В этой статье сообщается о ингибировании CENP-E in vivo с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK923295, ценной модели для мужского мейотического деления. Используя анализы иммунофлуоресценции, проточной цитометрии и просвечивающей электронной микроскопии, мы показываем, что ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом и нестабильности генома в сперматоцитах мышей.

У эукариот мейоз необходим для стабильности генома и генетического разнообразия при половом размножении. Экспериментальный анализ сперматоцитов яичек имеет решающее значение для изучения сборки веретена и сегрегации хромосом при мейотическом делении самцов. Сперматоцит мыши является идеальной моделью для механистических исследований мейоза, однако эффективные методы анализа сперматоцитов отсутствуют. В данной статье сообщается о практическом и эффективном методе ингибирования in vivo кинезина-7 CENP-E в сперматоцитах мышей. Представлена подробная процедура инъекции специфического ингибитора в яички GSK923295 с помощью абдоминальной хирургии у 3-недельных мышей. Кроме того, здесь описан ряд протоколов для сбора и фиксации тканей, окрашивания гематоксилин-эозином, иммунофлуоресценции, проточной цитометрии и просвечивающей электронной микроскопии. Здесь мы представляем модель торможения in vivo с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек, которая может стать мощным методом изучения мужского мейоза. Мы также демонстрируем, что ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом и остановке метафазы в первичных сперматоцитах во время мейоза I. Наш метод ингибирования in vivo облегчит механистические исследования мейоза, послужит полезным методом для генетических модификаций мужских половых линий и прольет свет на будущие клинические применения.

Мейоз является одним из наиболее важных, очень жестких, эволюционно консервативных событий у эукариотических организмов и необходим для гаметогенеза, полового размножения, целостности генома и генетического разнообразия ^1,2,3. У млекопитающих половые клетки подвергаются двум последовательным клеточным делениям, мейозу I и II, после одного раунда репликации ДНК. В отличие от сестринских хроматид при митозе, дублированные гомологичные хромосомы объединяются в пары и разделяются на две дочерние клетки во время мейоза I ^4,5. При мейозе II сестринские хроматиды разрываются и разделяются, образуя гаплоидные гаметы без репликации ДНК⁶. Ошибки в любом из двух мейотических делений, включая дефекты сборки веретена и миссегрегацию хромосом, могут привести к потере гамет, синдромам бесплодия или анеуплоидии ^7,8,9.

Накопленные исследования показали, что моторы семейства кинезинов играют решающую роль в регуляции выравнивания и сегрегации хромосом, сборки веретена, цитокинеза и прогрессирования клеточного цикла как в митотических клетках, так и в мейотических клетках^10,11,12. Кинезин-7 CENP-E (центральномерный белок E) представляет собой кинетохорный двигатель, направленный на плюс-конец, необходимый для рассеивания хромосом, транспорта и выравнивания хромосом, а также для регуляции контрольной точки сборки шпинделя при митозе 13,14,15,16,17,18. Во время мейоза ингибирование CENP-E специфическим ингибитором GSK923295 приводит к остановке клеточного цикла, смещению хромосом, дезорганизации веретена и нестабильности генома в сперматогенных клетках¹⁹. Закономерности локализации и динамика CENP-E в центромерах делящихся сперматоцитов указывают на то, что CENP-E взаимодействует с белками кинетохоров для последовательной сборки центромер во время мейоза I^20,21. В ооцитах CENP-E необходим для выравнивания хромосом и завершения мейоза I^13,22,23. Инъекция антител или морфолино CENP-E приводит к смещению хромосом, аномальной ориентации кинетохора и остановке мейоза I как у мыши, так и у ооцитов дрозофилы ²³. По сравнению с существенной ролью CENP-E в митозе, функции и механизмы CENP-E в мейозе остаются в значительной степени неизвестными. Детальные механизмы CENP-E в хромосомном конгрессе и стабильности генома в мужских мейотических клетках еще предстоит выяснить.

Сперматогенез представляет собой сложный и длительный физиологический процесс, включающий последовательную пролиферацию сперматогонии, мейоз и спермиогенез. Поэтому весь этот процесс чрезвычайно трудно воспроизвести in vitro у млекопитающих и других видов^24,25. Индуцировать дифференцировку сперматоцитов после пахитеновой стадии in vitro невозможно. Исследования мужских мейотических делений, как правило, ограничивались экспериментальным анализом ранней мейотической профазы^25,26. Несмотря на многие технологические усилия, в том числе кратковременное культивирование сперматоцитов^27,28 и методы культивирования органов^25, существует мало эффективных методов изучения мужского мейотического деления. Кроме того, генетическая делеция основных генов обычно приводит к остановке развития и эмбриональной летальности. Например, эмбрионы мышей, лишенные CENP-E, не имплантируются и не могут развиваться после имплантации²⁹, что является препятствием для механистических исследований CENP-E в мейозе. Взятые вместе, создание практической и осуществимой системы для изучения мужского мейотического деления может значительно продвинуть область исследований мейоза.

Мелкоклеточный проницаемый ингибитор является мощным инструментом для изучения кинезиновых моторов в процессах деления и развития клеток. Аллостерический ингибитор GSK923295 специфически связывается с моторным доменом CENP-E, блокирует высвобождение АДФ (аденозиндифосфата) и, наконец, стабилизирует взаимодействие между CENP-E и микротрубочками³⁰. В этом исследовании модель мыши с ингибированием in vivo представлена с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK923295. Ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом в метафазе I первичных сперматоцитов. Кроме того, ингибирование CENP-E приводит к мейотической остановке сперматоцитов и нарушению сперматогенеза. Описан ряд протоколов для анализа сперматоцитов, которые могут быть применены для наблюдения микротрубочек мейотического веретена, гомологичных хромосом и субклеточных органелл в сперматоцитах. Наш метод ингибирования in vivo является эффективным методом для изучения мейотического деления и сперматогенеза.

Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинском университете Фуцзянь (номер протокола SYXK 2016-0007). Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами Ухода и использования лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения (публикации NIH No 8023, пересмотренные в 1978 году).

1. Построение GSK923295-опосредованных моделей мышей с ингибированием CENP-E

1. Стерилизуйте хирургические инструменты при температуре 121 °C в течение 30 минут. Облучайте хирургический ультрачистый верстак ультрафиолетом-C (UVC) в течение 2 ч. Взвесьте 3-недельных мышей-самцов ICR (Институт исследований рака), используемых для экспериментов, и рассчитайте необходимые дозы анестетика.
2. Анестезируют мышей, вводя комбинацию кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) посредством внутрибрюшинной инъекции. Проверьте глубину анестезии мышей с помощью комбинации мышиного рефлекса роговицы, ноцицептивного рефлекса, дыхания, а также мышечного тонуса. Убедитесь, что мыши находятся под глубоким наркозом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите животное на грелку, чтобы обеспечить тепловую поддержку во время операции.
3. Свяжите конечности мыши и закрепите их на восковом лотке. Нанесите каплю ветеринарной мази на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Сбрейте волосы на животе мыши от нижней части живота до мошонки с помощью экспериментальной бритвы животного. Закрепите операционную область стерильной простыней.
4. Продезинфицируйте брюшную полость живота скрабом бетадина, а затем трижды нанесите 75% этанола. Вскройте брюшную полость с помощью стерильного скальпеля и сделайте отверстие <5 мм.
5. Зажмите кожу стерильными хирургическими зажимами и потяните жировую подушечку придатка яичка стерильными рассекающими щипцами, чтобы найти яички с помощью стерильного пинцета. Зафиксируйте яичко стерильными щипцами под стереоскопом и медленно введите 10 мкл GSK923295 в семенные канальцы в конечной концентрации 10 мкМ, используя 10 мкл реодина³⁰. Для построения контрольной группы вводят 10 мкл 1% раствора ДМСО (диметилсульфоксида)/PBS (фосфатный буферный физиологический раствор).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните GSK923295 раствор в концентрации 10 мМ при -80 °C. Растворите 0,1 мкл 10 мМ GSK923295 в 100 мкл раствора PBS для приготовления 10 мкМ раствора GSK923295.
6. Аккуратно протолкните яичко обратно в брюшную полость стерильными хирургическими щипцами. Сшивают брюшину и кожу отдельно двумя-четырьмя швами, используя линию шва диаметром 0,1 мм.
7. Пометьте место размером 3 x 3 мм на спине животного перманентным маркером после операции на брюшной полости, поместите мышь обратно в клетку для кормления и обеспечьте чистую среду, свободную от патогенов, с достаточным количеством пищи и воды.
8. Поддерживайте окружающую среду в стерильном состоянии с помощью отфильтрованного воздуха, стерилизованных продуктов питания и воды. Ухаживайте за животным до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Для послеоперационной анальгезии вводят дозу бупренорфина (0,1 мг / кг) подкожно каждые 12 ч в течение 3 дней. Следите за тем, чтобы мышь не возвращалась в компанию других животных до полного выздоровления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышам оказывают послеоперационный уход и соответствующим образом вводят в рану местную анестезию с использованием 0,5% лидокаина, чтобы уменьшить послеоперационную боль, когда это необходимо.

2. Окрашивание гематоксилин-эозином (ГЭ) и гистопатология

1. Через четыре дня после операции на брюшной полости усыпьте мышей CO 2 со скоростью потока 2 л / мин в камере CO₂. Подтвердите смерть от вывиха шейки матки в качестве подтверждающего метода эвтаназии. С помощью хирургических ножниц вскройте мошонку и удалите яички щипцами. Собирают семенники мыши через 4 дня после GSK923295 инъекции и фиксируют их в 30 мл 10% раствора формальдегида при комнатной температуре в течение 12 ч.
2. Для градиентной дегидратации последовательно инкубируют пробу в 40 мл 70% этанола в течение 1 ч, в 40 мл 85% этанола в течение 1 ч, в 40 мл 95% этанола в течение 1 ч и в 40 мл 100% этанола в течение 1 ч.
3. Инкубируют образец в 40 мл ксилола в течение 40 мин, а затем в 40 мл парафина в течение 1 ч при 65 °C. Поместите салфетки на дно встраиваемой коробки. Добавьте расплавленный парафин в коробку для встраивания. Охладите салфетки до полного застывания при 4 °C в течение 6 часов.
4. Закрепите образцы на держателе ультрамикротома, держите угол между образцами и поверхностью ножа 5-10° и отрегулируйте толщину среза до 5 мкм. Подготовьте срезы толщиной 5 мкм с помощью ультрамикротома, распределите предметные стекла на водяной бане при 40 ° C и высушите срезы в сушилке для горок в течение 12 часов при 37 ° C.
5. Инкубировать предметные стекла в 200 мл ксилола в течение 40 мин, в 200 мл 100% этанола в течение 6 мин, в 200 мл 95% этанола в течение 2 мин, в 200 мл 90% этанола в течение 2 мин, в 200 мл 80% этанола в течение 2 мин и в 200 мл 70% этанола в течение 2 мин, соответственно.
6. Промойте предметные стекла в дистиллированной воде в течение 5 мин и окрашивайте их раствором гематоксилина Майера в течение 6 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор гематоксилина Майера: 0,011 моль/л гематоксилина, 6,7% безводного этанола, 0,646 моль/л сульфата калия алюминия и 0,003 моль/л йодата натрия.
7. Промойте предметные стекла в проточной воде в течение 5 мин и инкубируйте с дистиллированной водой в течение 2 мин.
8. Инкубируют предметные стекла в 1% этанолом гидрохлориде в течение 3 с, а затем промывают их в проточной воде в течение 2 мин.
9. Окрашивают образцы 1% эозином в течение 15 с, а затем инкубируют их с 95% этанолом в течение 5 с, со 100% этанолом в течение 2 мин и в ксилоле в течение 40 мин.
10. Запечатайте предметные стекла с помощью 15 мкл нейтральной жевательной резинки и покровного стекла размером 24 x 50 мм.

3. Иммунофлуоресценция и конфокальная микроскопия

1. Соберите парафиновые срезы яичек мыши толщиной 5 мкм для иммунофлуоресценции. Инкубируют предметные стекла в ксилоле в течение 40 мин, в 100% этаноле в течение 6 мин, в 95% этаноле в течение 2 мин, в 90% этаноле в течение 2 мин, в 80% этаноле в течение 2 мин и в 70% этаноле в течение 2 мин. Промойте предметные стекла в дистиллированной воде в течение 5 минут и промойте предметные стекла 0,01 М PBS в течение 5 минут.
2. Поместите предметные стекла в раствор для извлечения антигена (0,01 М цитратный буфер) и кипятите под высоким давлением в скороварке в течение 4 мин для извлечения антигена. Охладите предметные стекла естественным путем до комнатной температуры. Смойте дистиллированной водой в течение 5 минут дважды, а PBS - в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 0,01 М цитратный буфер (рН 6,0): 2,1 ммоль / л лимонной кислоты, 11,6 ммоль / л дигидрата цитрата тринатрия.
3. Проникают в клетки путем инкубации предметных стекол в 500 мкл 0,25% TritonX-100/PBS в течение 10 мин. Промойте предметные стекла PBS в течение 5 минут три раза.
4. Для блокирования антигена инкубируют образцы с 300 мкл 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA)/PBST (0,1% Tween-20 в PBS) в течение 1 часа. Инкубируют образцы с первичными антителами в 3% BSA/PBST в течение 16 ч при 4 °C. Положите предметные стекла в увлажненную коробку, чтобы предотвратить высыхание тканей. Разогрейте горки естественным путем до комнатной температуры в течение 30 минут.
5. Выбросьте первичные антитела, а затем промойте предметные стекла в PBST в течение 5 мин три раза. Разбавляют вторичные антитела в 3% BSA/PBST. Инкубируют образцы со вторичными антителами в течение 1-2 ч при 37 °C. Промойте образцы в PBST в течение 5 минут пять раз.
6. Окрашивают ядра 50 мкл 4', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин при комнатной температуре. Установите покровное стекло с помощью монтажного носителя с защитой от выцветания и запечатайте покровное стекло лаком для ногтей.
7. Наблюдайте и записывайте флуоресцентные сигналы на предметных стеклах с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом NA 40x/0,75.

4. Проточная цитометрия

1. Соберите семенники мыши в чашки Петри диаметром 6 см и разрежьте семенники на^{1 мм 3} части с помощью хирургических ножниц.
2. Переваривают яички, используя 1 мл 1% коллагеназы в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл в течение 10 мин при 37 ° C, а затем центрифугируют образцы при 1000 x g в течение 5 мин, чтобы осаждать сперматогенные клетки.
3. Выбросьте надосадочную жидкость, а затем добавьте 1 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в течение 20 мин при 37 ° C, а затем центрифугируйте образцы при 1,000 x g в течение 5 мин.
4. Выбросьте надосадочную жидкость, а затем инкубируйте осажденные клетки с 1 мл 70% холодного этанола в течение более 8 ч при 4 ° C.
5. Центрифугируют образцы при 1000 x g в течение 5 мин, а затем собирают клеточные осадки. Окрашивают сперматогенные клетки окрашивающим раствором 500 мкл йодида пропидия (PI) (50 мкг/мл PI, 100 мкг/мл РНКазы A и 0,2% Triton X-100 в PBS) при 37 °C в течение 30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно встряхивайте центрифужную пробирку каждые 5 минут, чтобы избежать скопления клеток.
6. Отфильтруйте образцы с помощью сетки 300 меш, чтобы избавиться от клеточного мусора; соберите клетки в проточную трубку и храните их при температуре 4 °C.
7. Обнаружение сигналов флуоресценции и рассеяния света на длине волны возбуждения 488 нм с помощью проточного цитометра. Проанализируйте содержание ДНК и рассеяние света с помощью программного обеспечения Modfit MFLT32.

5. Просвечивающая электронная микроскопия

1. Разрежьте семенники на 1 мм 3 части с помощью острого скальпеля и быстро инкубируйте образцы с³ % глутаровым альдегидом и 1,5% раствором параформальдегида в 0,1 М PBS (pH 7,2) в течение 4 ч при 4 °C, чтобы избежать изменений ультраструктуры. Промойте образцы 0,1 М PBS в течение 5 минут три раза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скальпель и ножницы должны быть острыми, и старайтесь избегать искусственного сдавливания и вытягивания. Обработку образцов следует проводить в фиксирующей жидкости.
2. Зафиксируйте образцы в 1% растворе осмической кислоты-1,5% ферроцианида калия при 4 °С в течение 1,5 ч. Вытрите воду фильтровальной бумагой и промойте образцы 0,1 М PBS в течение 5 мин три раза.
3. Обезвоживают образцы в 40 мл 50% этанола в течение 10 мин при 4 °C. Инкубируют образцы в 40 мл 70% этанола, насыщенного ацетатным красителем урана, при 4 °C в течение 12 ч, в 40 мл 90% этанола в течение 10 мин при 4 °C, в 40 мл 90% этанола-ацетона в течение 10 мин при комнатной температуре и в 40 мл безводного ацетона в течение 10 мин три раза при комнатной температуре.
4. Инкубируют образцы в безводной смеси закладочных агентов ацетон-эпоксидной смолы 618 (v/v=1:1) в течение 1,5 ч, а затем заделывают образцы в добавочные агенты эпоксидной смолы 618 при 35 °C в течение 3 ч.
5. Для полимеризации смолы образцы инкубируют в добавочных агентах эпоксидной смолы 618 при 35 °C в течение 12 часов, при 45 °C в течение 12 часов, а затем при 60 °C в течение 24 часов.
6. Установите образцы и стеклянный нож, а затем отрегулируйте расстояния между образцами и ножом. Подготовьте ультратонкие срезы толщиной 90 нм с помощью ультратонкого микротома. Нарежьте образцы с постоянной скоростью, а затем поместите предметные стекла на никелевую сетку. Поместите предметные стекла в чашку Петри комнатной температуры.
7. Окрашивают предметные стекла 2% уранилацетатом в течение 10 мин, а затем окрашивают образцы 2% цитратом свинца в течение 10 мин. Промойте предметные стекла дистиллированной водой. Сушите предметные стекла в течение 24 ч при комнатной температуре.
8. Наблюдайте за предметными стеклами и записывайте электронные изображения при напряжении 70-100 кВ с помощью просвечивающего электронного микроскопа.

Мы успешно построили in vivo модель ингибирования CENP-E яичек мыши с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK923295¹⁹. Основные технические этапы этого метода были показаны на рисунке 1. После инъекции яичек GSK923295 в течение 4 дней яички были собраны для дальнейшего анализа. В контрольной группе сперматогенная волна в семенных канальцах была регулярной и организованной (рис. 2А). Однако в GSK923295 группе сперматогенная волна была изменена в семенных канальцах, а метафаза задержанных первичных сперматоцитов была значительно увеличена после ингибирования CENP-E (рис. 2B-D). Важно отметить, что несколько гомологичных хромосом не были выровнены на экваториальной пластине после ингибирования CENP-E (рис. 2B-D). Кроме того, ингибирование CENP-E также привело к увеличению метафазных сперматоцитов I в семенных канальцах (рис. 2E, F, G). Взятые вместе, ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом в первичных сперматоцитах во время мейоза I, что говорит о том, что CENP-E отвечает за конгресс хромосом и выравнивание сперматоцитов в мейозе.

Для дальнейшей проверки этих результатов мы провели иммунофлуоресцентные анализы для обнаружения сперматогенных клеток в семенных канальцах. Мы обнаружили, что регулярная сперматогенная волна, показанная в контрольной группе, была явно изменена и стала нерегулярной в GSK923295 группе (рис. 3). Мейотическое веретено делящихся сперматоцитов было помечено антителом против α-тубулина, а поперечная нить синаптонемных комплексов в сперматоцитах была помечена антителом к антисинаптонемному комплексу белка 3 (SYCP3) (рис. 3А). Количество SYCP3-положительных клеток на семенных канальцах уменьшилось после ингибирования CENP-E (рис. 3B). Между тем, точки SYCP3 на метафазную ячейку не были нарушены после ингибирования CENP-E (рис. 3C). Кроме того, растяжки SYCP3 на клетку также не были затронуты в GSK92395 группах (рис. 3D). Поразительно, но мы обнаружили, что расстояния между полюсами веретена в метафазных сперматоцитах I были увеличены после ингибирования CENP-E (рис. 3E, F). Эти иммунофлуоресцентные результаты свидетельствуют о том, что CENP-E необходим для смещения хромосом и процессов сперматогенеза, а также необходим для поддержания биполярного веретена и организации мейотического веретена.

Чтобы исследовать клеточные популяции в яичках мышей, мы переварили яички и провели окрашивание PI и анализы проточной цитометрии (рис. 4). Важные технические процедуры были показаны на рисунке 4A-C. Сперматогенные клетки состоят из нескольких клеточных популяций, включая сперматогонии, первичные сперматоциты, вторичные сперматоциты, сперматиды и сперматозоиды. Содержание ДНК этих сперматогенных клеток показано на рисунке 4А. Мы продемонстрировали, что ингибирование CENP-E привело к уменьшению гаплоидных клеток с 42,95 ± 1,09% в контрольной группе до 38,26 ± 1,86% в группе GSK923295 (рис. 4B-D). Соотношения диплоидных клеток и клеток анеуплоидии не подвергались значительному влиянию после ингибирования CENP-E (рис. 4E, F). Кроме того, соотношение тетраплоидных клеток увеличивается с 17,76 ± 1,52% в контрольной группе до 28,88 ± 2,05% в GSK923295 группе (рис. 4G). Взятые вместе, мы обнаруживаем, что клеточные популяции сперматогенных клеток немного изменяются после ингибирования CENP-E. Ингибирование CENP-E приводит к уменьшению гаплоидных клеток и увеличению тетраплоидных клеток, что указывает на то, что ингибирование CENP-E связано с остановкой метафазы в делящихся сперматоцитах.

Кроме того, мы наблюдали субмикроскопическую структуру сперматогенных клеток с помощью просвечивающей электронной микроскопии (рис. 5). Организация хроматина, эндоплазматический ретикулум и митохондрии сперматоцитов показаны на рисунке 5. Мы обнаружили, что организация сперматогенных клеток была незначительно нарушена в GSK923295 группе (рис. 5).

Рисунок 1: Создание модели ингибирования яичек мыши in vivo с помощью абдоминальной хирургии и введения яичек. (A) Все хирургические инструменты, используемые в абдоминальной хирургии. 1) рассекающие ножницы, 2) игольчатые щипцы, 3) прямые щипцы, 4) пинцетт, 5) реодин, 6) шприц объемом 1 мл, 7) скальпель с ручкой No 3 и лезвием No 11, 8) стилолит, 9) иглы для круглого сшивания, 1/2 0,6 х 14 мм, 1/2 0,7 х 17 мм, 10) тампоны этанола. (Б) После анестезии мышей помещали в положение лежа на спине на восковом лотке, подготавливали нижнюю часть живота и дезинфицировали 75% этанолом. (C) Отверстие диаметром <5 мм было сделано в середине нижней части живота. (D) Жировую подушку придатка яичка вытягивали стерильными рассекающими щипцами, чтобы найти яички. В яичко вводили 10 мкл GSK923295 с использованием реодина объемом 10 мкл. (E) Брюшина и кожа были одновременно зашиты двумя швами. (F) Рану дезинфицировали 75% этанолом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Ингибирование CENP-E привело к остановке мейоза I и смещению хромосом в сперматоцитах мыши. (A) HE окрашивание сперматогенных клеток в контрольной группе. Стрелками обозначены сперматоциты. (B) HE окрашивание сперматогенных клеток в GSK923295 группе. В яички вводили GSK923295 в течение 4 дней в конечной концентрации 10 мкМ. Стрелки указывают на смещение хромосом в сперматоцитах. Для всех изображений масштабная линейка, 10 мкм. (C) Соотношение метафазных сперматоцитов в семенных канальцах. контроль, 13,43 ± 1,68%; GSK923295, 42,29 ± 3,94%. Было проанализировано N = 1308 клеток. Группа = 4. t-критерий Стьюдента. Полосы погрешностей, средние значения ± SEM. ***, P < 0,001. (D) Соотношение семенных канальцев с делящимися сперматоцитами. Контроль, 5,38 ± 2,64%; GSK923295, 33,96 ± 3,87%. Проанализировано N = 151 семенных канальцев. Группа = 4. (E) Иммунофлуоресцентные изображения гистона H3 (фосфо Ser 10) и TUBA4A в контрольной и GSK923295 группах. TUBA4A, красный; Гистон H3 (фосфо Ser 10), зеленый; DAPI, синий. Масштабная линейка, 10 мкм. Увеличенное поле увеличивается. (F) Количественная оценка количества метафазных клеток в семенных канальцах. контрольный, 11.45 ± 1.55; GSK923295, 18.91 ± 2.36. N = 11. (Г,Г) Линейный анализ интенсивности флуоресцентных интенсификаций гистонов H3 и TUBA4A в метафазных I сперматоцитах контрольной группы (G) и GSK923295 группы (H). TUBA4A, красный; Гистон H3 (фосфо Ser 10), зеленый; DAPI, синий. Ось X указывает относительное расстояние. Ось Y указывает на интенсивность флуоресценции. t-критерий Стьюдента. Погрешность баров, средняя ± SEM. *, P < 0,05; ***, P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Ингибирование CENP-E GSK923295 привело к дезорганизации семенных канальцев и нарушению сперматогенеза. (A) Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения SYCP3 и TUBA4A в контрольной и GSK923295 группах. SYCP3, красный; TUBA4A, зеленый; DAPI, синий. Масштабная линейка, 10 мкм. (B) SYCP3-положительные клетки на семенные канальцы в контрольной и GSK923295 группах. Контроль, 56,00 ± 5,43%; GSK923295, 39,00 ± 1,73%. N = 10. (C) Количественная оценка точек SYCP3 на метафазные ячейки. Контрольная, 10.00 ± 1.02; GSK923295, 9,71 ± 0,86, N = 7. (D) Количественные определения растяжений SYCP3 на клетку в контрольной и GSK923295 группах. контроль, 8,63 ± 0,22; GSK923295, 8.21 ± 0.21. N = 19. (E) Анализ расстояния между полюсами веретена в метафазных сперматоцитах I. Контроль, 8,20 ± 0,28 мкм; GSK923295, 9,30 ± 0,29 мкм. N = 30. (F) Иммунофлуоресцентные изображения семенных канальцев в контрольной и GSK923295 группах. Стрелками обозначены сперматоциты. DAPI, зеленый; β-тубулин, зеленый. Увеличенные изображения пунктирной рамки были показаны в увеличенном масштабе. Для всех изображений масштабная линейка, 10 мкм. t-критерий Стьюдента. Погрешность баров, средняя ± СЭМ. нс, P > 0,05; **, P < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Проточный цитометрический анализ сперматогенных клеток в яичках мышей . (A) Схематические иллюстрации ключевых этапов анализа клеточного цикла сперматогенных клеток мыши. Диплоидные сперматоциты подвергаются мейозу I и II с образованием гаплоидных сперматид. Значение C указывает на содержание ДНК. Значение N (плоидность) указывает на количество наборов хромосом. (В,В) Проточный цитометрический анализ сперматогенных клеток контрольной группы (В) и GSK923295 группы (С). Для ингибирования CENP-E in vivo GSK923295 вводили в яички мышей ICR 3-недельного возраста в конечной концентрации при 10 мкМ в течение 4 дней. Для анализа клеточного цикла было измерено и проанализировано n = 3000 клеток. P4, гаплоидные клетки (1С). P5, диплоидные клетки (2C). P6, тетраплоидные клетки (4C). (D) Соотношение гаплоидных клеток в контрольной и GSK923295 группах. контроль, 42,95 ± 1,09%; GSK923295, 38,26 ± 1,86%. N = 8. (E) Соотношение диплоидных клеток в контрольной и GSK923295 группах. контроль, 20,10 ± 0,91%; GSK923295, 17,95 ± 0,81%. N = 8. (F) Соотношение анеуплоидных клеток (2C ~ 4C) в контрольной и GSK923295 группах. контроль, 3,41 ± 0,23%; GSK923295, 3,39 ± 0,25%. N = 8. (G) Соотношение тетраплоидных клеток в контрольной и GSK923295 группах. Контроль, 17,76 ± 1,52%; GSK923295, 28,88 ± 2,05%. N = 8. Для всех графиков t-критерий Стьюдента. Погрешность баров, средняя ± SEM. нс, P > 0,05; *, P < 0,05; , P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Электронный микроскопический анализ сперматогенных клеток в контрольной и GSK923295 группе . (A) Репрезентативные изображения семенных канальцев в контрольной группе. Масштабная линейка, 5 мкм. (B) Увеличенное изображение ядра сперматоцита. Стрелками обозначен гомологичный хроматин сперматоцитов. Масштабная линейка, 1 мкм. (C) Увеличенное изображение цитоплазмы сперматоцитов. Масштабная линейка, 1 мкм. (D) Репрезентативные изображения семенных канальцев в GSK923295 группе. Яички обрабатывали 10 мкМ GSK923295 в течение 4 дней. Масштабная линейка, 5 мкм. (E) Увеличенное изображение ядра сперматоцита в GSK923295 группе. Масштабная линейка, 1 мкм. (F) Увеличенное изображение цитоплазмы сперматоцитов в GSK923295 группе. Масштабная линейка, 1 мкм. Для всех графов, ск, сперматоцитов; SD, сперматиды. ЭР, эндоплазматический ретикулум; МТ, митохондрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В этом исследовании мы создали модель ингибирования CENP-E in vivo яичек мыши с использованием абдоминальной хирургии и микроинъекции GSK923295. Абдоминальная хирургия и метод инъекций яичек, используемые в этом исследовании, имеют следующие преимущества. Во-первых, он не ограничивается возрастом мышей. Экспериментаторы могут выполнять инъекцию яичек на ранней стадии, например, у 3-недельных или более молодых мышей. Во-вторых, GSK923295 оказывает специфическое и превосходное ингибирующее действие на CENP-E. В-третьих, этот метод прост в эксплуатации и легко воспроизводим. Кроме того, сохраняется целостность яичек, что подходит для исследований неповрежденных тканей в разрезе органов.

В этом протоколе есть несколько важных шагов. Например, важно поддерживать стерильную среду во время абдоминальной хирургии для профилактики послеоперационных инфекций³¹. Кроме того, для мышей разного возраста или разных экспериментальных животных количество инъекций должно быть соответствующим образом скорректировано в соответствии с размером яичек и эффективностью лекарств^19,32. Кроме того, правильное время переваривания и микроскопическое наблюдение необходимы для определения отдельных клеток и последующего тестирования клеточной популяции во время проточной цитометрии. Однако в этих протоколах есть несколько ограничений. Трудно использовать абдоминальную хирургию для построения модели мыши, когда возраст мыши составляет менее 2 недель. Основные причины заключаются в том, что мыши слишком молоды, послеоперационная диета затруднена, а выживаемость низкая. Лекарственные средства, используемые на животных моделях, являются жидкими и обладают характеристиками легко проникающих клеточных мембран 19,32,33^, которые подходят для применения этого метода введения.

Понимание мейоза стимулируется исследованиями клеточных культур in vitro и нокаута генов, однако его нелегко применить к сперматоцитам млекопитающих²⁸. Препятствием для механистических исследований мужского мейоза было отсутствие соответствующей системы для манипулирования и наблюдения за делящимися сперматоцитами в мейозе²⁷. Мышь является отличным модельным организмом в исследовании клеточных и молекулярных механизмов мейоза в процессе сперматогенеза. Первая волна сперматоцитов мышей начинает мейоз на 10-й день после родов (dpp) и развивается в зрелые сперматозоиды на 35 dpp, что обеспечивает временное окно развития для исследований мейотического деления и сперматогенеза³⁴.

Инъекция яичек, включая прямую инъекцию через мошонку и микроинъекцию через полостную хирургию, является полезным методом для исследований сперматогенеза^35,36. Прямая инъекция через мошонку является быстрой и простой и вызывает лишь незначительную хирургическую травму, которая подходит для мышей в возрасте 4 недель и старше с яичками, опускающимися к мошонке. Тем не менее, нельзя вводить неопущение яичка 3-недельным или более молодым мышам. Микроинъекция через внутрибрюшинную хирургию или хирургию мошонки подходит для инъекции неопущения яичек, что требует профессиональных хирургических навыков экспериментальных операторов, стереомикроскопа, хирургического и лабораторного оборудования. В зависимости от мест инъекций микроинъекции можно разделить на инъекции в семенные канальцы, инъекции яичковой сетки и внутритканевую инъекцию яичка. По сравнению с другими моделями яичек на основе инъекций, инъекция ингибиторов с помощью абдоминальной хирургии может эффективно ингибировать функции белков и иметь преимущества в проникновении в клеточную мембрану, простых процедурах и длительном ингибировании ^19,32. Методы с использованием миРНК, антисмысловых олигонуклеотидов или лентивируса имеют большие ограничения в низкой эффективности проникновения клеточных мембран, побочных эффектов и легкой деградации миРНК или олигонуклеотидов in vivo 37,38,39,40.

Мейотическое деление в живых тканях является более сложным, чем в условиях культивирования, в которых следует принимать во внимание архитектуру ткани, передачу сигналов развития и факторы окружающей среды in vivo ⁴¹. Предыдущие исследования показали, что питательные среды и клеточные автономные факторы имеют решающее значение для стимуляции начала фазы мейотического деления. Например, ингибитор фосфатазы окадаиновая кислота (ОА)42, специфический для сперматоцитов гистон HIST1H1T⁴³, топоизомераза II 44 и метафазный стимулирующий фактор (MPF)⁴⁵ способствуют переходу G₂/MI в культивируемых сперматоцитах. Эти сложные условия и факторы культивирования способствуют ограничению кратковременного культивирования сперматоцитов.

Прямая инъекция плазмидной ДНК в яички успешно применяется при опосредованном яичками переносе генов и производстве трансгенных мышей^32,46. Электропорация in vivo включает инъекцию плазмиды экспрессии ДНК в просвет семенных канальцев, а затем использование серии электрических импульсов для изменения проницаемости клеточной мембраны, повышения эффективности экспрессии трансгенов и генетической модификации 45,46,47,48,49. Наш метод может быть объединен с электропорацией in vivo, а также с флуоресцентными мечеными белками и инструментами редактирования генов, что делает этот подход более мощным для анализа мужского мейотического деления в физиологическом контексте тканей и органов.

Авторам раскрывать нечего.

Мы благодарим всех сотрудников лаборатории цитоскелета Медицинского университета Фуцзянь за полезные обсуждения. Мы благодарим Цзюнь-Цзинь Линя из Центра обслуживания общественных технологий Медицинского университета Фуцзянь за техническую помощь в проточной цитометрии. Мы благодарим Минг-Ся Ву и Линь-Ин Чжоу из Лаборатории электронной микроскопии Центра обслуживания общественных технологий Медицинского университета Фуцзянь за техническую помощь в электронной микроскопии. Мы благодарим Си-И Чжэн, Ин Линь, Ци Кэ и Цзюнь Сун из Экспериментального учебного центра фундаментальных медицинских наук Медицинского университета Фуцзянь за их поддержку. Это исследование было поддержано следующими грантами: Национальный фонд естественных наук Китая (грант No 82001608), Фонд естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (номер гранта 2019J05071), Проект технологий здравоохранения провинции Фуцзянь (номер гранта 2018-1-69), Фонд стартапов для научных исследований, Медицинский университет Фуцзянь (номер гранта 2017XQ1001), Проект финансирования научных исследований высокого уровня талантов Медицинского университета Фуцзянь (грант No XRCZX2017025) и Исследовательский проект онлайн-образования и преподавания аспирантов китайской медицины (грант No B-YXC20200202-06).