تشير هذه المقالة إلى تثبيط CENP-E في الجسم الحي من خلال جراحة البطن وحقن الخصية GSK923295 ، وهو نموذج قيم لانقسام الانقسام الاختزالي للذكور. باستخدام التألق المناعي وقياس التدفق الخلوي ومقايسات المجهر الإلكتروني النافذ ، نظهر أن تثبيط CENP-E يؤدي إلى اختلال الكروموسوم وعدم استقرار الجينوم في الخلايا المنوية للفئران.

في حقيقيات النوى، يعد الانقسام الميوزي ضروريا لاستقرار الجينوم والتنوع الجيني في التكاثر الجنسي. تعتبر التحليلات التجريبية للخلايا المنوية في الخصيتين حاسمة للتحقيقات في تجميع المغزل وفصل الكروموسومات في الانقسام الاختزالي الذكري. تعتبر الخلايا المنوية للفأر نموذجا مثاليا للدراسات الميكانيكية للانقسام الاختزالي ، ومع ذلك ، فإن الطرق الفعالة لتحليل الخلايا المنوية غير متوفرة. في هذه المقالة ، تم الإبلاغ عن طريقة عملية وفعالة لتثبيط kinesin-7 CENP-E في الخلايا المنوية للفئران. يتم تقديم إجراء مفصل لحقن الخصية لمثبط معين GSK923295 من خلال جراحة البطن في الفئران البالغة من العمر 3 أسابيع. علاوة على ذلك ، الموصوفة هنا هي سلسلة من البروتوكولات لجمع الأنسجة وتثبيتها ، وتلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين ، والتألق المناعي ، وقياس التدفق الخلوي ، والمجهر الإلكتروني النافذ. نقدم هنا نموذج تثبيط في الجسم الحي عن طريق جراحة البطن وحقن الخصية ، والتي يمكن أن تكون تقنية قوية لدراسة الانقسام الاختزالي عند الذكور. كما نوضح أن تثبيط CENP-E يؤدي إلى اختلال الكروموسوم وتوقف الطور الاستوائي في الخلايا المنوية الأولية أثناء الانقسام الاختزالي الأول. ستسهل طريقة التثبيط في الجسم الحي لدينا الدراسات الميكانيكية للانقسام الاختزالي ، وستكون بمثابة طريقة مفيدة للتعديلات الجينية لخطوط الجراثيم الذكرية ، وتلقي الضوء على التطبيقات السريرية المستقبلية.

الانقسام الميوزي هو أحد أهم الأحداث التطورية المحفوظة في الكائنات حقيقية النواة ، وهو ضروري لتكوين الأمشاج ، والتكاثر الجنسي ، وسلامة الجينوم ، والتنوع الجيني¹،^2،3. في الثدييات، تخضع الخلايا الجرثومية لانقسامين خلويين متتاليين، الانقسام الميوزي الأول والثاني، بعد جولة واحدة من تضاعف الحمض النووي (DNA). على عكس الكروماتيدات الشقيقة في الانقسام الميتوزي، تتزاوج الكروموسومات المتماثلة المتضاعفة وتنفصل إلى خليتين بنويتين أثناء الانقسام الميوزي^{I 4، 5}. في الانقسام الميوزي الثاني، تتفكك الكروماتيدات الشقيقة وتنفصل لتكوين جاميتات أحادية الصيغة الصبغية دون تضاعف الحمض النووي^{(DNA) 6}. يمكن أن تؤدي الأخطاء في أي من القسمين الميوزيين ، بما في ذلك عيوب تجميع المغزل وفقدان الكروموسوم ، إلى فقدان الأمشاج أو العقم أو متلازمات اختلال الصيغة الصبغية⁷،^8،9.

أظهرت الدراسات المتراكمة أن محركات عائلة كينيسين تلعب دورا مهما في تنظيم محاذاة الكروموسومات وفصلها ، وتجميع المغزل ، وتحريك الخلايا ، وتطور دورة الخلية في كل من الخلايا الانقسامية والانقسام الاختزالي^10،11،12. Kinesin-7 CENP-E (بروتين Centromere E) هو محرك كينيتوكور موجه بشكل زائد مطلوب لكونغرس الكروموسوم ، ونقل الكروموسوم ومحاذاته ، وتنظيم نقطة تفتيش تجميع المغزل في الانقسام^{الفتيلي 13}،14،15،¹⁶،^17،18. أثناء الانقسام الاختزالي ، يؤدي تثبيط CENP-E بواسطة GSK923295 مثبط معين إلى توقف دورة الخلية ، واختلال محاذاة الكروموسوم ، وعدم تنظيم المغزل ، وعدم استقرار الجينوم في الخلايا المنوية¹⁹. تشير أنماط توطين وديناميكيات CENP-E عند السنتروميرات لتقسيم الخلايا المنوية إلى أن CENP-E يتفاعل مع بروتينات kinetochore للتجميع المتسلسل للسنتروميرات أثناء الانقسام الاختزالي I^20,21. في البويضات ، يلزم CENP-E لمحاذاة الكروموسوم وإكمال الانقسام الاختزالي I¹³،^22،23. ينتج عن الأجسام المضادة أو حقن المورفولينو ل CENP-E كروموسومات منحرفة ، واتجاه حركي غير طبيعي ، وتوقف الانقسام الاختزالي الأول في كل من بويضات الفئران وذبابة الفاكهة ²³. بالمقارنة مع الأدوار الأساسية ل CENP-E في الانقسام الفتيلي ، لا تزال وظائف وآليات CENP-E في الانقسام الاختزالي غير معروفة إلى حد كبير. لا يزال يتعين توضيح الآليات التفصيلية ل CENP-E في تكوين الكروموسومات واستقرار الجينوم في الخلايا الاختزالية الذكرية.

تكوين الحيوانات المنوية هو عملية فسيولوجية معقدة وطويلة الأمد ، تتضمن تكاثر أمهات المني المتسلسل ، الانقسام الاختزالي وتكوين الحيوانات المنوية. لذلك ، من الصعب للغاية إعادة إنتاج العملية برمتها في المختبر في الثدييات والأنواع الأخرى^24,25. من المستحيل إحداث تمايز الخلايا المنوية بعد مرحلة الباكيتين في المختبر. اقتصرت الدراسات على الانقسامات الاختزالية للذكور بشكل عام على التحليلات التجريبية للطور الاختزالي المبكر^25،26. على الرغم من العديد من المساعي التكنولوجية ، بما في ذلك الثقافة قصيرة المدى للخلايا المنوية 27،²⁸ وطرق زراعة الأعضاء^{25 ،} هناك عدد قليل من الطرق الفعالة لدراسة الانقسام الاختزالي الذكري. علاوة على ذلك ، عادة ما يؤدي الحذف الجيني للجينات الأساسية إلى توقف النمو والفتك الجنيني. على سبيل المثال ، تفشل أجنة الفئران التي تفتقر إلى CENP-E في الزرع ولا يمكنها تطوير عملية زرع سابقة²⁹ ، وهو ما يمثل عقبة في الدراسات الميكانيكية ل CENP-E في الانقسام الاختزالي. مجتمعة ، يمكن أن يؤدي إنشاء نظام عملي وممكن لدراسة الانقسام الاختزالي للذكور إلى تعزيز مجال البحث في الانقسام الاختزالي بشكل كبير.

المثبط الصغير المنفذ للخلايا هو أداة قوية لدراسة محركات كينيسين في انقسام الخلايا وعمليات النمو. GSK923295 ، يرتبط مثبط الخيفي على وجه التحديد بالمجال الحركي CENP-E ، ويمنع إطلاق ADP (أدينوسين ثنائي الفوسفات) ، وأخيرا يستقر التفاعلات بين CENP-E والأنابيب الدقيقة³⁰. في هذه الدراسة ، يتم تقديم نموذج فأر تثبيط في الجسم الحي من خلال جراحة البطن وحقن الخصية من GSK923295. يؤدي تثبيط CENP-E إلى اختلال الكروموسوم في الطور الأول من الخلايا المنوية الأولية. علاوة على ذلك ، يؤدي تثبيط CENP-E إلى توقف الانقسام الاختزالي للخلايا المنوية وتعطيل تكوين الحيوانات المنوية. تم وصف سلسلة من البروتوكولات لتحليل الخلايا المنوية ويمكن تطبيقها لمراقبة الأنابيب الدقيقة المغزلية الاختزالية والكروموسومات المتماثلة والعضيات تحت الخلوية في الخلايا المنوية. طريقة تثبيط الجسم الحي لدينا هي طريقة فعالة لدراسات الانقسام الاختزالي وتكوين الحيوانات المنوية.

تمت مراجعة جميع التجارب على الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في جامعة فوجيان الطبية (رقم البروتوكول SYXK 2016-0007). تم إجراء جميع تجارب الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة لرعاية واستخدام المختبر التابعة للمعاهد الوطنية للصحة (منشورات المعاهد الوطنية للصحة رقم 8023 ، المنقحة عام 1978).

1. بناء نماذج ماوس تثبيط CENP-E بوساطة GSK923295

1. تعقيم الأدوات الجراحية على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بإشعاع طاولة العمل الجراحية فائقة النظافة بالأشعة فوق البنفسجية C (UVC) لمدة 2 ساعة. وزن ذكور الفئران ICR (معهد أبحاث السرطان) البالغة من العمر 3 أسابيع المستخدمة في التجارب وحساب جرعات التخدير المطلوبة.
2. تخدير الفئران عن طريق إعطاء مزيج من الكيتامين (100 ملغم / كغم) والزيلازين (10 ملغم / كغم) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تحقق من عمق تخدير الفئران من خلال مزيج من منعكس القرنية للفأر ، منعكس مسبب للألم ، التنفس ، وكذلك قوة العضلات. تأكد من تخدير الفئران بعمق.
   ملاحظة: ضع الحيوان على وسادة تدفئة لتوفير الدعم الحراري أثناء الجراحة.
3. اربط أطراف الماوس وثبتها على صينية الشمع. ضع قطرة من مرهم الطبيب البيطري على عيون الفأر لمنع الجفاف أثناء التخدير. حلق شعر البطن للفأر من أسفل البطن إلى كيس الصفن باستخدام ماكينة حلاقة للحيوانات التجريبية. تأمين المنطقة الجراحية مع ستارة معقمة.
4. تطهير البطن البطني مع فرك Betadine تليها 75٪ من الإيثانول ثلاث مرات. افتح تجويف البطن باستخدام مشرط معقم وقم بعمل فتحة <5 مم.
5. قم بتثبيت الجلد بمشابك جراحية معقمة واسحب وسادة الدهون البربخية باستخدام ملقط تشريح معقم لتحديد موقع الخصيتين باستخدام ملاقط معقمة. ثبت الخصية بالملقط المعقم تحت منظار مجسم ، وقم بحقن 10 ميكرولتر من GSK923295 ببطء في الأنابيب المنوية بتركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر باستخدام 10 ميكرولتر من ريودين³⁰. لبناء المجموعة الضابطة ، قم بحقن 10 ميكرولتر من محلول DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) / PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات).
   ملاحظة: قم بتخزين محلول GSK923295 بتركيز 10 مللي مول عند -80 درجة مئوية. قم بإذابة 0.1 ميكرولتر من 10 مللي مول GSK923295 في 100 ميكرولتر من محلول PBS لتحضير 10 ميكرومتر من محلول GSK923295.
6. ادفع الخصية برفق إلى تجويف البطن باستخدام ملقط جراحي معقم. خياطة الصفاق والجلد بشكل منفصل مع اثنين إلى أربعة غرز باستخدام خط خياطة بقطر 0.1 ملم.
7. قم بتسمية مكان 3 × 3 مم على ظهر الحيوان بعلامة دائمة بعد جراحة البطن ، وأعد الماوس إلى قفص التغذية وتأكد من بيئة نظيفة وخالية من مسببات الأمراض مع ما يكفي من الطعام والماء.
8. حافظ على البيئة في حالة معقمة من خلال الهواء المصفى والطعام والماء المعقمين. اعتني بالحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. في حالة التسكين بعد الجراحة، يتم تطبيق جرعة من البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ) تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة 3 أيام. تأكد من عدم إعادة الفأر إلى صحبة الحيوانات الأخرى حتى يتعافى تماما.
   ملاحظة: يتم إعطاء الفئران رعاية ما بعد الجراحة ، وإعطاء الجرح تخديرا موضعيا بشكل مناسب باستخدام 0.5٪ يدوكائين لتقليل آلام ما بعد الجراحة عند الضرورة.

2. تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (HE) وعلم أمراض الأنسجة

1. بعد أربعة أيام من جراحة البطن ، القتل الرحيم للفئران باستخدام CO 2 بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة في غرفة CO₂. تأكيد الوفاة عن طريق خلع عنق الرحم كوسيلة تأكيدية للقتل الرحيم. استخدم المقص الجراحي لفتح كيس الصفن وإزالة الخصيتين بالملقط. جمع خصيتي الماوس بعد 4 أيام من الحقن GSK923295 وإصلاحها في 30 مل من محلول الفورمالديهايد 10 ٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة.
2. للتجفيف المتدرج ، احتضان العينة بالتتابع في 40 مل من الإيثانول 70٪ لمدة 1 ساعة ، في 40 مل من الإيثانول 85٪ لمدة 1 ساعة ، في 40 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ لمدة 1 ساعة ، وفي 40 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 ساعة.
3. احتضان العينة في 40 مل من الزيلين لمدة 40 دقيقة ، ثم في 40 مل من البارافين لمدة 1 ساعة عند 65 درجة مئوية. ضع المناديل في الجزء السفلي من صندوق التضمين. أضف البارافين المذاب إلى صندوق التضمين. تبريد الأنسجة للتصلب الكامل عند 4 درجات مئوية لمدة 6 ساعات.
4. ثبت العينات على حامل ultramicrotome ، وحافظ على الزاوية بين العينات وسطح السكين عند 5-10 درجة ، واضبط سمك الشريحة على 5 ميكرومتر. قم بإعداد المقاطع التي يبلغ سمكها 5 ميكرومتر باستخدام microtome ultra ، وانشر الشرائح في حمام مائي عند 40 درجة مئوية ، وجفف الأقسام في مجفف منزلق لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية.
5. احتضان الشرائح في 200 مل من الزيلين لمدة 40 دقيقة ، في 200 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 6 دقائق ، في 200 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ لمدة دقيقتين ، في 200 مل من الإيثانول بنسبة 90٪ لمدة دقيقتين ، في 200 مل من الإيثانول بنسبة 80٪ لمدة دقيقتين ، وفي 200 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة دقيقتين ، على التوالي.
6. شطف الشرائح في الماء المقطر لمدة 5 دقائق وصمة عار مع محلول ماير الهيماتوكسيلين لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: محلول ماير للهيماتوكسيلين: 0.011 مول / لتر هيماتوكسيلين ، 6.7٪ إيثانول لا مائي ، 0.646 مول / لتر كبريتات البوتاسيوم الألومنيوم ، و 0.003 مول / لتر يودات الصوديوم.
7. شطف الشرائح في الماء الجاري لمدة 5 دقائق واحتضان بالماء المقطر لمدة 2 دقيقة.
8. احتضان الشرائح في 1 ٪ هيدروكلوريد الإيثانول لمدة 3 ثوان ، ثم شطفها في الماء الجاري لمدة 2 دقيقة.
9. قم بتلطيخ العينة بنسبة 1٪ eosin لمدة 15 ثانية ، ثم احتضانها بنسبة 95٪ إيثانول لمدة 5 ثوان ، مع 100٪ إيثانول لمدة 2 دقيقة ، وفي الزيلين لمدة 40 دقيقة.
10. أغلق الشرائح باستخدام 15 ميكرولتر من الصمغ المحايد وغطاء 24 × 50 مم.

3. التألق المناعي والمجهر متحد البؤر

1. جمع أقسام البارافين بسمك 5 ميكرومتر من خصيتي الفئران من أجل التألق المناعي. احتضان الشرائح في الزيلين لمدة 40 دقيقة ، في 100 ٪ من الإيثانول لمدة 6 دقائق ، في 95 ٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة ، في 90 ٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة ، في 80 ٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة ، وفي 70 ٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة. شطف الشرائح في الماء المقطر لمدة 5 دقائق ، وشطف الشرائح مع 0.01 M PBS لمدة 5 دقائق.
2. ضع الشرائح في محلول استرجاع المستضد (0.01 M سيترات عازلة) واغليها تحت ضغط عال باستخدام قدر ضغط لمدة 4 دقائق لاسترجاع المستضد. تبريد الشرائح بشكل طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة. شطف بالماء المقطر لمدة 5 دقائق مرتين ، ومع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: 0.01 م عازلة سيترات (درجة الحموضة 6.0): 2.1 مليمول / لتر حامض الستريك ، 11.6 مليمول / لتر ثنائي هيدرات سترات الصوديوم.
3. تتخلل الخلايا عن طريق احتضان الشرائح في 500 ميكرولتر من 0.25٪ TritonX-100 / PBS لمدة 10 دقائق. شطف الشرائح مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ثلاث مرات.
4. لحجب المستضد ، احتضان العينات ب 300 ميكرولتر من 3٪ ألبومين مصل البقر (BSA) / PBST (0.1٪ Tween-20 في PBS) لمدة 1 ساعة. احتضان العينات بالأجسام المضادة الأولية في 3٪ BSA / PBST لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية. ضع الشرائح في صندوق مرطب لمنع الأنسجة من الجفاف. أعد تسخين الشرائح بشكل طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
5. تخلص من الجسم المضاد الأساسي ، ثم اشطف الشرائح في PBST لمدة 5 دقائق ثلاث مرات. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في 3٪ BSA / PBST. احتضان العينات بأجسام مضادة ثانوية لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف العينات في PBST لمدة 5 دقائق خمس مرات.
6. قم بتلطيخ النوى ب 50 ميكرولتر من 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتركيب غطاء الغطاء باستخدام وسيط التثبيت المضاد للتلاشي ، وقم بإغلاق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر.
7. مراقبة وتسجيل إشارات الفلورسنت في الشرائح باستخدام مجهر الفلورسنت المجهز بهدف NA 40x / 0.75.

4. قياس التدفق الخلوي

1. جمع الخصيتين الماوس في أطباق بتري 6 سم وقطع الخصيتين إلى 1 مم³ قطع باستخدام مقص جراحي.
2. هضم الخصيتين باستخدام 1 مل من كولاجيناز 1٪ في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، ثم طرد العينات عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق لترسيب الخلايا المنوية.
3. تخلص من المادة الطافية ، ثم أضف 1 مل من محلول 0.25٪ trypsin-EDTA (حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ثم قم بطرد العينات عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق.
4. تخلص من المادة الطافية ، ثم احتضن الخلايا المترسبة ب 1 مل من الإيثانول البارد بنسبة 70٪ لأكثر من 8 ساعات عند 4 درجات مئوية.
5. أجهزة الطرد المركزي العينات في 1000 × غرام لمدة 5 دقائق ، ثم جمع رواسب الخلية. قم بتلطيخ الخلايا المنوية بمحلول تلطيخ 500 ميكرولتر من بروبيديوم يوديد (PI) (50 ميكروغرام / مل PI ، 100 ميكروغرام / مل RNase A و 0.2٪ Triton X-100 في PBS) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: هز أنبوب الطرد المركزي برفق كل 5 دقائق لتجنب تجمعات الخلايا.
6. تصفية العينات باستخدام شاشة شبكية 300 للتخلص من حطام الخلايا ؛ اجمع الخلايا في أنبوب تدفق وخزنها عند 4 درجات مئوية.
7. كشف إشارات التألق وتشتت الضوء عند الطول الموجي للإثارة البالغ 488 نانومتر باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تحليل محتوى الحمض النووي وتشتت الضوء باستخدام برنامج Modfit MFLT32.

5. المجهر الإلكتروني النافذ

1. قطع الخصيتين إلى 1 مم³ قطع باستخدام مشرط حاد ، واحتضان العينات بسرعة مع 3٪ غلوتارالدهيد -1.5٪ محلول بارافورمالدهيد في 0.1 M PBS (درجة الحموضة 7.2) لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية لتجنب تغييرات البنية الفائقة. شطف العينات مع 0.1 M PBS لمدة 5 دقائق ثلاث مرات.
   ملاحظة: يجب أن يكون المشرط والمقص حادين ، ومحاولة تجنب الضغط والسحب الاصطناعي. يجب أن تتم معالجة العينات في سائل التثبيت.
2. ثبت العينات في محلول حمض الأوسميك 1٪ - 1.5٪ فيروسيانيد البوتاسيوم عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة. جفف الماء بورق الترشيح واشطف العينات ب 0.1 متر PBS لمدة 5 دقائق ثلاث مرات.
3. جفف العينات في 40 مل من الإيثانول بنسبة 50٪ لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. احتضان العينات في 40 مل من صبغة أسيتات اليورانيوم المشبع بالإيثانول بنسبة 70٪ عند 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة ، في 40 مل من الإيثانول بنسبة 90٪ لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، في 40 مل من 90٪ إيثانول أسيتون لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وفي 40 مل من الأسيتون اللامائي لمدة 10 دقائق ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة.
4. احتضان العينات في مادة راتنجات الأسيتون والإيبوكسي اللامائية 618 (v / v = 1: 1) خليط لمدة 1.5 ساعة ، ثم تضمين العينات في عوامل تضمين راتنجات الايبوكسي 618 عند 35 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
5. لبلمرة الراتنج، احتضان العينات في راتنجات الايبوكسي 618 عوامل التضمين عند 35 درجة مئوية لمدة 12 ساعة، عند 45 درجة مئوية لمدة 12 ساعة، ثم عند 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
6. قم بتثبيت العينات والسكين الزجاجي ، ثم اضبط المسافات بين العينات والسكين. قم بإعداد المقاطع الرقيقة جدا بسمك 90 نانومتر باستخدام ميكروتوم رفيع للغاية. قم بتقطيع العينات بسرعة ثابتة ، ثم ضع الشرائح على شبكة من النيكل. ضع الشرائح في طبق بتري في درجة حرارة الغرفة.
7. قم بتلطيخ الشرائح بأسيتات يورانيل 2٪ لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتلطيخ العينات باستخدام سترات الرصاص 2٪ لمدة 10 دقائق. شطف الشرائح بالماء المقطر. تجفيف الشرائح لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
8. راقب الشرائح وسجل صور الإلكترون عند 70-100 كيلو فولت باستخدام مجهر إلكتروني انتقالي.

لقد نجحنا في بناء نموذج تثبيط CENP-E في الجسم الحي لخصيتي الفئران من خلال جراحة البطن وحقن الخصية في¹⁹ GSK923295. تم عرض الخطوات الفنية الرئيسية لهذه الطريقة في الشكل 1. بعد حقن الخصية من GSK923295 لمدة 4 أيام ، تم حصاد الخصيتين لمزيد من التحليلات. في المجموعة الضابطة ، كانت الموجة المنوية في الأنابيب المنوية منتظمة ومنظمة (الشكل 2 أ). ومع ذلك ، في المجموعة GSK923295 ، تم تغيير الموجة المنوية في الأنابيب المنوية ، وزادت الخلايا المنوية الأولية الموقوفة بشكل ملحوظ بعد تثبيط CENP-E (الشكل 2B-D). الأهم من ذلك ، لم يتم محاذاة العديد من الكروموسومات المتماثلة في الصفيحة الاستوائية بعد تثبيط CENP-E (الشكل 2B-D). علاوة على ذلك ، أدى تثبيط CENP-E أيضا إلى زيادة الخلايا المنوية في الطور الأول في الأنابيب المنوية (الشكل 2E ، F ، G). مجتمعة ، يؤدي تثبيط CENP-E إلى اختلال محاذاة الكروموسوم في الخلايا المنوية الأولية أثناء الانقسام الاختزالي الأول ، مما يشير إلى أن CENP-E مسؤول عن تكوين الكروموسومات ومحاذاة الخلايا المنوية في الانقسام الاختزالي.

لمزيد من التحقق من صحة هذه النتائج ، أجرينا فحوصات التألق المناعي للكشف عن الخلايا المنوية في الأنابيب المنوية. وجدنا أن الموجة المنوية المنتظمة الموضحة في المجموعة الضابطة قد تغيرت بشكل واضح وأصبحت غير منتظمة في المجموعة GSK923295 (الشكل 3). تم تمييز المغزل الاختزالي للخلايا المنوية المنقسمة بجسم مضاد للتوبولين α ، وتم تمييز الخيوط المستعرضة للمجمعات المتشابكة في الخلايا المنوية بالجسم المضاد للبروتين المركب المضاد 3 (SYCP3) (الشكل 3 أ). انخفضت الخلايا الإيجابية SYCP3 لكل نبيب منوي بعد تثبيط CENP-E (الشكل 3B). وفي الوقت نفسه ، لم يتم تعطيل نقاط SYCP3 لكل خلية طورية بعد تثبيط CENP-E (الشكل 3C). بالإضافة إلى ذلك ، لم تتأثر امتدادات SYCP3 لكل خلية في المجموعات GSK92395 (الشكل 3D). ومن اللافت للنظر أننا وجدنا أن مسافات أقطاب المغزل في الخلايا المنوية في الطور الأول قد زادت بعد تثبيط CENP-E (الشكل 3E ، F). تشير نتائج التألق المناعي هذه إلى أن CENP-E مطلوب لاختلال الكروموسوم وعمليات تكوين الحيوانات المنوية ، ولا غنى عنه للحفاظ على المغزل ثنائي القطب وتنظيم المغزل الاختزالي.

للتحقيق في مجموعات الخلايا في خصيتي الفئران ، قمنا بهضم الخصيتين وأجرينا فحوصات تلطيخ PI وقياس التدفق الخلوي (الشكل 4). تم عرض الإجراءات الفنية المهمة في الشكل 4A-C. تتكون الخلايا المنوية من عدة مجموعات من الخلايا، بما في ذلك أمهات المني، والخلايا المنوية الأولية، والخلايا المنوية الثانوية، والطلائع المنوية، والحيوانات المنوية. يوضح الشكل 4 أ محتويات الحمض النووي (DNA) لهذه الخلايا المنوية. لقد أثبتنا أن تثبيط CENP-E أدى إلى انخفاض الخلايا الفردية من 42.95 ± 1.09٪ في المجموعة الضابطة إلى 38.26 ± 1.86٪ في المجموعة GSK923295 (الشكل 4B-D). لم تتأثر نسب الخلايا ثنائية الصيغة الصبغية والخلايا اختلال الصيغة الصبغية بشكل كبير بعد تثبيط CENP-E (الشكل 4E ، F). علاوة على ذلك ، تزداد نسب الخلايا رباعية الصيغة الصبغية من 17.76 ± 1.52٪ في المجموعة الضابطة إلى 28.88 ± 2.05٪ في المجموعة GSK923295 (الشكل 4G). مجتمعة ، نجد أن مجموعات الخلايا في الخلايا المنوية تتغير قليلا بعد تثبيط CENP-E. يؤدي تثبيط CENP-E إلى انخفاض الخلايا الأحادية الصيغة الصبغية وزيادة الخلايا الرباعية الصيغة الصبغية ، مما يشير إلى أن تثبيط CENP-E يرتبط بتوقف الطور في الخلايا المنوية المنقسمة.

علاوة على ذلك ، لاحظنا التركيب تحت المجهري للخلايا المنوية باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (الشكل 5). يوضح الشكل 5 تنظيم الكروماتين، والشبكة الإندوبلازمية، والميتوكوندريا للخلايا المنوية. وجدنا أن تنظيم الخلايا المنوية قد تعطل قليلا في المجموعة GSK923295 (الشكل 5).

الشكل 1: إنشاء نموذج تثبيط في الجسم الحي لخصيتي الفئران من خلال جراحة البطن وإدارة الخصية. (أ) جميع الأدوات الجراحية المستخدمة في جراحة البطن. 1) مقص تشريح ، 2) ملقط إبرة ، 3) ملقط مستقيم ، 4) بينسيت ، 5) ريودين ، 6) حقنة 1 مل ، 7) مشرط بمقبض رقم 3 وشفرة رقم 11 ، 8) ستايلوليت ، 9) إبر خياطة مستديرة ، 1/2 0.6 × 14 مم ، 1/2 0.7 × 17 مم ، 10) مسحات الإيثانول. (ب) بعد التخدير، وضعت الفئران في وضع الاستلقاء على صينية شمعية، وتم تحضير أسفل البطن وتطهيرها بنسبة 75٪ من الإيثانول. (ج) تم عمل فتحة <5 مم في منتصف أسفل البطن. د: سحبت وسادة البربخ الدهنية بواسطة ملقط تشريح معقم لتحديد موضع الخصيتين. تم حقن الخصية ب 10 ميكرولتر GSK923295 باستخدام ريودين 10 ميكرولتر. ه: خيط الصفاق والجلد في آن واحد بغرزتين. (و) تم تطهير الجرح بنسبة 75٪ من الإيثانول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: أدى تثبيط CENP-E إلى توقف الانقسام الميوزي I واختلال محاذاة الكروموسوم في الخلايا المنوية للفئران. أ: تلطيخ الخلايا المنوية في المجموعة الضابطة. تشير الأسهم إلى الخلايا المنوية. ب: تلطيخ الخلايا المنوية في المجموعة GSK923295. تم حقن الخصيتين GSK923295 لمدة 4 أيام بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر. تشير الأسهم إلى اختلال محاذاة الكروموسوم في الخلايا المنوية. لجميع الصور، شريط المقياس، 10 ميكرومتر. ج: نسبة الخلايا المنوية الطورية في الأنيبيبات المنوية. السيطرة ، 13.43 ± 1.68 ٪ ؛ GSK923295 ، 42.29 ± 3.94٪. N = تم تحليل 1308 خلية. المجموعة = 4. اختبار t للطالب. أشرطة الخطأ ، تعني ± SEM. ** ، P < 0.001. د: نسبة الأنيبيبات المنوية المنوية المنقسمة. السيطرة ، 5.38 ± 2.64 ٪ ؛ GSK923295 ، 33.96 ± 3.87٪. N = تم تحليل 151 من الأنابيب المنوية. المجموعة = 4. (ه) صور التألق المناعي للهيستون H3 (phospho Ser 10) و TUBA4A في مجموعات التحكم و GSK923295. TUBA4A ، أحمر ؛ هيستون H3 (فوسفو سير 10) ، أخضر ؛ دابي ، الأزرق. شريط مقياس ، 10 ميكرومتر. يتم تكبير المربع الموسع. (و) تحديد عدد خلايا الطور الاستوائي في الأنيبيبات المنوية. التحكم ، 11.45 ± 1.55 ؛ GSK923295 ، 18.91 ± 2.36. ن = 11. (ز ، ح) تحليلات المسح الخطي لشدة الفلورسنت لهيستون H3 و TUBA4A في الخلايا المنوية في الطور الأول من المجموعة الضابطة (G) والمجموعة GSK923295 (H). TUBA4A ، أحمر ؛ هيستون H3 (فوسفو سير 10) ، أخضر ؛ دابي ، الأزرق. يشير المحور X إلى المسافة النسبية. يشير المحور Y إلى شدة الفلورسنت. اختبار t للطالب. أشرطة الخطأ ، تعني ± SEM. * ، P < 0.05 ؛ ***، ف < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: أدى تثبيط CENP-E بواسطة GSK923295 إلى عدم تنظيم الأنابيب المنوية وتعطيل تكوين الحيوانات المنوية . (أ) صور التألق المناعي التمثيلي ل SYCP3 و TUBA4A في المجموعتين الضابطة و GSK923295. SYCP3 ، أحمر ؛ TUBA4A ، أخضر ؛ دابي ، الأزرق. شريط مقياس ، 10 ميكرومتر. (ب) الخلايا الموجبة SYCP3 لكل أنيبيبات منوية في مجموعتي التحكم والمجموعة GSK923295. السيطرة ، 56.00 ± 5.43 ٪ ؛ GSK923295 ، 39.00 ± 1.73٪. ن = 10. ج: القياسات الكمية لنقاط SYCP3 لكل خلية طورية. التحكم ، 10.00 ± 1.02 ؛ GSK923295 ، 9.71 ± 0.86 ، ن = 7. (د) القياسات الكمية لامتدادات SYCP3 لكل خلية في مجموعتي التحكم والمجموعة GSK923295. التحكم ، 8.63 ± 0.22 ؛ GSK923295 ، 8.21 ± 0.21. ن = 19. ه: تحليل المسافة بين أقطاب المغزل في الطور الخلوي الأول. التحكم ، 8.20 ± 0.28 ميكرومتر ؛ GSK923295 ، 9.30 ± 0.29 ميكرومتر. N = 30. (و) صور التألق المناعي للأنيبيبات المنوية في مجموعتي التحكم والمجموعة GSK923295. تشير الأسهم إلى الخلايا المنوية. دابي ، أخضر ؛ β توبولين ، أخضر. تم عرض الصور المكبرة للمربع المتقطع في التكبير/التصغير. لجميع الصور ، شريط المقياس ، 10 ميكرومتر. اختبار t للطالب. أشرطة الخطأ ، تعني ± SEM. ns، P > 0.05 ؛ ** ، P < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تحليل السريان الخلوي للخلايا المنوية في خصيتي الفئران. (أ) توضيحات تخطيطية للخطوات الرئيسية في تحليل دورة الخلية للخلايا المنوية المولدة للحيوانات المنوية في الفئران. تخضع الخلايا المنوية الثنائية الصيغة الصبغية للانقسام الميوزي الأول والثاني لتكوين الطلائع المنوية الأحادية الصيغة الصبغية. تشير قيمة C إلى محتوى الحمض النووي. تشير القيمة N (الصيغة الصبغية) إلى عدد مجموعات الكروموسومات. (ب، ج) تحليل التدفق الخلوي للخلايا المنوية في المجموعة الضابطة (B) والمجموعة GSK923295 (C). بالنسبة لتثبيط CENP-E في الجسم الحي ، تم حقن GSK923295 في خصيتي الفئران ICR الذكور البالغة من العمر 3 أسابيع بتركيز نهائي عند 10 ميكرومتر لمدة 4 أيام. لتحليل دورة الخلية ، تم قياس وتحليل n = 3000 خلية. P4 ، الخلايا الأحادية الصيغة الصبغية (1C). P5 ، الخلايا ثنائية الصيغة الصبغية (2C). P6 ، الخلايا رباعية الصيغة الصبغية (4C). د: نسب الخلايا الأحادية الصيغة الصبغية في مجموعتي الشاهد والمجموعة GSK923295. السيطرة ، 42.95 ± 1.09 ٪ ؛ GSK923295 ، 38.26 ± 1.86٪. ن = 8. ه: نسب الخلايا الثنائية الصيغة الصبغية في مجموعتي التحكم ومجموعتي GSK923295. السيطرة ، 20.10 ± 0.91 ٪ ؛ GSK923295 ، 17.95 ± 0.81٪. ن = 8. (F) نسب الخلايا اختلال الصيغة الصبغية (2C ~ 4C) في المجموعة الضابطة والمجموعات GSK923295. السيطرة ، 3.41 ± 0.23 ٪ ؛ GSK923295 ، 3.39 ± 0.25٪. ن = 8. (ز) نسب الخلايا الرباعية الصيغة الصبغية في مجموعتي المجموعة الضابطة والمجموعات GSK923295. السيطرة ، 17.76 ± 1.52 ٪ ؛ GSK923295 ، 28.88 ± 2.05٪. ن = 8. بالنسبة لجميع الرسوم البيانية ، اختبار t للطالب. أشرطة الخطأ ، تعني ± SEM. ns ، P > 0.05 ؛ * ، P < 0.05 ؛ ، P < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التحليل المجهري الإلكتروني للخلايا المنوية في المجموعة الضابطة ومجموعة GSK923295. أ: صور ممثلة للأنيبيبات المنوية في المجموعة الضابطة. شريط المقياس ، 5 ميكرومتر. ب: الصورة المتضخمة لنواة الخلية المنوية. تشير الأسهم إلى الكروماتين المتماثل للخلايا المنوية. شريط المقياس ، 1 ميكرومتر. ج: الصورة المكبرة لسيتوبلازم الخلايا المنوية. شريط مقياس الرسم ، 1 ميكرومتر. د: صور تمثيلية للأنيبيبات المنوية في المجموعة GSK923295. عولجت الخصيتين ب 10 ميكرومتر GSK923295 لمدة 4 أيام. شريط المقياس، 5 ميكرومتر. ه: الصورة المتضخمة لنواة الخلية المنوية في المجموعة GSK923295. شريط المقياس ، 1 ميكرومتر. (و) الصورة المتضخمة لسيتوبلازم الخلايا المنوية في المجموعة GSK923295. شريط مقياس ، 1 ميكرومتر. لجميع الرسوم البيانية ، sc ، الخلايا المنوية. SD ، الحيوانات المنوية. ER ، الشبكة الإندوبلازمية. جبل ، الميتوكوندريا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذه الدراسة ، أنشأنا نموذج تثبيط CENP-E في الجسم الحي لخصيتي الفئران باستخدام جراحة البطن والحقن المجهري GSK923295. تتميز طريقة جراحة البطن وحقن الخصية المستخدمة في هذه الدراسة بالمزايا التالية. أولا ، لا يقتصر على عمر الفئران. يمكن للمجربين إجراء حقن الخصية في مرحلة مبكرة ، على سبيل المثال ، في الفئران البالغة من العمر 3 أسابيع أو الأصغر سنا. ثانيا ، GSK923295 له تأثير مثبط محدد وممتاز على CENP-E. ثالثا ، هذه الطريقة سهلة التشغيل وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم الحفاظ على سلامة الخصيتين ، وهو مناسب لدراسات الأنسجة السليمة في سياق الأعضاء.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. على سبيل المثال ، من المهم الحفاظ على بيئة معقمة أثناء جراحة البطن للوقاية من التهابات ما بعد الجراحة³¹. علاوة على ذلك ، بالنسبة للفئران من مختلف الأعمار أو التجارب المختلفة ، يجب تعديل كميات الحقن بشكل مناسب وفقا لحجم الخصيتين وفعالية الأدوية^19,32. بالإضافة إلى ذلك ، يلزم وقت الهضم المناسب والمراقبة المجهرية لتحديد الخلايا المفردة واختبار عدد الخلايا اللاحق أثناء قياس التدفق الخلوي. ومع ذلك ، هناك العديد من القيود في هذه البروتوكولات. من الصعب استخدام جراحة البطن لبناء نموذج الماوس عندما يكون عمر الفأر أقل من 2 أسابيع. الأسباب الرئيسية هي أن الفئران صغيرة جدا ، والنظام الغذائي بعد العملية الجراحية صعب ومعدل البقاء على قيد الحياة منخفض. الأدوية المستخدمة في النماذج الحيوانية سائلة ولها خصائص أغشية الخلايا سهلة الاختراق¹⁹،³²،^{33 ،} وهي مناسبة لتطبيقات طريقة الإدارة هذه.

يتم تحفيز فهم الانقسام الاختزالي من خلال زراعة الخلايا في المختبر ودراسات خروج المغلوب الجيني ، ومع ذلك ، فإنه لا يمكن تطبيقه بسهولة في الخلايا المنوية للثدييات²⁸. كانت العقبة أمام الدراسات الميكانيكية للانقسام الاختزالي الذكري هي عدم وجود نظام مناسب للتلاعب ومراقبة تقسيم الخلايا المنوية في الانقسام الاختزالي²⁷. الفأر هو كائن نموذجي ممتاز في البحث عن الآليات الخلوية والجزيئية للانقسام الاختزالي أثناء تكوين الحيوانات المنوية. تبدأ الموجة الأولى من الخلايا المنوية للفأر الانقسام الميوزي في اليوم 10 بعد الولادة (dpp) وتتطور إلى منوية ناضجة عند 35 dpp ، مما يوفر نافذة زمنية تنموية لدراسات الانقسام الاختزالي وتكوين الحيوانات المنوية³⁴.

حقن الخصية ، بما في ذلك الحقن المباشر من خلال كيس الصفن والحقن المجهري عن طريق جراحة البطن ، هو تقنية مفيدة لدراسات تكوين الحيوانات المنوية^35،36. الحقن المباشر من خلال كيس الصفن سريع وبسيط ، ولا يسبب سوى صدمة جراحية بسيطة ، وهي مناسبة للفئران البالغة من العمر 4 أسابيع أو أكبر مع نزول الخصيتين إلى كيس الصفن. ومع ذلك ، من المستحيل حقن الخصية المعلقة للفئران البالغة من العمر 3 أسابيع أو الأصغر سنا. الحقن المجهري من خلال الجراحة داخل الصفاق أو جراحة كيس الصفن مناسب لحقن الخصيتين المعلقتين ، الأمر الذي يتطلب مهارات جراحية بارعة من المشغلين التجريبيين ، والمجهر المجسم ، والمعدات الجراحية والمخبرية. وفقا لمواقع الحقن ، يمكن تصنيف الحقن المجهري إلى حقن النبيب المنوي وحقن شبكة الخصية والحقن الخلالي في الخصية. بالمقارنة مع نماذج الخصية الأخرى القائمة على الحقن ، فإن حقن المثبطات من خلال جراحة البطن يمكن أن يمنع بشكل فعال وظائف البروتينات وله مزايا في اختراق غشاء الخلية ، والإجراءات السهلة ، والتثبيط طويل المدى^19,32. الطرق التي تستخدم siRNAs أو oligonucleotides المضادة للحساسية أو lentivirus لها قيود أكبر في كفاءة الاختراق المنخفضة لأغشية الخلايا ، والآثار الجانبية غير المستهدفة ، والتدهور السهل ل siRNA أو oligonucleotides في الجسم الحي³⁷،^38،39،40.

الانقسام الاختزالي في الأنسجة الحية أكثر تعقيدا من ذلك في ظروف الثقافة ، حيث يجب أن تؤخذ في الاعتبار بنية الأنسجة والإشارات التنموية والعوامل البيئية في الجسم الحي ⁴¹. أظهرت الدراسات السابقة أن وسائط الثقافة والعوامل المستقلة للخلايا ضرورية لتحفيز بداية مرحلة الانقسام الاختزالي. على سبيل المثال ، مثبط الفوسفاتيز حمض الأوكاديك (OA) 42 ، الهستون الخاص بالحيوانات المنوية HIST1H1T 43 ، توبويزوميراز II⁴⁴ ، وعامل تعزيز الطور (MPF) ⁴⁵ يعزز انتقال G₂ / MI في الخلايا المنوية المستزرعة. تساهم ظروف وعوامل المزرعة المعقدة هذه في قيود زراعة الخلايا المنوية على المدى القصير.

يتم تطبيق الحقن المباشر للحمض النووي البلازميد في الخصيتين بنجاح في نقل الجينات بوساطة الخصية وإنتاج الفئران المعدلة وراثيا ^32,46. يتضمن التثقيب الكهربائي في الجسم الحي حقن بلازميد تعبير الحمض النووي في تجويف الأنابيب المنوية ، ثم استخدام سلسلة من النبضات الكهربائية لتغيير نفاذية غشاء الخلية ، وتحسين كفاءة التعبير الجيني ، والتعديل الوراثي 45،46،⁴⁷،^48،49. يمكن الجمع بين طريقتنا والتثقيب الكهربائي في الجسم الحي ، بالإضافة إلى البروتينات الموسومة بالفلورسنت وأدوات تحرير الجينات ، مما يجعل هذا النهج أكثر قوة لتحليل الانقسام الاختزالي الذكري في السياق الفسيولوجي للأنسجة والأعضاء.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

نشكر جميع أعضاء مختبر الهيكل الخلوي في جامعة فوجيان الطبية على المناقشات المفيدة. نشكر جون جين لين في مركز خدمات التكنولوجيا العامة ، جامعة فوجيان الطبية على المساعدة الفنية في قياس التدفق الخلوي. نشكر Ming-Xia Wu و Lin-Ying Zhou في مختبر المجهر الإلكتروني التابع لمركز خدمة التكنولوجيا العامة ، جامعة فوجيان الطبية للمساعدة الفنية في الفحص المجهري الإلكتروني. نشكر Si-Yi Zheng و Ying Lin و Qi Ke و Jun Song في مركز التدريس التجريبي للعلوم الطبية الأساسية في جامعة فوجيان الطبية على دعمهم. تم دعم هذه الدراسة من خلال المنح التالية: المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 82001608) ، مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة فوجيان ، الصين (رقم المنحة 2019J05071) ، مشروع التكنولوجيا الصحية بمقاطعة فوجيان (رقم المنحة 2018-1-69) ، صندوق بدء البحث العلمي ، جامعة فوجيان الطبية (رقم المنحة 2017XQ1001) ، مشروع تمويل بدء البحث العلمي للمواهب عالية المستوى بجامعة فوجيان الطبية (رقم المنحة XRCZX2017025) ومشروع البحث التعليم عبر الإنترنت وتدريس طلاب الدراسات العليا في الطب الصيني (رقم المنحة B-YXC20200202-06).