç vokselde konturlar manuel olarak özetlenen proksimal femura doğru 100 dilim uzatılmaya devam edildi.
8. Mikro-BT sistemindeki kontur bölgelerinden eşik 2B görüntüleri istifleyerek 3B rekonstrüksiyonları oluşturun.

Farelerin bağışıklanmasından sonra, farelerin vücut ağırlığı günlük olarak kaydedilir ve klinik semptomları yukarıda açıklanan protokole göre değerlendirilir (adım 4). MOG peptidi ile aşılanmış C57BL / 6J farelerde, lezyonun yeri esas olarak omurilikle sınırlı olduğundan, EAE farelerinin patogenezi kuyruk ucundan başa doğru yayılır. Hastalığın başlangıcında, EAE fareleri kuyruğun zayıflığı ve sarkması, ardından arka bacakların zayıflığı, koordinasyonsuz hareket ve felç sergiler. Hastalık kötüleştikçe, yavaş yavaş ön ayakların zayıflığına, felce dönüşür ve ciddi vakalarda, farelerin taşınmasında ve hatta ölümün yakınında zorluklara neden olur. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, farklı derecelerde EAE patolojisine sahip farelerin durum diyagramı, asemptomatikten yüksek puanlı EAE semptomlarına (skor 4) değişen bir grup farenin örnek bir resmini göstermektedir. EAE farelerinin vücut ağırlığının klinik semptomlarla ilişkili olduğu daha önce de belirtilmiştir. WT fareleri ile karşılaştırıldığında, EAE farelerinde kilo kaybı bağışıklamadan sonraki ilk birkaç gün içinde ortaya çıkmaya başlayabilirken, EAE farelerinin klinik semptomları genellikle aşılamadan sonraki 6-9. günde başlar ve 14-16. günde zirveye ulaşır. Bundan sonra, EAE farelerinin semptomları genellikle kısmen iyileşir ve aynı zamanda farelerin kilo kaybı hafifletilir (Şekil 1B, C). Bu nedenle, EAE başlangıcının seyri genellikle erken başlangıç, pik ve remisyon dönemlerine ayrılır ve bu zaman noktalarının tahmini sonuç parametrelerinin değerlendirilmesinde önemlidir. Genel olarak, EAE lezyonlarının bulunduğu yerde bağışıklık hücrelerinin ve sitokinlerin üretimini analiz etmek için, hastalığın zirvesindeki EAE farelerinin beyin ve omuriliğindeki bağışıklık hücreleri izole edilebilir ve daha fazla işlenebilir, bu da akış sitometrisi^14,15 ile analiz edilebilir. En yüksek başlangıçtaki omurilik dokusu, omuriliğin enflamatuar hücre infiltrasyonunu ve demiyelinizasyonunu daha fazla araştırmak için hematoksilin ve eozin (H & E) boyama ve Luxol hızlı mavi boyama hazırlamak için de en uygun olanıdır^14,16. EAE'nin farklı başlangıç zamanlarında bağışıklık sistemindeki değişiklikleri izlemek için, erken başlangıçtaki dalak ve lenf düğümleri de temel seçeneklerdir^17,18. Ek olarak, MOG ile bağışıklanmış EAE farelerinin dalak veya lenf düğümlerinden gelen hücreler, EAE farelerinin pasif bağışıklanmasını indüklemek için in vitro MOG'un yeniden uyarılmasından sonra alıcı farelere aktarılan transfer modellerini oluşturmak için yaygın olarak kullanılır¹⁸.

MS, santral sinir sisteminin otoimmün inflamatuar indükleyici demiyelinizan lezyonu olup inflamatuar demiyelinasyon ve nöronal kayıp ile karakterizedir ^2,3. Bu hastalığa genellikle MS hastalarında anksiyete bozukluğunun çok yaygın olduğu duygulanım bozuklukları gibi psikiyatrik komorbiditeler eşlik eder ve MS hastalarının% 30'una kadarı anksiyeteden muzdariptir ^9,19. Anksiyete bozukluğu, aşırı duygusal stres ve endişe ile karakterize psikiyatrik bir anormalliktir. Açık alan testi genellikle kemirgenlerde anksiyete davranışlarını analiz etmek için kullanılır^20,21. EAE farelerinin erken başlangıç, pik ve remisyon dönemlerinde açık alan testlerinde keşif davranışlarının analiz edilmesinin yardımıyla, EAE farelerinin de MS hastalarınınkine benzer anksiyete benzeri davranışlara sahip olduğu bulunmuştur (Şekil 2A). Açık alan testinde, endişeli kemirgenler, köşelere daha yakın olma tercihi, periferik alana karşı bir önyargı ve merkezi alanı keşfetme arzusu eksikliği de dahil olmak üzere aktiviteyi azaltma ve stereotipik davranışı artırma eğilimindedir. WT fareleri ile karşılaştırıldığında, EAE fareleri, EAE farelerinin henüz motor bir bozukluğu olmadığı hastalığın erken başlangıcında bile, hastalığın her üç döneminde de önemli ölçüde daha düşük yürüme mesafesine ve hareket süresine sahipti (Şekil 2B, C). Ek olarak, EAE fareleri önemli ölçüde daha az mesafeden geçer ve merkezi alanda normal farelerden daha az kalır ve hatta sadece periferik alanda hareket ederek belirgin anksiyete benzeri ruh hali gösterir (Şekil 2D, E). EAE fareleri, başlangıç hafif olduğunda, yani motor koordinasyonda hala güçlü bir anksiyete benzeri ruh hali sergiler. Bazı çalışmalar bunun nörotransmitter sekresyonunu daha da etkileyen hafif nöroinflamasyona atfedilebileceğini düşündürmektedir^22,23. EAE farelerinde anksiyete benzeri ruh hali tetikleyicilerini izleyen açık alan testleri, araştırmacıların MS psikiyatrik komorbiditelerini anlamalarına ve tedavi etmelerine yardımcı olabilir.

Hastalığın ilerlemesiyle birlikte, MS esas olarak sonunda diskinezi olarak ortaya çıkar. Çalışmalar, MS hastalarının esas olarak kemik kütlesi kaybına bağlı olarak osteoporoz ve kırığa karşı daha yüksek bir duyarlılığa sahip olduğunu ve diskinezinin şiddetinin hastanın kemik yoğunluğu^24,25 ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu bulmuştur. Benzer bir olgu EAE hayvan modeli yardımıyla Mikro-BT analizi ile de gözlemlenebilir (Şekil 3A,H). Farelerde femur trabeküler analiz verilerinden, EAE fareleri, kemik kuvvetine verilen yanıtın önemli bir göstergesi ve osteoporoz tanısı için önemli bir temel olan WT farelere kıyasla kemik mineral yoğunluğunda (KMY) önemli bir azalmaya uğramıştır (Şekil 3B). Daha ileri analizler, trabeküler kemik kaybının EAE farelerde sağlıklı WT farelere kıyasla anlamlı olarak meydana geldiğini ve trabeküler bağlantı yoğunluğunda, trabeküler sayılarda ve trabeküler kalınlıkta bir azalma ile birlikte olduğunu göstermiştir. Bunların hepsi azalmış kemik kütlesinin karakteristiğidir, bu da EAE'nin farelerin femurunda trabeküler kemik kaybına neden olduğunu düşündürmektedir (Şekil 3C-F). Aynı zamanda, kemik trabeküllerinin yapısal morfolojisi değişti ve trabeküllerin aralığı önemli ölçüde arttı; aralık ne kadar büyük olursa, kemik osteoporotik olur (Şekil 3G). Bu, MS hastalarının osteoporoza yatkın olduğu düşüncesiyle tutarlıdır. Femur diyafizinin kortikal kemiklerinde, EAE modelinde kortikal kemiğin kalınlığı normal farelerdekinden anlamlı derecede daha azdı (Şekil 3I). MS'te, azalmış motilite, artmış kas distrofisi, osteoporoz, kırık ve azalmış mekanik kuvvetlere bağlı olarak artmış kemik rezorpsiyonu ile güçlü bir şekilde ilişkilidir, giderek kemik bütünlüğü azalır, böylece osteoporoz ve kırık riski artar²⁶. EAE farelerinde femur mikro-BT analizi kemik sağlığını iyi izleyebilir ve müdahale EAE'nin durumunu kontrol etmede faydalıdır.

Şekil 1: EAE'nin klinik semptomlarının izlenmesi. (A) Farklı derecelerde EAE patolojisine sahip farelerin örnek resmi. (B) WT ve EAE farelerinde ağırlık değişimi. (C) WT ve EAE farelerde klinik skor. Veriler ortalama ± SEM (n = 5), ***p < 0.001 ve WT fareleri, iki yönlü ANOVA testi olarak verilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: EAE farelerinin açık alan testinde anksiyete benzeri davranışları. (A) Açık alan testinin temsili iz grafikleri. Seyahat mesafesi (B), aktivite süresi (C), merkezdeki seyahat mesafesi (D) ve erken başlangıç, pik ve remisyon dönemlerinde WT farelerin ve EAE farelerinin merkezinde (E) geçirilen süre. Veriler ortalama ± SEM (n = 3), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 WT fareleri, Öğrencinin t-testi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: EAE farelerde kemik sağlığının mikro-BT analizi. (A) Femoral trabeküler mimarinin temsili 3D görüntüleri (ölçek çubukları, 100 μm). Femoral trabekülerin kemik mineral yoğunluğu (B), kemik hacmi/doku hacim oranı (C), bağlantı yoğunluğu (D), sayılar (E), kalınlığı (F) ve ayrılması (G) Mikro-BT analizi ile belirlendi. (H) Kortikal kemiğin temsili 3D görüntüleri (ölçek çubukları, 100 μm). (I) Mikrobilgisayarlı tomografi verilerinden elde edilen kortikal kalınlık. Veriler ortalama ± SEM (n = 3), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 WT fareleri, Öğrencinin t-testi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Klinik skorlama sistemi.

Tablo 2: MS'in farklı fare modelleri.

MS, MSS'nin demiyelinizan inflamatuar bir hastalığıdır ve gençlerde kronik sakatlığa neden olan en yaygın nörolojik bozukluklardan biridir ve ailelere ve topluma büyük bir yük getirmektedir ^3,4. MS her zaman organa özgü bir T hücresi aracılı otoimmün hastalık olarak sınıflandırılmıştır ve otoimmün sistemi CNS'yi yavaşça aşındırmaya teşvik eder, bu da vücutta birden fazla sistemi içerecektir²⁷. Tipik klinik semptomlar görme bozukluğu, motor bozukluklar, bilişsel ve duygusal bozukluklar vb. ^6,7'dir. MS, uygun şekilde tedavi edilmezse giderek kötüleşecek ve ciddi körlük ve felce yol açacak yıkıcı bir hastalıktır²⁸. MS'in patogenezi, klinik bulguları ve patolojik progresyonu heterojen olduğundan ve bu nedenle hayvan modelleri, MS tedavisinin araştırılması ve geliştirilmesi için gerekli olduğundan henüz tam olarak anlaşılamamıştır.

MS için en sık çalışılan hayvan modeli, temel olarak iki modelleme yöntemine sahip olan EAE'dir: aktif bağışıklama ve pasif bağışıklama²⁹. İlki, basitliği, fare ışınlaması eksikliği ve kısa döngü süresi nedeniyle yaygın olarak benimsenmiştir. EAE aktif immün modeli, kemirgenleri kendinden miyelin antijenleri veya sonraki peptitleri ile bağışıklayarak CNS'de otoimmün yanıtları indükler, genellikle kuyruk zayıflığı ve uzuv felci¹³ olarak kendini gösterir. Spesifik olarak, C57BL / 6J farelerde MOG 35-55 tarafından indüklenen EAE modeli, CNS iltihabı, demiyelinizasyon ve aksonal yaralanmanın eşlik ettiği alternatif remisyon-nüks döngüleri ile karakterize edilir ve bu da MOG_35-55 kaynaklı EAE'yi tercih edilen model^11,12 yapar. EAE, MOG_35-55 peptidinin deri altı enjeksiyonu ile hassaslaştırılan farelerde iyi indüklenebilir, MTB ile zenginleştirilmiş immünopotentiator CFA ile emülsifiye edilebilir ve 0-2³⁰. günlerde kan-beyin bariyeri bozucu etkiye sahip intraperitoneal PTX enjeksiyonu verilebilir. EAE modelinin önündeki en büyük zorluk, zayıf semptomların düşük insidansıdır ve çeşitli etkileyici faktörler deneyin seyri için kritik öneme sahiptir. (1) Farelerin yaşı ve çevresi, EAE'ye duyarlılığı etkileyecektir. Bu nedenle, deneyden önce aynı yaştaki farelerin seçilmesi gerekir. Kafes tahsisinden önce fareler ağırlıklandırılmalı ve rastgele gruplandırılmalı ve her grubun ağırlığı yakın tutulmalıdır. Ayrıca, bağımsız deneyler arasındaki çevresel koşulların karşılaştırılabilir olduğundan emin olun. (2) PTX konsantrasyonu: PTX'in ana rolü, patojenik T hücrelerinin ilgili sitokinleri salgılamak ve enflamatuar yanıtı teşvik etmek için CNS'ye girmesine izin veren kan-beyin bariyerinin geçirgenliğini arttırmaktır, sonuçta sinir aksonlarının dış tabakasına sarılmış miyelin proteinlerinin hidrolizine yol açar. EAE farelerde hastalığın başlangıcı, PTX uygulama konsantrasyonunun azalmasıyla gecikti ve PTX% 60'tan fazla azalırsa hastalığın şiddeti zayıflayacaktır. (3) MOG 35-55 antijeninin çözünmesi: Donmayı ve çözülmeyi önlemek için, donma ve çözülmeyi önlemek için liyofilize MOG_35-55 antijeninin ayrı paketlerde, 4 mg / tüpte tedarik edilmesi önerilir. Ayrıca, PTX steril su yerine çözünme için kullanılır, çünkü PTX kullanarak CFA ile emülsifiye etmek daha iyidir. (4) MOG_35-55 antijeni ve CFA, yağda su yapısı oluşturmak için salınım yaparak yeterince emülsifiye edilmelidir ve emülsiyon damlacıkları su yüzeyinde uzun süre dağılmaz, bu da iyi emülsifikasyonu gösterir. (5) Fare EAE modellemesi için iki noktalı enjeksiyon kullanıldı. Enjeksiyon bölgesi, farelerin cildi yalamasını ve ısırmasını önlemek için tercihen belin üstünde ve boynun altında, omurgaya yakın bir yerde bulunur ve bu da MOG_35-55 emülsiyonunun dökülmesine neden olur.

Bununla birlikte, MOG_35-55 antijeni tarafından indüklenen EAE modelinin hala bazı sınırlamaları vardır. CD4 T hücrelerinin aracılık ettiği primer aksonal hasarın inflamatuar ensefalopati modeli olarak ana lezyon, MS patolojisi^31,32,33'ten farklı olarak^, sekonder demiyelinasyon ve daha az primer demiyelinizasyon ile masif aksonal dejenerasyondur^. MOG_35-55 tarafından indüklenen EAE modeli, esas olarak CD4 T hücreleri tarafından yönlendirilen bağışıklık tepkisini yansıtırken, CD8 T ve B hücreleri gibi diğer bağışıklık hücreleri bu model^31'e güçlü bir katılım duygusuna sahip değildir. Diğer bir sınırlayıcı faktör, MOG_35-55 tarafından indüklenen EAE'nin, MS patofizyolojisinin immünolojik bileşenine karşı belirli bir önyargıya sahip olmasıdır ve Tablo 2'de açıklandığı gibi, demiyelinizasyon ve miyelin rejenerasyon süreçlerinin incelenmesi 34,35,36,37,38,39,40 gibi CNS patolojilerine odaklanan çalışmalar göz önüne alındığında diğer hayvan modelleri düşünülebilir. .

EAE, MS'in otoimmün özelliklerinin yanı sıra inflamasyon ve demiyelinasyon mekanizmasını taklit etmede etkili bir belirleyicidir¹², bu da birçok bilim adamını MS'in diğer klinik semptomlarını göz ardı ederek immünomodülatör mekanizmalarını incelemeye istekli kılar. çalışmalar, MS ile ilişkili anksiyetenin immün disregülasyon ve beyin iltihabı gibi patofizyolojik süreçlere atfedildiğini göstermiştir^{22, 23,41}. Anksiyete gibi zihinsel sağlık sorunları MS'li kişilerde özellikle yaygındır ve anksiyete bozukluğu temel günlük görevlerin yerine getirilmesini engelleyebilir ve yaşam kalitesini önemli ölçüde etkileyebilir^42,43. EAE farelerinin lokomotor yeteneğindeki değişiklikler, nöral süreçlerdeki değişiklikleri öngörebilir. Açık alan deneylerinde, EAE farelerinde, hastalığın erken başlangıcını başlatan keşif davranışlarında bir azalma da dahil olmak üzere anksiyete benzeri davranışlar meydana geldi (esasen, klinik skorları <0.5 ve lokomotor yeteneği neredeyse normal fareler kadar iyi olan test denekleri), anksiyete benzeri davranışların başlangıcının motor bozulmadan önce geldiğini düşündürmektedir. Ek olarak, remisyon döneminde EAE fareleri, artan motor yeteneği ile anksiyete benzeri davranışları iyileştirmedi. Enflamatuar yanıtın ortaya çıkması, EAE farelerinde nöronal aktivite yoluyla zihinsel bozulmadan sorumlu olabilir, bu da ruh halinde değişikliklere yol açar ve inflamatuar sitokin seviyelerinin yukarı regülasyonu, motor bozukluğun başlamasından önce striatal sinaptik fonksiyona müdahale eder^23,41. Bununla birlikte, açık alan testi, test odasının sessiz bir alan olması gerektiğine dikkat edilmesini gerektirir ve test farelerinin yeni ortamın neden olduğu aşırı basıncı önlemek için odaya 1 saat önceden alışması gerekir. Son test konusu tarafından geride bırakılan kokuları ve diğer maddeleri gidermek için testler arasında etanol ile ek temizlik gereklidir. Açık alan testinin ana sınırlaması, EAE farelerde motor disfonksiyonun neden olduğu girişimdir ve kemirgen anksiyetesi benzeri davranışı değerlendirme testi, reaksiyon odasındaki kemirgen aktivitesinin mesafesine, zamanına ve aralığına dayanır ve motor disfonksiyonun anksiyete benzeri davranış üzerindeki etkisini göz ardı edemez. Bu nedenle, gelecekteki çalışmaların lokomotor bozulmayı dikkate alması gerekir.

Kemik dokusu ile ilgili çalışmaları analiz etmek için geleneksel yöntemler genellikle iki boyutlu düzlemlerin etkisi ve biyolojik örneklerin homojensizliği nedeniyle yapısal morfolojiyi, yoğunluk dağılımını, oryantasyon dağılımını ve diğer özellikleri analiz etmede daha büyük zorluklar yaşayabilen iki boyutlu kemik kesit mikroskobu kullanır. Birçok çalışma, kemik morfolojisini tanımlamak için Mikro-BT sisteminin doğruluğunu ve etkinliğini doğrulamıştır ve birçok çalışma^44,45,46 mikroyapı tespit sonuçlarını doğrulamıştır. Kemik dokusunun Micro-CT ile üç boyutlu görüntülenmesi, daha sezgisel ve doğru kemik histomorfometri sonuçları elde edilmesini sağlar. Hayvanı çalıştırmadan veya doku örneğine zarar vermeden küçük hayvanları ve örnekleri taramak sağlanmış, doku içinde ayrıntılı üç boyutlu mekansal yapı bilgisine izin verilmiştir⁴⁴. Çalışmalar, MS hastalarının kemik kütlesi kaybına ve osteoporoza yatkın olduğunu göstermiştir^24,25; EAE farelerinin femurunu bir Mikro-BT sistemi ile tarayarak ve görüntüleyerek, EAE farelerinin femurunda, osteoporoz geliştiren WT farelerine kıyasla kemik mikromimarisinde belirgin bir bozulma ve azalmış kemik gücü gözlenebilir. Mikro-BT analizinin gerçekleştirilmesi nispeten basittir ve nispeten ucuzdur ve Mikro-BT canlı görüntüleme, EAE farelerine tedavi uygularken gelecekte kemik sağlığını izlemek için kullanılabilir. Bununla birlikte, dezavantajı, EAE farelerde kemik metabolik homeostazındaki temel değişiklikleri gözlemlemek için kan örnekleri veya kemik histomorfometrisi ile değerlendirilen kemik döngüsü belirteçlerinin bulunmamasıdır⁴⁷. Osteoblastların ve osteoklastların düzenlenmesi gelecekte çalışma içinde düşünülebilir.

MS çok semptomlu bir hastalıktır ve hastalık yönetiminin tek amacı hastalık semptomlarını en aza indirmektir. Yukarıda belirtilen protokolde, MOG_35-55 kaynaklı EAE modeli oluşturularak MS'in klinik semptomları simüle edilebilir. EAE fareleri, motor disfonksiyon ve anksiyete benzeri davranış ve osteoporozun klinik semptomlarını gösterdi. Bu protokolde açıklanan 5 puanlık puanlama sistemi, açık alan testi ve Mikro-BT analizi, EAE farelerinin patolojik semptomlarını birden fazla perspektiften izleyebilir ve EAE tedavisi için bir referans şeması sağlayabilir. Etkili hastalık modifiye edici ilaçların yokluğunda, sinerjik tedavinin potansiyel bir kombinasyonu semptomları hafifletmek ve işlevi iyileştirmek için en iyi fırsatı sağlayabilir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Yazarlar, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) ve Devlet Anahtar İlaç Araştırmaları Laboratuvarı'nın desteğini kabul etmektedir.