Bu makalede, erkek mayotik bölünmesi için değerli bir model olan abdominal cerrahi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla CENP-E'nin in vivo inhibisyonu bildirilmiştir. İmmünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu tahlillerini kullanarak, CENP-E inhibisyonunun fare spermatositlerinde kromozom yanlış hizalaması ve genom instabilitesi ile sonuçlandığını gösterdik.

Ökaryotlarda, mayoz cinsel üremede genom stabilitesi ve genetik çeşitlilik için gereklidir. Testislerdeki spermatositlerin deneysel analizleri, erkek mayotik bölünmesinde iğ montajı ve kromozom ayrışmasının araştırılması için kritik öneme sahiptir. Fare spermatositi, mekanik mayoz çalışmaları için ideal bir modeldir, ancak spermatositlerin analizi için etkili yöntemler eksiktir. Bu makalede, fare spermatositlerinde kinesin-7 CENP-E'nin in vivo inhibisyonu için pratik ve etkili bir yöntem bildirilmiştir. 3 haftalık farelerde karın ameliyatı yoluyla GSK923295 spesifik bir inhibitörün testiküler enjeksiyonu için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Ayrıca, burada doku toplama ve fiksasyon, hematoksilin-eozin boyama, immünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu için bir dizi protokol tanımlanmıştır. Burada, erkek mayozunu incelemek için güçlü bir teknik olabilecek abdominal cerrahi ve testis enjeksiyonu yoluyla in vivo inhibisyon modeli sunuyoruz. Ayrıca, CENP-E inhibisyonunun, mayoz I sırasında primer spermatositlerde kromozom yanlış hizalaması ve metafaz durması ile sonuçlandığını gösterdik. İn vivo inhibisyon yöntemimiz, mayozun mekanik çalışmalarını kolaylaştıracak, erkek germ hatlarının genetik modifikasyonları için yararlı bir yöntem olarak hizmet edecek ve gelecekteki klinik uygulamalara ışık tutacaktır.

Mayoz, ökaryotik organizmalardaki en önemli, oldukça katı, evrimsel korunmuş olaylardan biridir ve gametogenez, cinsel üreme, genom bütünlüğü ve genetik çeşitlilik için gereklidir ^1,2,3. Memelilerde, germ hücreleri, tek bir DNA replikasyonu turundan sonra mayoz I ve II olmak üzere iki ardışık hücre bölünmesine uğrar. Mitozdaki kardeş kromatitlerin aksine, kopyalanmış homolog kromozomlar mayoz I ^4,5 sırasında eşleşir ve iki yavru hücreye ayrılır. Mayoz II'de, kardeş kromatitler DNA replikasyonu olmadan haploid gametler oluşturmak için ayrılır^{ve ayrılır 6}. İş mili montaj kusurları ve kromozom yanlış ayrışması da dahil olmak üzere iki mayotik bölümden herhangi birindeki hatalar, gametlerin kaybına, kısırlığa veya anöploidi sendromlarına neden olabilir ^7,8,9.

Biriken çalışmalar, kinesin ailesi motorlarının hem mitotik hem de mayotik hücrelerde kromozom hizalaması ve ayrışması, iğ montajı, sitokinez ve hücre döngüsü ilerlemesinin düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynadığını göstermiştir^10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (Sentomer proteini E), kromozom kongresi, kromozom taşınması ve hizalanması ve mitoz 13,14,15,16,17,18'de iğ montaj kontrol noktasının düzenlenmesi için gerekli olan artı uçlu yönlendirilmiş bir kinetochore motorudur. Mayoz sırasında, spesifik inhibitör tarafından CENP-E inhibisyonu GSK923295 spermatojenik hücrelerde hücre döngüsü durması, kromozom yanlış hizalaması, iğ düzensizliği ve genom instabilitesine yol açar¹⁹. CENP-E'nin bölünen spermatositlerin sentromerlerindeki lokalizasyon paternleri ve dinamikleri, CENP-E'nin mayoz I^20,21 sırasında sentromerlerin sıralı montajı için kinetochore proteinleri ile etkileşime girdiğini göstermektedir. Oositlerde, kromozom hizalaması ve mayoz I ^13,22,23'ün tamamlanması için CENP-E gereklidir. CENP-E'nin antikorları veya morfolino enjeksiyonu, hem fare hem de Drosophila oositlerinde yanlış hizalanmış kromozomlar, anormal kinetochore oryantasyonu ve mayoz I tutuklaması ile sonuçlanır²³. CENP-E'nin mitozdaki temel rolleri ile karşılaştırıldığında, CENP-E'nin mayozdaki fonksiyonları ve mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir. CENP-E'nin kromozom kongresindeki ayrıntılı mekanizmaları ve erkek mayotik hücrelerde genom stabilitesi hala aydınlatılmamıştır.

Spermatogenez, ardışık spermatogonia proliferasyonu, mayoz ve spermiogenezi içeren karmaşık ve uzun süreli bir fizyoloji sürecidir. Bu nedenle, tüm sürecin memelilerde ve diğer türlerde in vitro olarak çoğaltılması olağanüstü zordur^24,25. Pakiten evresinden sonra spermatositlerin diferansiyasyonunu in vitro olarak indüklemek imkansızdır. Erkek mayotik bölünmeleri üzerine yapılan çalışmalar genellikle erken mayotik profaz^25,26'nın deneysel analizleri ile sınırlı kalmıştır. Kısa süreli spermatosit kültürü ^27,28 ve organ kültürü yöntemleri²⁵ dahil olmak üzere birçok teknolojik çabaya rağmen, erkek mayotik bölünmesini incelemek için çok az etkili yöntem vardır. Ayrıca, esansiyel genlerin genetik olarak silinmesi genellikle gelişimsel arrest ve embriyonik ölümcüllük ile sonuçlanır. Örneğin, CENP-E'den yoksun fare embriyoları implante edilemez ve mayozda CENP-E'nin mekanik çalışmalarında bir engel olan geçmiş implantasyon^29'u geliştiremez. Birlikte ele alındığında, erkek mayotik bölünmesini incelemek için pratik ve uygulanabilir bir sistem kurmak, mayoz araştırma alanını büyük ölçüde destekleyebilir.

Küçük hücre geçirgen inhibitörü, hücre bölünmesi ve gelişimsel süreçlerde kinesin motorlarını incelemek için güçlü bir araçtır. GSK923295 allosterik inhibitör, özellikle CENP-E motor alanına bağlanır, ADP'nin (adenosin difosfat) salınımını bloke eder ve son olarak CENP-E ile mikrotübüller arasındaki etkileşimleri stabilize eder³⁰. Bu çalışmada, karın cerrahisi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla in vivo inhibisyonlu fare modeli sunulmuştur. CENP-E inhibisyonu, primer spermatositlerin metafaz I'inde kromozomun yanlış hizalanmasına neden olur. Ayrıca, CENP-E inhibisyonu spermatositlerin mayotik arrestine ve spermatogenezin bozulmasına yol açar. Spermatositlerin analizi için bir dizi protokol tanımlanmıştır ve spermatositlerdeki mayotik iğ mikrotübüllerini, homolog kromozomları ve hücre altı organelleri gözlemlemek için uygulanabilir. İn vivo inhibisyon yöntemimiz mayotik bölünme ve spermatogenez çalışmaları için etkili bir yöntemdir.

Tüm hayvan deneyleri, Fujian Tıp Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (Protokol numarası SYXK 2016-0007). Tüm fare deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı ile ilgili kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir (NIH yayınları sayı 8023, gözden geçirilmiş 1978).

1. GSK923295 aracılı CENP-E inhibisyon fare modellerinin yapımı

1. Cerrahi aletleri 121 °C'de 30 dakika boyunca sterilize edin. Cerrahi ultra temiz tezgahı 2 saat boyunca ultraviyole-C (UVC) ile ışınlayın. Deneyler için kullanılan 3 haftalık erkek ICR (Kanser Araştırmaları Enstitüsü) farelerini tartın ve gerekli anestezik dozlarını hesaplayın.
2. İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) kombinasyonu uygulayarak fareleri uyuşturun. Fare kornea refleksi, nosiseptif refleks, solunum ve kas tonusunun bir kombinasyonu ile farelerin anestezi derinliğini kontrol edin. Farelerin derin anestezi uygulandığını onaylayın.
   NOT: Ameliyat sırasında termal destek sağlamak için hayvanı bir ısıtma yastığına yerleştirin.
3. Fare uzuvlarını bağlayın ve balmumu tepsisine sabitleyin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için fare gözlerine bir damla veteriner merhemi yerleştirin. Farenin karın kıllarını alt karın bölgesinden skrotuma deneysel bir hayvan tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin. Ameliyat bölgesini steril bir örtü ile sabitleyin.
4. Ventral karnı bir Betadine ovma ile dezenfekte edin, ardından% 75 etanol üç kez. Steril bir neşter kullanarak karın boşluğunu açın ve <5 mm'lik bir açıklık açın.
5. Cildi steril cerrahi kelepçelerle sıkıştırın ve steril bir cımbız kullanarak testisleri bulmak için epididim yağ yastığını steril diseksiyon forsepslerle çekin. Testisi stereoskop altında steril forseps ile sabitleyin ve 10 μL reodyne 30 kullanarak 10 μM'lik son konsantrasyonda seminifer tübüllere yavaşça¹⁰ μL GSK923295 enjekte edin. Kontrol grubunun yapımı için, 10 μL% 1 DMSO (dimetil sülfoksit) / PBS (fosfat tamponlu salin) çözeltisi enjekte edin.
   NOT: GSK923295 çözeltisini -80 °C'de 10 mM konsantrasyonda saklayın. 10 μM GSK923295 çözeltisini hazırlamak için 10 μM GSK923295 0,1 μL PBS çözeltisi içinde çözün.
6. Testisleri steril cerrahi forseps ile yavaşça karın boşluğuna geri itin. Peritonu ve cildi ayrı ayrı iki ila dört dikişle dikiş atarak, 0.1 mm çapındaki dikiş çizgisini kullanarak dikin.
7. Karın ameliyatından sonra hayvanın arkasına 3 x 3 mm'lik bir yeri kalıcı bir işaretleyici ile etiketleyin, fareyi tekrar besleme kafesine koyun ve yeterli yiyecek ve su ile temiz ve patojensiz bir ortam sağlayın.
8. Filtrelenmiş hava, sterilize edilmiş yiyecek ve su yoluyla ortamı steril bir durumda tutun. Sternal yatmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvana iyi bakın. Postoperatif analjezi için, 3 gün boyunca her 12 saatte bir deri altından bir doz buprenorfin (0.1 mg / kg) uygulayın. Tamamen iyileşene kadar farenin diğer hayvanların şirketine iade edilmediğinden emin olun.
   NOT: Farelere postoperatif bakım verilir ve gerektiğinde postoperatif ağrıyı azaltmak için% 0.5 lidokain kullanılarak yaraya uygun şekilde lokal anestezi verilir.

2. Hematoksilin-eozin (HE) boyama ve histopatoloji

1. Karın ameliyatından dört gün sonra, bir CO 2 odasında₂ L / dak akış hızında CO₂ ile fareleri ötenazi yapın. Servikal çıkık ile ölümü doğrulayıcı bir ötenazi yöntemi olarak doğrulayın. Skrotumu açmak ve testisleri forseps ile çıkarmak için cerrahi makas kullanın. GSK923295 enjeksiyondan 4 gün sonra fare testislerini toplayın ve 12 saat boyunca oda sıcaklığında 30 mL% 10 formaldehit çözeltisine sabitleyin.
2. Gradyan dehidrasyonu için, numuneyi 1 saat boyunca 40 mL% 70 etanol, 1 saat boyunca 40 mL% 85 etanol, 1 saat boyunca 40 mL% 95 etanol ve 1 saat boyunca 40 mL% 100 etanol olarak sırayla inkübe edin.
3. Numuneyi 40 dakika boyunca 40 mL ksilen içinde ve daha sonra 65 ° C'de 1 saat boyunca 40 mL parafin içinde inkübe edin. Dokuları gömme kutusunun altına yerleştirin. Erimiş parafini gömme kutusuna ekleyin. Dokuları 6 saat boyunca 4 ° C'de tam katılaşma için soğutun.
4. Numuneleri ultramikrotomun tutucusuna sabitleyin, numuneler ile bıçak yüzeyi arasındaki açıyı 5-10 ° C'de tutun ve dilim kalınlığını 5 μm'ye ayarlayın. 5 μm kalınlığındaki bölümleri bir ultramikrotom kullanarak hazırlayın, slaytları 40 ° C'de bir su banyosuna yayın ve bölümleri 37 ° C'de 12 saat boyunca bir slayt kurutucusunda kurutun.
5. Slaytları 40 dakika boyunca 200 mL ksilene, 6 dakika boyunca 200 mL% 100 etanolde, 2 dakika boyunca 200 mL'de% 95 etanolde, 2 dakika boyunca% 90 etanolde 200 mL'de, 2 dakika boyunca% 80 etanolde 200 mL'de ve 2 dakika boyunca% 70 etanolde 200 mL'de inkübe edin, sırasıyla.
6. Slaytları damıtılmış suda 5 dakika durulayın ve oda sıcaklığında 6 dakika boyunca Mayer'in hematoksilin çözeltisi ile lekeleyin.
   NOT: Mayer'in hematoksilin çözeltisi: 0.011 mol / L hematoksilin,% 6.7 susuz etanol, 0.646 mol / L alüminyum potasyum sülfat ve 0.003 mol / L sodyum iyodat.
7. Slaytları akan suda 5 dakika durulayın ve 2 dakika boyunca damıtılmış suyla inkübe edin.
8. Slaytları 3 s boyunca% 1 etanol hidroklorür içinde inkübe edin ve ardından 2 dakika boyunca akan suda durulayın.
9. Numuneyi 15 sn boyunca% 1 eozin ile lekeleyin ve daha sonra 5 saniye boyunca% 95 etanol, 2 dakika boyunca% 100 etanol ve 40 dakika boyunca ksilen ile inkübe edin.
10. Kızakları 15 μL nötr sakız ve 24 x 50 mm kapak kayması kullanarak kapatın.

3. İmmünofloresan ve konfokal mikroskopi

1. İmmünofloresan için fare testislerinin 5 μm kalınlığında parafin bölümlerini toplayın. Slaytları 40 dakika boyunca ksilende, 6 dakika boyunca% 100 etanolde,% 95 etanolde 2 dakikada,% 90 etanolde 2 dakika, 2 dakikada% 80 etanolde ve% 70 etanolde 2 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları damıtılmış suda 5 dakika durulayın ve slaytları 0,01 M PBS ile 5 dakika durulayın.
2. Slaytları antijen geri alma çözeltisine (0.01 M sitrat tamponu) yerleştirin ve antijen alımı için 4 dakika boyunca düdüklü tencere kullanarak yüksek basınç altında kaynatın. Slaytları doğal olarak oda sıcaklığına soğutun. Damıtılmış suyla iki kez 5 dakika ve PBS ile 5 dakika durulayın.
   NOT: 0,01 M sitrat tamponu (pH 6,0): 2,1 mmol/L sitrik asit, 11,6 mmol/L trisodyum sitrat dihidrat.
3. Slaytları 10 dakika boyunca% 0.25 TritonX-100 / PBS'nin 500 μL'sinde inkübe ederek hücreleri geçirgenleştirin. Slaytları PBS ile üç kez 5 dakika durulayın.
4. Antijen blokajı için, numuneleri 300 μL% 3 sığır serum albümini (BSA) / PBST (PBS'de% 0.1 Ara-20) ile 1 saat boyunca inkübe edin. Numuneleri 4 °C'de 16 saat boyunca% 3 BSA/PBST'de birincil antikorlarla inkübe edin. Dokuların kurumasını önlemek için slaytları nemlendirilmiş bir kutuya koyun. Slaytları 30 dakika boyunca doğal olarak oda sıcaklığına ısıtın.
5. Birincil antikoru atın ve ardından slaytları PBST'de 5 dakika boyunca üç kez durulayın. İkincil antikorları %3 BSA/PBST'de seyreltin. Numuneleri 37 ° C'de 1-2 saat boyunca ikincil antikorlarla inkübe edin. Numuneleri PBST'de beş kez 5 dakika durulayın.
6. Çekirdekleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 50 μL 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile lekeleyin. Kapak kapağını solmaya karşı montaj ortamıyla monte edin ve kapak kapağını oje ile kapatın.
7. NA 40x / 0.75 hedefi ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak slaytlardaki floresan sinyallerini gözlemleyin ve kaydedin.

4. Akış sitometrisi

1. Fare testislerini 6 cm'lik Petri kaplarında toplayın ve cerrahi makas kullanarak testisleri 1 mm³ parçaya bölün.
2. Testisleri, 37 ° C'de 10 dakika boyunca 1.5 mL santrifüj tüpünde% 1 kollajenaz kullanarak sindirin ve daha sonra spermatojenik hücreleri çökeltmek için numuneleri 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin.
3. Süpernatanı atın ve ardından 37 ° C'de 20 dakika boyunca 1 mL% 0.25 tripsin-EDTA (Etilen Diamin Tetraasetik Asit) çözeltisi ekleyin ve ardından numuneleri 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin.
4. Süpernatanı atın ve daha sonra çökeltilmiş hücreleri 1 mL% 70 soğuk etanol ile 4 ° C'de 8 saatten fazla inkübe edin.
5. Numuneleri 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin ve ardından hücre tortularını toplayın. Spermatojenik hücreleri 500 μL propidium iyodür (PI) boyama çözeltisi (50 μg / mL PI, 100 μg / mL RNaz A ve% 0.2 Triton X-100) ile 30 dakika boyunca 37 ° C'de lekeleyin.
   NOT: Hücre kümelenmelerini önlemek için santrifüj tüpünü her 5 dakikada bir hafifçe sallayın.
6. Hücre kalıntılarından kurtulmak için numuneleri 300 örgülü bir ekran kullanarak filtreleyin; Hücreleri bir akış tüpünde toplayın ve 4 ° C'de saklayın.
7. Bir akış sitometresi kullanarak 488 nm uyarma dalga boyunda floresan sinyallerini ve ışık saçılımını tespit edin. Modfit MFLT32 yazılımını kullanarak DNA içeriğini ve ışık saçılımını analiz edin.

5. İletim elektron mikroskobu

1. Keskin neşter kullanarak testisleri 1 mm 3 parçaya bölün ve ultrayapı değişikliklerini önlemek için numuneleri 0.1 M PBS (pH 7.2) içinde%³ glutaraldehit-% 1.5 paraformaldehit çözeltisi ile 4 saat boyunca 4 ° C'de hızlı bir şekilde inkübe edin. Numuneleri 0,1 M PBS ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın.
   NOT: Neşter ve makas keskin olmalı ve yapay sıkma ve çekmeden kaçınmaya çalışmalıdır. Numunelerin işlenmesi fiksasyon sıvısında yapılmalıdır.
2. Numuneleri 1,5 saat boyunca 4 °C'de %1 ozmik asit-%1,5 potasyum ferrosiyanür çözeltisine sabitleyin. Suyu filtre kağıdı ile kurutun ve numuneleri 5 dakika boyunca 0,1 M PBS ile üç kez durulayın.
3. Numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 40 mL% 50 etanol içinde dehidrate edin. Numuneleri 4 °C'de 12 saat boyunca 40 mL'lik %70 etanol doymuş uranyum asetat boyasında, 4 °C'de 10 dakika boyunca 40 mL'lik %90 etanolde, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 40 mL'lik %90 etanol-asetonda ve oda sıcaklığında üç kez 10 dakika boyunca 40 mL susuz asetonda inkübe edin.
4. Numuneleri susuz aseton-epoksi reçine 618 gömme ajanları (v / v = 1: 1) karışımında 1,5 saat boyunca inkübe edin ve daha sonra numuneleri 3 saat boyunca 35 ° C'de epoksi reçine 618 gömme maddelerine gömün.
5. Reçine polimerizasyonu için, numuneleri epoksi reçine 618 gömme maddelerinde 12 saat boyunca 35 ° C'de, 12 saat boyunca 45 ° C'de ve daha sonra 24 saat boyunca 60 ° C'de inkübe edin.
6. Numuneleri ve cam bıçağı takın ve ardından numuneler ile bıçak arasındaki mesafeleri ayarlayın. 90 nm kalınlığındaki ultra ince bölümleri ultra ince bir mikrotom kullanarak hazırlayın. Numuneleri sabit bir hızda dilimleyin ve ardından slaytları nikel bir ağ üzerine yerleştirin. Slaytları oda sıcaklığında bir Petri kabına yerleştirin.
7. Slaytları 10 dakika boyunca% 2 uranil asetat ile lekeleyin ve ardından numuneleri% 2 kurşun sitrat ile 10 dakika boyunca boyayın. Slaytları damıtılmış suyla durulayın. Slaytları oda sıcaklığında 24 saat kurutun.
8. Slaytları gözlemleyin ve bir transmisyon elektron mikroskobu kullanarak elektron görüntülerini 70-100 kV'da kaydedin.

Karın cerrahisi ve GSK923295^19'un testiküler enjeksiyonu yoluyla fare testislerinin in vivo CENP-E inhibisyon modelini başarıyla oluşturduk. Bu yöntemin temel teknik adımları Şekil 1'de gösterilmiştir. 4 gün boyunca testiküler GSK923295 enjeksiyonundan sonra, testisler daha ileri analizler için toplandı. Kontrol grubunda seminifer tübüllerdeki spermatojenik dalga düzenli ve organize idi (Şekil 2A). Bununla birlikte, GSK923295 grubunda, seminifer tübüllerde spermatojenik dalga değişmiş ve CENP-E inhibisyonundan sonra metafaz tutuklanmış primer spermatositler anlamlı olarak artmıştır (Şekil 2B-D). Önemli olarak, birkaç homolog kromozom, CENP-E inhibisyonundan sonra ekvator plakasında hizalanmamıştır (Şekil 2B-D). Ayrıca CENP-E inhibisyonu seminifer tübüllerde metafaz I spermatositlerin artmasına neden olmuştur (Şekil 2E,F,G). Birlikte ele alındığında, CENP-E inhibisyonu, mayoz I sırasında primer spermatositlerde kromozom yanlış hizalamasına neden olur, bu da CENP-E'nin mayozda spermatositlerin kromozom kongresinden ve hizalanmasından sorumlu olduğunu düşündürmektedir.

Bu sonuçları daha da doğrulamak için, seminifer tübüllerdeki spermatojenik hücreleri tespit etmek için immünofloresan testleri gerçekleştirdik. Kontrol grubunda gösterilen düzenli spermatojenik dalganın GSK923295 grupta açıkça değiştiğini ve düzensiz hale geldiğini tespit ettik (Şekil 3). Bölünen spermatositlerin mayotik mili anti-α-tübülin antikoru ile etiketlendi ve spermatositlerdeki sinaptonemal komplekslerin enine filamenti anti-sinaptonemal kompleks protein 3 (SYCP3) antikoru ile etiketlendi (Şekil 3A). Seminifer tübül başına SYCP3 pozitif hücreler CENP-E inhibisyonundan sonra azalmıştır (Şekil 3B). Bu arada, metafaz hücresi başına SYCP3 noktaları CENP-E inhibisyonundan sonra bozulmadı (Şekil 3C). Ek olarak, hücre başına SYCP3 gerilmeleri de GSK92395 gruplarında etkilenmemiştir (Şekil 3D). Çarpıcı bir şekilde, metafaz I spermatositlerdeki iğ kutuplarının mesafelerinin CENP-E inhibisyonundan sonra arttığını bulduk (Şekil 3E, F). Bu immünofloresan sonuçlar, CENP-E'nin kromozom yanlış hizalaması ve spermatogenez süreçleri için gerekli olduğunu ve bipolar iğin bakımı ve mayotik iğin organizasyonu için vazgeçilmez olduğunu göstermektedir.

Fare testislerindeki hücre popülasyonlarını araştırmak için testisleri sindirdik ve PI boyama ve akış sitometri testleri yaptık (Şekil 4). Önemli teknik prosedürler Şekil 4A-C'de gösterilmiştir. Spermatojenik hücreler, spermatogonia, primer spermatositler, sekonder spermatositler, spermatitler ve spermatozoa dahil olmak üzere çeşitli hücre popülasyonlarından oluşur. Bu spermatojenik hücrelerin DNA içerikleri Şekil 4A'da gösterilmiştir. CENP-E inhibisyonunun haploid hücrelerin kontrol grubunda %42.95 ± %1.09'dan GSK923295 grupta %38.26'ya ± %1.86'ya düşmesine neden olduğunu gösterdik (Şekil 4B-D). CENP-E inhibisyonundan sonra diploid hücrelerin ve anöploidi hücrelerin oranları anlamlı olarak etkilenmedi (Şekil 4E, F). Ayrıca tetraploid hücrelerin oranları kontrol grubunda %17.76 ± %1.52 iken GSK923295 grupta %28.88 ± %2.05'e yükselmektedir (Şekil 4G). Birlikte ele alındığında, spermatojenik hücrelerin hücre popülasyonlarının CENP-E inhibisyonundan sonra hafifçe değiştiğini görüyoruz. CENP-E inhibisyonu, haploid hücrelerin azalması ve tetraploid hücrelerin artması ile sonuçlanır, bu da CENP-E inhibisyonunun bölünen spermatositlerde metafaz durması ile ilişkili olduğunu gösterir.

Ayrıca spermatojenik hücrelerin submikroskobik yapısını transmisyon elektron mikroskobu ile gözlemledik (Şekil 5). Spermatositlerin kromatin organizasyonu, endoplazmik retikulum ve mitokondrileri Şekil 5'te gösterilmiştir. GSK923295 grubunda spermatojenik hücrelerin organizasyonunun biraz bozulduğunu bulduk (Şekil 5).

Şekil 1: Karın cerrahisi ve testis uygulaması yoluyla fare testislerinin in vivo inhibisyon modelinin oluşturulması. (A) Karın cerrahisinde kullanılan tüm cerrahi aletler. 1) diseksiyon makas, 2) iğne forseps, 3) düz forseps, 4) pincett, 5) reodin, 6) 1 mL şırınga, 7) 3 saplı ve 11 bıçaklı neşter, 8) stylolit, 9) yuvarlak dikiş iğneleri, 1/2 0.6 x 14 mm, 1/2 0.7 x 17 mm, 10) etanol çubuklar. (B) Anesteziden sonra, fareler bir balmumu tepsisinde sırtüstü pozisyonda yerleştirildi, alt karın bölgesi hazırlandı ve% 75 etanol ile dezenfekte edildi. (C) Alt karın bölgesinin ortasında <5 mm'lik bir açıklık yapıldı. (D) Epididim yağ yastığı, testislerin yerini belirlemek için steril diseksiyon forsepsleri ile çekildi. Testis 10 μL reodin kullanılarak 10 μL GSK923295 enjekte edildi. (E) Periton ve deri aynı anda iki dikişle dikildi. (F) Yara %75 etanol ile dezenfekte edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CENP-E inhibisyonu, fare spermatositlerinde mayoz I'in tutuklanması ve kromozomun yanlış hizalanması ile sonuçlandı . (A) Kontrol grubundaki spermatojenik hücrelerin HE boyanması. Oklar spermatositleri gösterir. (B) GSK923295 grubundaki spermatojenik hücrelerin HE boyaması. Testislere 4 gün boyunca 10 μM'lik son bir konsantrasyonda GSK923295 enjekte edildi. Oklar, spermatositlerde kromozomun yanlış hizalandığını gösterir. Tüm görüntüler için, ölçek çubuğu, 10 μm. (C) Seminifer tübüllerde metafaz spermatositlerin oranı. Kontrol, 13.43 ± %1.68; GSK923295 %3,94 ± 42,29 N=1308 hücre analiz edildi. Grup = 4. Öğrencinin t-testi. Hata çubukları, SEM. ***, P < 0.001 ± anlamına gelir. (D) Seminifer tübüllerin bölünen spermatositlerle oranı. Kontrol, 5.38 ± 2.64%; GSK923295 %3,87 ± 33,96 N=151 seminifer tübül analiz edildi. Grup = 4. (E) Kontrol ve GSK923295 gruplarında Histone H3 (fosfo Ser 10) ve TUBA4A'nın immünofloresan görüntüleri. TUBA4A, kırmızı; Histon H3 (fosfo Ser 10), yeşil; DAPI, mavi. Ölçek çubuğu, 10 μm. Büyütülmüş kutu yakınlaştırılır. (F) Semisifer tübüllerdeki metafaz hücrelerinin sayısının ölçülmesi. Kontrol, 11.45 ± 1.55; GSK923295, 18.91 ± 2.36. N = 11. (G,H) Kontrol grubunun (G) ve GSK923295 grubunun (H) metafaz I spermatositlerinde Histon H3 ve TUBA4A'nın floresan yoğunluklarının çizgi tarama analizleri. TUBA4A, kırmızı; Histon H3 (fosfo Ser 10), yeşil; DAPI, mavi. X ekseni göreli mesafeyi gösterir. Y ekseni floresan yoğunluklarını gösterir. Öğrencinin t-testi. Hata çubukları, ortalama ± SEM. *, P < 0,05 ; ***, P < 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: GSK923295 ile CENP-E inhibisyonu seminifer tübüllerin dağınıklığına ve spermatogenezin bozulmasına neden olmuştur . (A) Kontrol ve GSK923295 gruplarında SYCP3 ve TUBA4A'nın temsili immünofloresan görüntüleri. SYCP3, kırmızı; TUBA4A, yeşil; DAPI, mavi. Ölçek çubuğu, 10 μm. (B) Kontrol ve GSK923295 gruplarında seminifer tübüller başına SYCP3 pozitif hücreler. Kontrol, 56.00 ± %5.43; GSK923295, 39.00 ± %1.73. N = 10. (C) Metafaz hücreleri başına SYCP3 noktalarının nicelleştirilmesi. Kontrol, 10.00 ± 1.02; GSK923295, 9,71 ± 0,86, N = 7. (D) SYCP3'ün nicelikleri, kontrol ve GSK923295 gruplarındaki hücre başına uzanır. Kontrol, 8,63 ± 0,22; GSK923295, 8,21 ± 0,21. N = 19. (E) Metafaz I spermatositlerinde iğ kutuplarının mesafesinin analizi. Kontrol, 8,20 ± 0,28 μm; GSK923295, 9.30 ± 0.29 μm. N = 30. (F) Kontrol ve GSK923295 gruplarındaki seminifer tübüllerin immünofloresan görüntüleri. Oklar spermatositleri gösterir. DAPI, yeşil; β-tübülin, yeşil. Kesikli kutunun büyütülmüş görüntüleri yakınlaştırmada gösterildi. Tüm görüntüler için ölçek çubuğu, 10 μm. Öğrenci t-testi. Hata çubukları, ortalama ± SEM. ns, P > 0,05 ; **, P < 0.01. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Fare testislerinde spermatojenik hücrelerin akış sitometrisi analizi . (A) Fare spermatojenik hücrelerinin hücre döngüsü analizindeki kilit adımların şematik çizimleri. Diploid spermatositler, haploid spermatitleri oluşturmak için mayoz I ve II'ye maruz kalırlar. C değeri DNA içeriğini gösterir. N değeri (ploidi), kromozom setlerinin sayısını gösterir. (B,C) Kontrol grubundaki (B) ve GSK923295 grubundaki (C) spermatojenik hücrelerin akış sitometri analizi. İn vivo CENP-E inhibisyonu için, GSK923295 3 haftalık erkek ICR fare testislerine 4 gün boyunca 10 μM'de son bir konsantrasyonda enjekte edildi. Hücre döngüsü analizi için, n = 3.000 hücre ölçüldü ve analiz edildi. P4, haploid hücreler (1C). P5, diploid hücreler (2C). P6, tetraploid hücreler (4C). (D) Kontrol ve GSK923295 gruplarındaki haploid hücrelerin oranları. Kontrol, 42.95 ± %1.09; GSK923295 %1,86 ± 38,26. N = 8. (E) Kontrol ve GSK923295 gruplarındaki diploid hücrelerin oranları. Kontrol, 20.10 ± 0.91%; GSK923295, 17.95 ± 0.81%. N = 8. (F) Kontrol ve GSK923295 gruplarındaki anöploid hücrelerin (2C ~ 4C) oranları. Kontrol, 3.41 ± 0.23%; GSK923295, 3.39 ± 0.25%. N = 8. (G) Kontrol ve GSK923295 gruplarındaki tetraploid hücrelerin oranları. Kontrol, 17.76 ± %1.52; GSK923295, 28.88 ± %2.05. N = 8. Tüm grafikler için, Öğrenci t testi. Hata çubukları, ortalama ± SEM. ns, P > 0,05; *, P < 0.05; , P < 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kontrol ve GSK923295 grubundaki spermatojenik hücrelerin elektron mikroskobu analizi . (A) Kontrol grubundaki seminifer tübüllerin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu, 5 μm. (B) Spermatosit çekirdeğinin genişlemiş görüntüsü. Oklar, spermatositlerin homolog kromatinini gösterir. Ölçek çubuğu, 1 μm. (C) Spermatositlerin sitoplazmasının büyütülmüş görüntüsü. Ölçek çubuğu, 1 μm. (D) GSK923295 grubundaki seminifer tübüllerin temsili görüntüleri. Testisler 4 gün boyunca 10 μM GSK923295 ile tedavi edildi. Ölçek çubuğu, 5 μm. (E) GSK923295 grubundaki spermatosit çekirdeğinin genişlemiş görüntüsü. Ölçek çubuğu, 1 μm. (F) GSK923295 grubundaki spermatositlerin sitoplazmasının büyütülmüş görüntüsü. Ölçek çubuğu, 1 μm. Tüm grafikler için, sc, spermatosit; SD, spermatid. ER, endoplazmik retikulum; mt, mitokondri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada, karın cerrahisi ve GSK923295 mikroenjeksiyonu kullanılarak fare testislerinin in vivo CENP-E inhibisyon modelini oluşturduk. Bu çalışmada kullanılan abdominal cerrahi ve testis enjeksiyon yöntemi aşağıdaki avantajlara sahiptir. İlk olarak, farelerin yaşı ile sınırlı değildir. Deneyciler testis enjeksiyonunu erken bir aşamada, örneğin 3 haftalık veya daha genç farelerde gerçekleştirebilirler. İkincisi, GSK923295 CENP-E üzerinde spesifik ve mükemmel bir inhibitör etkiye sahiptir. Üçüncüsü, bu yöntemin kullanımı basittir ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Ek olarak, organlar bağlamında sağlam dokuların çalışmaları için uygun olan testislerin bütünlüğü korunur.

Bu protokolde birkaç kritik adım vardır. Örneğin, postoperatif enfeksiyonların önlenmesi için karın ameliyatı sırasında steril bir ortamın korunması önemlidir³¹. Ayrıca, farklı yaşlardaki fareler veya farklı deney hayvanları için, enjeksiyon miktarları testislerin büyüklüğüne ve ilaçların etkinliğine göre uygun şekilde ayarlanmalıdır^19,32. Ek olarak, tek hücrelerin belirlenmesi ve akış sitometrisi sırasında müteakip hücre popülasyonu testi için uygun sindirim süresi ve mikroskobik gözlem gereklidir. Ancak, bu protokollerde birkaç sınırlama vardır. Farenin yaşı 2 haftalıktan küçük olduğunda bir fare modeli oluşturmak için karın ameliyatı kullanmak zordur. Bunun başlıca nedenleri, farelerin çok genç olması, ameliyat sonrası diyetin zor olması ve hayatta kalma oranının düşük olmasıdır. Hayvan modellerinde kullanılan ilaçlar sıvıdır ve bu uygulama yönteminin uygulamaları için uygun olan 19,32,33 hücre zarlarına kolay nüfuz etme özelliklerine sahiptir.

Mayozun anlaşılması, in vitro hücre kültürü ve gen nakavt çalışmaları ile uyarılır, ancak memeli spermatositlerinde kolayca uygulanamaz²⁸. Erkek mayozunun mekanik çalışmalarının önündeki engel, mayozda bölünen spermatositlerin manipülasyonu ve gözlemlenmesi için uygun bir sistemin bulunmaması olmuştur²⁷. Fare, spermatogenez sırasında mayozun hücresel ve moleküler mekanizmalarının araştırılmasında mükemmel bir model organizmadır. Fare spermatositlerinin ilk dalgası, doğum sonrası 10. günde (dpp) mayoza başlar ve 35 dpp'de olgun spermlere dönüşür, bu da mayotik bölünme ve spermatogenez çalışmaları için gelişimsel bir zaman penceresi sağlar³⁴.

Skrotum yoluyla doğrudan enjeksiyon ve abdominal cerrahi yoluyla mikroenjeksiyon dahil olmak üzere testis enjeksiyonu, spermatogenez çalışmaları için yararlı bir tekniktir^35,36. Skrotum yoluyla doğrudan enjeksiyon hızlı ve basittir ve sadece testislerin skrotuma indiği 4 haftalık veya daha büyük fareler için uygun olan küçük bir cerrahi travmaya neden olur. Bununla birlikte, 3 haftalık veya daha genç farelerin inmemiş testislerini enjekte etmek imkansızdır. İntraperitoneal cerrahi veya skrotum cerrahisi yoluyla mikroenjeksiyon, deneysel operatörlerin, stereomikroskopun ve cerrahi ve laboratuvar ekipmanlarının yetkin cerrahi becerilerini gerektiren inmemiş testislerin enjeksiyonu için uygundur. Enjeksiyon bölgelerine göre mikroenjeksiyon seminifer tübül enjeksiyonu, testis ağı enjeksiyonu ve testis interstisyel enjeksiyonu olarak sınıflandırılabilir. Diğer enjeksiyon bazlı testis modelleriyle karşılaştırıldığında, karın cerrahisi yoluyla inhibitörlerin enjeksiyonu, proteinlerin fonksiyonlarını etkili bir şekilde inhibe edebilir ve hücre zarı penetrasyonunda, kolay prosedürlerde ve uzun süreli inhibisyonda avantajlara sahip olabilir^19,32. SiRNA'lar, antisens oligonükleotidler veya lentivirüs kullanan yöntemler, hücre zarlarının düşük penetrasyon verimliliğinde, hedef dışı yan etkilerde ve siRNA veya oligonükleotidlerin in vivo^37,38,39,40 kolay bozunmasında daha büyük sınırlamalara sahiptir.

Canlı dokulardaki mayotik bölünme, doku mimarisinin, gelişimsel sinyalizasyonun ve çevresel faktörlerin in vivo olarak dikkate alınması gereken kültür koşullarından daha karmaşıktır⁴¹. Önceki çalışmalar, kültür ortamının ve hücre özerk faktörlerinin, mayotik bölünme fazının başlangıcının uyarılması için çok önemli olduğunu göstermiştir. Örneğin, fosfataz inhibitörü okadaik asit (OA)42, spermatosit spesifik histon HIST1H1T⁴³, topoizomeraz II 44 ve metafaz teşvik faktörü (MPF)⁴⁵, kültürlü spermatositlerde G₂ / MI geçişini teşvik eder. Bu karmaşık kültür koşulları ve faktörleri, spermatositlerin kısa süreli kültürünün sınırlamalarına katkıda bulunur.

Testislere doğrudan plazmid DNA'sı enjeksiyonu, testis aracılı gen transferinde ve transgenik farelerin üretiminde başarıyla uygulanmaktadır^32,46. İn vivo elektroporasyon, seminifer tübüllerin lümenine bir DNA ekspresyon plazmidinin enjeksiyonunu içerir ve daha sonra hücre zarı geçirgenliğini değiştirmek, transgen ekspresyonunun verimliliğini artırmak ve genetik modifikasyon 45,46,47,48,49 için bir dizi elektrik darbesi kullanır. Yöntemimiz, in vivo elektroporasyonun yanı sıra floresan etiketli proteinler ve gen düzenleme araçları ile birleştirilebilir, bu da bu yaklaşımı doku ve organların fizyolojik bağlamında erkek mayotik bölünmesinin analizi için daha güçlü hale getirir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Fujian Tıp Üniversitesi Hücre İskelet Laboratuvarı'nın tüm üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknolojisi Hizmet Merkezi'nden Jun-Jin Lin'e akış sitometrisindeki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknolojisi Hizmet Merkezi Elektron Mikroskobu Laboratuvarı'nda Ming-Xia Wu ve Lin-Ying Zhou'ya elektron mikroskobundaki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Temel Tıp Bilimleri Deneysel Öğretim Merkezi'nden Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke ve Jun Song'a destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası 82001608), Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (hibe numarası 2019J05071), Fujian İl Sağlık Teknolojisi Projesi (hibe numarası 2018-1-69), Bilimsel Araştırma Başlangıç Fonu, Fujian Tıp Üniversitesi (hibe numarası 2017XQ1001), Fujian Tıp Üniversitesi üst düzey yetenekler bilimsel araştırma başlangıç fonu projesi (hibe numarası XRCZX2017025) ve Araştırma projesi Çin tıbbı lisansüstü öğrencilerinin çevrimiçi eğitim ve öğretimi (hibe numarası B-YXC20200202-06).