Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak Anofel Sivrisineklerinde Plasmodium Sporozoitlerin Tespiti

Bu protokol, sivrisineklerde tükürük bezi sporozoitlerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı bir immünosorbent testini tanımlar. Kolayca bulunabilen monoklonal antikorları kullanan yöntem, Plasmodium falciparum veya Plasmodium vivax taşıyan sivrisineklerin uygun maliyetli, yüksek verimli tespitini sağlar. Yöntem, vektör araştırmaları da dahil olmak üzere sıtma bulaşma araştırmaları için uygundur.

Plasmodium sporozoitler, insanları enfekte eden sıtma parazitlerinin enfektif aşamasıdır. Dişi Anofel sivrisineklerinin tükürük bezlerinde bulunan sporozoitler, kanla beslenme sırasında sivrisinek ısırıkları yoluyla insanlara bulaşır. Sivrisinek tükürük bezlerinde sporozoitlerin varlığı bu nedenle sivrisinek bulaşıcılığını tanımlar. Bir Anofel sivrisineğinin Plasmodium sporozoitleri taşıyıp taşımadığını belirlemek için, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) yöntemi, sporozoitlerin ana yüzey proteini olan Plasmodium circumsporozoite proteinini (CSP) tespit etmek için standart bir araç olmuştur. Bu yöntemde, her bir sivrisineğin göğüs kafesi ile birlikte baş, karından ayrılır, homojenize edilir ve Plasmodium falciparum'a özgü CSP'nin ve Plasmodium vivax'ın iki alt tipinin her biri olan VK210 ve VK247'nin varlığını tespit etmek için bir sandviç ELISA'ya tabi tutulur. Bu yöntem, sivrisinek enfeksiyonunun mevsimsel dinamikleri ve çalışma alanlarındaki başlıca sıtma vektörlerinin türleri dahil olmak üzere sıtma bulaşmasını incelemek için kullanılmıştır.

Plasmodium sporozoitler, sivrisineklerdeki sıtma parazitlerinin bulaşıcı aşamasıdır. Sporozoitler insanlara sivrisinek ısırıkları yoluyla verilir. Sivrisinekte, sporozoitler ilk olarak orta bağırsak duvarındaki ookistlerin içinde oluşur. Hazır olduklarında hemokoele salınırlar ve sivrisinek tükürük bezlerine giderler. Orada olgunlaşırlar ve kanla beslenme sırasında insanlara bulaşmaya hazır hale gelirler. İnsanlarda, sporozoitler dermiste biriktirilir. Daha sonra kan damarına girerler ve hepatositlerde enfeksiyon oluşturmak için karaciğere ulaşmak için kan dolaşımı boyunca hareket ederler ^1,2.

Sivrisinek tükürük bezlerinin sporozoit enfeksiyonunu belirlemek için üç farklı yöntem kullanılmıştır. İlk yöntem, tükürük bezlerinin diseksiyonu ve ardından sporozoitlerin ışık mikroskobu altında doğrudan incelenmesidir. Bu yöntem, Anofel sivrisinek tükürük bezlerindeki sporozoitleri tespit etmek ve ölçmek için altın standarttır³. Bununla birlikte, hem diseksiyon hem de mikroskobik inceleme konusunda iyi eğitimli bir teknisyen gerektirir. Ayrıca, Plasmodium türlerini ve CSP alt tiplemesini belirlemek için kullanılamaz (P. vivax için)^4,5. İkinci yöntem, sivrisinek gövdesinin üst kısmındaki Plasmodium DNA'yı tespit etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanır⁶. PCR'nin özgüllüğü göz önüne alındığında, parazitin hem türü hem de alt tiplemesi mümkündür 7,8,9,10. PCR giderek daha fazla kullanılmasına rağmen, nispeten pahalı ekipman ve iyi eğitimli personel gerektirir. Plasmodium'a özgü circumsporozoite proteinini (CSP) tespit etmek için son yöntem olan ELISA, otuz yıldır temel dayanak noktası olmuştur 11,12,13. CSP hem ookist sporozoitlerinde hem de tükürük bezi sporozoitlerinde^{bulunur 12,14}. Spesifik antikorlar kullanarak, bu yöntem Plasmodium türlerinin tanımlanmasına ve P. vivax sporozoitlerin CSP alt tiplemesine izin verir. Bu testin mantığı, sıtma bulaşmasını anlamak (yani sporozoit enfeksiyon oranını belirlemek) için çok sayıda yabani sivrisineği incelemek için basit bir yüksek verimli testin gerekliliğidir.

ELISA yönteminin mikroskobik incelemeye göre iki önemli avantajı vardır. İlk olarak, araştırmacıların sivrisinek örneklerini örnek işleme için hazır olana kadar tutmalarına izin verir. İkincisi, ELISA yöntemi, türe özgü monoklonal antikorlar aracılığıyla Plasmodium türlerini ayırt etmek için kullanılabilir. Ek olarak, ELISA daha fazla sayıda sivrisinek örneğini barındırabilir ve çok daha yüksek bir verime izin verir¹⁵. Sporozoit DNA'sını tespit eden PCR ile karşılaştırıldığında, ELISA prosedürü daha fazla zaman alır ancak daha az maliyetlidir¹⁶. Burada tarif edilen ELISA testi, sivrisinek enfektivitesini belirlemek ve P. falciparum'un CSP'sini ve P. vivax, VK210 ve VK247'nin iki CSP varyantının her birini ayrı ayrı tespit etmek için geliştirilmiştir. Bu ELISA yöntemi, sivrisinek enfeksiyonunun mevsimsel dinamiklerini belirlemek ve 12,13,17,18 alanındaki başlıca sıtma vektörlerinin türlerini belirlemek için birçok çalışmada kullanılmıştır. Bu testi gerçekleştirmek için, bir ELISA plaka okuyucu ile donatılmış standart bir laboratuvar yeterlidir.

Genel yaklaşım Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu sandviç ELISA'da, her bir Plasmodium türü/alt tipi için spesifik olan birincil (yakalama) monoklonal antikor (mAb) ilk olarak ELISA plakasını kaplamak için kullanılır. Her plaka tek bir yakalama mAb ile kaplanmıştır. mAb'nin işlevi, sivrisinek homojenatlarında karşılık gelen CSP antijenini yakalamaktır. Antijen yakalama ve plaka yıkamalarından sonra, yakalama mAb'sine bağlı CSP'nin varlığını tespit etmek için peroksidaz ile işaretlenmiş ikinci bir CSP'ye özgü antikor kullanılır. Peroksidaz tarafından katalize edilen kimyasal reaksiyon, CSP için pozitif kuyularda renk gelişimi ile sonuçlanır.

1. Reaktiflerin hazırlanması

NOT: Bu protokolde kullanılan ekipman, reaktifler ve diğer sarf malzemelerinin listesi için Malzeme Tablosuna ve çözeltilerin ve bileşimlerinin listesi için Tablo 1'e bakın.

1. Yakalama ve peroksidaz konjuge mAb'ler
   1. mAb'yi sulandırmak için, liyofilize mAb'yi 1: 1 damıtılmış su karışımında yeniden süspanse edin: 0.5 mg / mL'de gliserol. Tekrarlanan donarak çözülmeyi önlemek için gerektiği gibi alikotlar yapın ve bunları -20 °C'de saklayın.
2. Engelleme tamponu (BB)
   1. 5 g ELISA dereceli kazeini 100 mL 0.1 N NaOH içinde çözerek bloke edici tamponu hazırlayın. Son hacmi 1.0 L'ye getirmek için 900 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ( Tablo 1'e bakınız).
   2. İndikatör olarak 0.02 g fenol kırmızısı ekleyin ve pH'ı HCl ile 7.4'e ayarlayın. BB'yi bir haftaya kadar 4 ° C'de saklayın veya -20 ° C'de uzun süreli depolama için 50 mL'ye alın.
3. Pozitif kontroller
   1. Pozitif kontrolleri yeniden oluşturmak için, 1.000 μL BB ekleyerek liyofilize proteinleri yeniden sulandırın. Stok pozitif kontrol solüsyonlarının gerektikçe ayrılmasını sağlayın ve -20 °C'de saklayın.
   2. Seri seyreltme için, her bir pozitif kontrolü BB cinsinden nihai çalışma konsantrasyonuna aşağıdaki gibi daha fazla seyreltin: Pf, 2 pg/μL; Pv (VK210), 182 (pg/μL); Pv (VK247), 89 sayfa/μL.
      NOT: Pozitif kontrollerin konsantrasyonlarının tam konsantrasyonu bir partiden diğerine değişebilir. İhtiyaç duyulan tam konsantrasyon için ürün bilgi sayfasına bakın. Yukarıdaki çalışma konsantrasyonundan başlayarak pozitif kontrol konsantrasyonları, Pf için 2, 1, 0.5, 0.25, 0.13, 0.06 pg/μL'dir; PV210 için 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μL; ve 89, 45, 22, 11, 5.6, 2.8 pg/μL PV247.
4. Negatif kontroller
   NOT: İdeal negatif kontrol, test numuneleri ile aynı şekilde hazırlanan dişi Anofel sivrisineklerinin baş-toraks homojenatıdır. Bununla birlikte, BB negatif kontrol olarak da kullanılabilir.
   1. Negatif kontrol olarak BB ile, güvenilir pozitif okumalar için 2 kat absorbans eşiğini kullanın.

2. Sivrisinek örneği hazırlama

1. Toplanan her yetişkin sivrisineğin başını ve göğüs kafesini steril bir tıraş bıçağıyla karından ayırın. Başı ve göğüs kafesi önceden etiketlenmiş 1,5 mL'lik bir santrifüj öğütme tüpüne yerleştirin. İstenirse 10 sivrisineğin havuz başlıkları ve göğüsleri.
   NOT: Numune hazırlama için, tipik olarak, enfekte bir sivrisinekten alınan tükürük bezi diseke edilecek ve CS-ELISA'ya tabi tutulacaktır. Bununla birlikte, toplanan sivrisineklerin başı ve göğüs kafesi, CS-ELISA'yı doğrudan (tükürük bezleri için diseksiyon yapmadan) gerçekleştirmek için de kullanılabilir12,13,19.
2. Her tüpe 50 μL Öğütme Tamponu (GB) ekleyin ve numuneyi temiz bir havaneli (sabunla yıkanmış) ile homojenize edin. Kullanılmış havaneli 250 μL GB ile homojenize sivrisinek(ler)i içeren tüpe ~300 μL'lik bir nihai hacme kadar durulayın.
3. Numuneyi kullanana kadar bir dondurucuda (-20 °C) saklayın veya ELISA'yı gerçekleştirmek için hemen devam edin.

3. Sporozoit ELISA

1. Sporozoit ELISA çalışma sayfasını doldurun (Ek Materyal 1'e bakınız). Her CSP (Pf, Pv-210 veya Pv-247) için bir ELISA plakası hazırlayın.
2. Antikoru PBS'de çözerek yakalama mAb çalışma solüsyonunu hazırlayın: 4 μg/mL Pf; 2 μg/mL Pv-210; 2 μg/mL Pv-247. Plaka başına 5 mL ilavesine dayalı olarak gereken hacimleri hesaplayın. Çözeltiyi nazikçe girdaplayın.
3. Adım 3.2'den itibaren çalışan her mAb çözeltisinden 50 μL'yi ELISA plakasının her bir oyuğuna pipetleyin. Plakayı plastik bir kapakla örtün ve 30 dakika veya gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
4. Kuyu içeriğini aspire edin ve tüm sıvıyı çıkarmak için plakayı en az 5 kez kağıt havluların üzerine baş aşağı vurun.
   NOT: Bir aspirasyon sistemi (temiz uçlara bağlı çok kanallı vakumlu emme) mevcut değilse, antikorları lavaboya boşaltın ve ardından plakayı kağıt havluların üzerine hafifçe vurun.
5. Plakadaki tüm kuyucukları doldurmak için 200 μL BB ekleyin. Plakayı plastik bir kapakla örtün. Plakayı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Kuyu içeriğini aspire edin veya boşaltın. Tüm sıvıyı çıkarmak için plakayı kağıt havluların üzerine 5 kez baş aşağı vurun.
6. Sivrisinek homojenatını ve kumandayı aşağıdaki gibi plakaya yükleyin.
   1. H1 ve H2 kuyularına 50 μL pozitif kontrol ekleyin.
   2. C satırından G'ye kadar olan sütun 1 ve 2'deki kuyucuklara 50 μL BB ekleyin. Ardından, G1 ve G2 kuyularına 50 μL pozitif kontrol ekleyin. Pozitif kontrolün G1 ve G2'den başlayarak, ardından F1 ve F2'den C1 ve C2'ye kadar seri bir seyreltme yapın.
      NOT: Tüm pozitif kontrol kuyuları 50 μL içermelidir.
   3. A1, A2, B1 ve B2 kuyularına 50 μL BB (negatif kontrol) ekleyin.
   4. Her homojenat numunesinden 50 μL'yi Bilinmeyen (Unk) bir kuyuya ekleyin.
   5. Plakayı örtün ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
7. Yaklaşık 2 saat sonra alt tabakaları hazırlamaya başlayın. ABTS substrat 2 bileşenli kit için, substrat A ve substrat B'yi 1:1 oranında karıştırın.
   NOT: Tam 96 oyuklu bir plaka, 5 mL substrat A ve 5 mL substrat B gerektirir.
8. 1 μg/mL'lik bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için sulandırılmış konjuge mAb'ye BB ekleyerek Pf, Pv-210 ve Pv-247 için peroksidaz etiketli mAb'lerin çalışma çözeltilerini hazırlayın.
   1. Plaka başına 5 mL çalışma eşleniği mAb çözeltisinin eklenmesine dayalı olarak gerekli hacimleri hesaplayın.
   2. Peroksidaz aktivitesini, adım 3.8'de yapılan peroksidaz etiketli mAb'nin 5 μL'sini, adım 3.7'de yapılan 100 μL substrat ile ayrı bir 1.5 mL'lik tüpte karıştırarak test edin. Yavaşça girdap.
      NOT: Berraktan yeşile hızlı bir renk değişimi olmalıdır, bu da peroksidaz enziminin ve substratların çalıştığını gösterir.
9. Kuyu içeriğini aspire edin veya boşaltın ve tüm sıvıyı çıkarmak için plakayı kağıt havluların üzerine 5 kez baş aşağı vurun.
10. Kuyuları 200 μL PBS-Tween ile iki kez yıkayın, kuyu içeriğini aspire edin ve plakaya her biri 5 kez vurun.
11. Her bir oyuğa adım 3.8'de yapılan 50 μL peroksidaz etiketli mAb ekleyin. Plakayı örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Kuyu içeriğini aspire edin veya boşaltın ve plakayı 5 kez bir kağıt havluya baş aşağı vurun.
12. Kuyuları 200 μL PBS-Tween ile 3 kez yıkayın, kuyu içeriğini aspire edin ve plakaya her biri 5 kez vurun.
13. Her bir oyuka adım 3.7'de hazırlanan substrat çözeltisinden 100 μL ekleyin. Plakayı örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
14. 30 dakika sonra, bir ELISA plaka okuyucu kullanarak 405-414 nm'de absorbansı okuyun.
    NOT: Kullanılan ELISA plaka okuyucu için özel talimatları izleyin. Bu protokol için kullanılan yazılımın talimatlarıyla ilgili ayrıntılar için Ek Materyal S2'ye bakın. Pozitif kontrol kuyularında berraktan yeşile gözle görülür bir renk değişimi olmalıdır.

4. Analiz

1. Pozitif numunelerin tespit edilmesi.
   1. Absorbans değerleri kesme değerin üzerinde olan numuneleri (negatif numunelerin ortalama absorbans değerinin iki katı) pozitif olarak etiketleyin.
2. CSP'nin Ölçülmesi
   1. Aşağıdaki gibi kontrol seyreltme serisinden oluşturulan standart eğriyi kullanarak numunedeki CSP konsantrasyonunu tahmin edin.
      1. Seri olarak seyreltilmiş kontrollerin absorbans değerlerini (y ekseni) konsantrasyonlarına (x ekseni) göre çizerek standart eğriyi oluşturun.
      2. A ve B'nin serbest parametreler olduğu y = A + Bx kullanarak en uygun olanı belirlemek için doğrusal regresyon gerçekleştirin.
      3. Belirli bir absorbans değeri için denklemi çözerek her pozitif numune için CSP konsantrasyonunu belirleyin.

Temsili ELISA sonuçları Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu deneyde, P. falciparum ELISA A7 kuyusunda sporozoit enfeksiyonu tespit etti. Pozitif kuyu, soluk yeşil rengiyle görsel olarak tespit edilebilir (Şekil 2A). Bu kuyunun absorbans değeri, kesme eşiğinin üzerindeydi (dört negatif kontrol kuyusunun ortalama değerinin iki katı) (Şekil 2B). 80 bilinmeyen kuyunun tümünün absorbans değerlerinin dağılımı Şekil 2C'de gösterilmiştir. Arka plan (negatif kontrol) çıkarmadan sonra plaka içi standart eğri ile kuyu A7'nin CSP miktar tayini, 0.35 pg/μL'lik bir CSP konsantrasyonu olduğunu gösterir (Şekil 2D). VK210 ve VK247 için P. vivax tahlillerinin her ikisi de bu numune seti için negatifti (veriler gösterilmemiştir), bu da A7'deki sporozoit enfeksiyonunun mono-tür olduğunu gösterir P. falciparum.

Şekil 1: CSP sandviç ELISA'ya genel bakış. (A) Her bir kuyucuğun yüzeyini kaplamak için spesifik yakalama monoklonal antikoru (yakalama mAb) kullanılır. Sivrisinek homojenatındaki CSP antijeni, mAb kaplı kuyucuklara bağlanır. (B) HRP etiketli mAb, yakalanan Ag'yi tespit etmek için kullanılır. Kısaltmalar: CSP = circumsporozoite proteini; ELISA = enzime bağlı immünosorbent testi; Ag = antijen; mAb = monoklonal antikor; HRP = yaban turpu peroksidaz; OD = optik yoğunluk; BB = engelleme tamponu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Plasmodium falciparum CSP tespiti için temsili sonuçlar. (A) ABTS ile 30 dakikalık inkübasyondan sonra ELISA plakasının görüntüsü. Kırmızı ok ve kırmızı daire, pozitif bilinmeyen kuyuyu temsil eder (A7). (B) ELISA plaka okuyucu tarafından okunan absorbans değerleri. Sol üst dört kuyu (A1, A2 ve B1, B2) negatif kontrollerdi. Seyreltilmiş pozitif kontroller çift kopyalar halinde çalıştırıldı: C1 / C2 (1:32), D1 / D2 (1:16), E1 / E2 (1: 8), F1 / F2 (1: 4) ve G1 / G2 (1: 2). Seyreltilmemiş pozitif kontroller H1 / H2 idi. (C) 80 bilinmeyen kuyunun absorbans dağılımı. Düz çizgi, negatif kontrol kuyularının ortalama absorbansını temsil eder. Kesikli çizgi, pozitiflik eşiğini temsil eder. (D) Pozitif kontrolün iki katlı seri seyreltilmesinden oluşturulan standart eğri. Pozitif kontrolün en yüksek konsantrasyonu 2 pg / μL idi. Verilerin doğrusal regresyonu, A7'deki CSP konsantrasyonunu 0.35 pg/μL olarak tahmin etti. Kısaltmalar: CSP = circumsporozoite proteini; ABTS = 2,2'-azino-di-(3-etilbenztiyazolin-6-sülfonat); ELISA = enzime bağlı immünosorbent testi; Abs = absorbans. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Tarifler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Materyal S1: Sporozoit ELISA çalışma sayfası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Materyal S2: ELISA plaka okuyucu yazılımı için yönergeler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

CSP-ELISA, Plasmodium CSP'yi tespit etmek için oldukça spesifik ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar. P. falciparum ve P. vivax sporozoitlerin yanı sıra P vivax 11,13,14,15'in iki alt tipi olan VK210 ve VK247 arasında ayrımcılığa izin verir. Güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bazı kritik noktalara dikkat edilmelidir. Mikrobiyal üremeyi önlemek için tüm solüsyonlar buzdolabında 1 haftadan daha az tutulmalıdır. mAb, %50 gliserol içeren seyreltici içinde tutulmalı ve çoklu donarak çözülmeyi önlemek için gerektiği gibi aliquoted edilmelidir. Pozitif kontroller tek kullanım için ayrı tutulmalıdır. ELISA plakası, buharlaşmayı önlemek için inkübasyon süresi boyunca kapakla kapatılmalıdır. Peroksidaz işaretli mAb inkübasyonunu içeren adımlar karanlıkta gerçekleştirilmelidir.

Çözelti değişikliğini içeren tüm adımlar, yüksek arka plana yol açabilecek kurumayı önlemek için hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Çalışma substratı çözeltisi, alüminyum folyo ile sarılarak karanlıkta tutulmalı ve hazırlandıktan hemen sonra plakaya eklenmelidir. Dondurulmuş sivrisinek homojenatları ile çalışırken, numuneler çözüldükten sonra aynı gün test edilmelidir. Reaksiyonun pH'ı 7-7.4 aralığında tutulmalıdır, çünkü reaksiyon bu aralığın dışındaki pH değerlerinde inhibe edilir. Yanlış pozitifleri önlemek için yıkama dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. İyonik olmayan deterjan Tween-20'nin yıkama solüsyonuna dahil edilmesi, arka plandan gelen sinyali en aza indirebilir.

Bu protokol, Wirtz ve ^ark.19 tarafından açıklanan protokolden değiştirilmiştir. Bir fark, altı noktalı standart eğriye izin vermek için daha az sayıda negatif kontroldür. Ek olarak, protein standartları, sivrisinek lizatı olmadan BB'de seri olarak seyreltilir. Bu nedenle, arka plan bileşimleri test numunelerininkinden farklıdır. Bu standartlar, farklı plakalar boyunca test numunelerinin tutarlı CSP miktar tayinini sağlamak için kullanılır. Daha doğru bir miktar tayinine ihtiyaç duyulursa, standartlar, test numunelerine aynı şekilde işlenmiş, ancak bilinen miktarda protein eklenmiş enfekte olmamış sivrisineklerin lizatı kullanılarak hazırlanabilir. Son olarak, çoğu tanı testinde olduğu gibi, CSP ELISA hatasız değildir²⁰. Tüm pozitif numuneler, testin ısıtılmış homojenat (100 °C, 10 dakika) ile tekrarlanması veya kalan homojenatı DNA şablonu^20'nin kaynağı olarak kullanarak Plasmodium türüne özgü PCR ile doğrulanmalıdır.

Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, bu CSP ELISA yöntemi son derece güvenilir olabilir. Sivrisinek enfeksiyonunun mevsimsel dinamiklerini belirlemek ve başlıca sıtma vektörlerinin türlerini belirlemek amacıyla sıtma bulaşmasıyla ilgili çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır ve muhtemelen kullanılmaya devam edecektir 12,13,17,18. Sporozoitlerin doğrudan mikroskobik incelemesi ile karşılaştırıldığında, bu test çok daha fazla verime sahiptir ve çok sayıda sivrisinek içeren araştırmalar için daha uygundur. Sporozoitlerin PCR tespiti ile karşılaştırıldığında, ELISA prosedürü daha fazla zaman alır ancak daha az maliyetlidir¹⁶. Genel olarak, basitliği, yüksek verimi ve nispeten düşük maliyeti, standart bir laboratuvarda büyük ölçekli testlere izin verir.

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Eğitim ve rehberlik için MVRU'dan Bay Kirakorn Kiatibutr'a teşekkür ederiz. Ayrıca, Şekil 2'nin hazırlanmasındaki teknik yardımı için MVRU'dan Bayan Pinyapat Kongngen'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (U19 AI089672) tarafından sağlanan bir hibe ile desteklenmiştir.