효소 결합 면역 흡착 분석을 사용한 Anopheles 모기의 Plasmodium sporozoites 검출

이 프로토콜은 모기에서 타액선 포자석을 검출하기 위한 샌드위치 효소 결합 면역 흡착 분석을 설명합니다. 쉽게 구할 수 있는 단클론 항체를 사용하는 이 방법은 Plasmodium falciparum 또는 Plasmodium vivax를 운반하는 모기를 비용 효율적으로 고처리량으로 검출할 수 있습니다. 이 방법은 매개체 조사를 포함한 말라리아 전염 연구에 적합합니다.

Plasmodium sporozoites는 인간을 감염시키는 말라리아 기생충의 감염 단계입니다. 암컷 Anopheles 모기의 타액선에 서식하는 sporozoites는 피를 먹는 동안 모기에 물려 인간에게 전염됩니다. 따라서 모기 타액선에 sporozoites가 존재하면 모기 전염성이 정의됩니다. 아노펠레스 모기가 Plasmodium sporozoites를 가지고 있는지 여부를 결정하기 위해 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)은 포자동물의 주요 표면 단백질인 Plasmodium circumsporozoite 단백질(CSP)을 검출하는 표준 도구였습니다. 이 방법에서는 각 모기의 흉부와 함께 머리를 복부에서 분리하고 균질화한 다음 샌드위치 ELISA를 투여하여 Plasmodium falciparum 에 특이적인 CSP와 Plasmodium vivax의 두 가지 아형인 VK210 및 VK247 각각의 존재를 감지합니다. 이 방법은 모기 감염의 계절적 역학과 연구 현장의 주요 말라리아 매개체 종을 포함하여 말라리아 전염을 연구하는 데 사용되었습니다.

Plasmodium sporozoites는 모기에 있는 말라리아 기생충의 전염 단계입니다. sporozoites는 모기에 물린 것을 통해 인간에게 전달됩니다. 모기에서 sporozoites는 먼저 midgut 벽의 난포 낭종 내부에 형성됩니다. 준비가 되면 모기로 방출되어 모기 침샘으로 이동합니다. 그곳에서 그들은 성숙하고 혈액 수유 중에 인간에게 전염될 준비가 됩니다. 인간에서는, sporozoites는 진피에서 침착됩니다. 그런 다음 혈관으로 들어가 혈액 순환을 따라 이동하여 간에 도달하여 간세포 ^1,2에 감염을 일으킵니다.

모기 침샘의 sporozoite 감염을 결정하기 위해 세 가지 다른 방법이 사용되었습니다. 첫 번째 방법은 타액선을 절개한 후 광학 현미경으로 sporozoites를 직접 검사하는 것입니다. 이 방법은 Anopheles 모기 침샘에서 sporozoites를 검출하고 정량화하는 황금 표준입니다³. 그러나 해부와 현미경 검사 모두에 대해 잘 훈련된 기술자가 필요합니다. 또한 Plasmodium 종 및 CSP 서브 타이핑 (P. vivax의 경우) ^4,5를 결정하는 데 사용할 수 없습니다. 두 번째 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 사용하여 모기체 상부에서 플라스모디움 DNA를 검출한다⁶. PCR의 특이성을 감안할 때, 기생충의 종과 아형(subtype)은 모두 가능하다 7,8,9,10. PCR이 점점 더 많이 사용되고 있지만 상대적으로 값비싼 장비와 잘 훈련된 직원이 필요합니다. 마지막 방법인 ELISA는 Plasmodium 특정 circumsporozoite 단백질(CSP)을 검출하기 위해 30년 동안 주류였습니다 11,12,13. CSP는 난포낭 sporozoites와 타액선 sporozoites 모두에 존재합니다^12,14. 이 방법은 특정 항체를 사용하여 P. vivax sporozoites의 Plasmodium 종 식별 및 CSP 서브타이핑을 가능하게 합니다. 이 분석의 근거는 말라리아 전염을 이해하기 위해(즉, 스포로조이트 감염률을 결정하기 위해) 많은 수의 야생 모기를 검사하기 위한 간단한 고처리량 분석이 필요하기 때문입니다.

ELISA 방법은 현미경 검사에 비해 두 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 연구원들이 샘플 처리 준비가 될 때까지 모기 샘플을 보관할 수 있습니다. 둘째, ELISA 방법은 종 특이적 단클론 항체를 통해 Plasmodium 종을 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 ELISA는 더 많은 수의 모기 표본을 수용할 수 있어 훨씬 더 높은 처리량을 허용합니다¹⁵. 스포로조이트 DNA를 검출하는 PCR과 비교했을 때, ELISA 시술은 시간이 더 걸리지만 비용은 더 적게 든다¹⁶. 여기에 설명된 ELISA 분석은 모기 감염률을 측정하고 P. falciparum의 CSP와 P. vivax, VK210 및 VK247의 두 CSP 변이체 각각을 별도로 검출하기 위해 개발되었습니다. 이 ELISA 방법은 많은 연구에서 모기 감염의 계절적 역학을 결정하고 ^12,13,17,18 분야에서 주요 말라리아 매개체의 종을 식별하는 데 사용되었습니다. 이 분석을 수행하려면 ELISA 플레이트 리더가 장착된 표준 실험실로 충분합니다.

전반적인 접근 방식은 그림 1에 요약되어 있습니다. 이 샌드위치 ELISA에서는 각 Plasmodium 종/아형에 특이적인 일차(포획) 단클론 항체(mAb)를 먼저 사용하여 ELISA 플레이트를 코팅합니다. 각 플레이트는 단일 capture mAb로 코팅됩니다. mAb의 기능은 모기 균질액에서 해당 CSP 항원을 포획하는 것입니다. 항원 포획 및 플레이트 세척 후 과산화효소로 표지된 두 번째 CSP 특이적 항체를 사용하여 포획 mAb에 결합된 CSP의 존재를 검출합니다. 과산화효소에 의해 촉매된 화학 반응은 CSP에 양성인 우물에서 발색을 일으킵니다.

1. 시약의 준비

알림: 이 프로토콜에 사용된 장비, 시약 및 기타 소모품 목록은 Table of Materials 를 참조하고 용액 목록 및 그 구성은 Table 1 을 참조하십시오.

1. 포획 및 과산화효소 접합 mAb
   1. mAb를 재구성하려면 동결건조된 mAb를 0.5mg/mL의 증류수:글리세롤의 1:1 혼합물에 재현탁시킵니다. 반복적인 동결-해동을 피하기 위해 필요에 따라 부분 표본을 만들고 -20 °C에서 보관하십시오.
2. 차단 버퍼(BB)
   1. 0.1N NaOH 100mL에 ELISA 등급 카제인 5g을 용해시켜 차단 완충액을 준비합니다. 900mL의 인산염 완충 식염수(PBS)( 표 1 참조)를 추가하여 최종 부피를 1.0L로 만듭니다.
   2. 지시약으로 페놀 레드 0.02g을 추가하고 HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. BB를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관하거나 -20°C에서 장기 보관하기 위해 50mL에 분주하여 보관합니다.
3. 포지티브 컨트롤
   1. 양성 대조군을 재구성하려면 1,000μL의 BB를 추가하여 동결건조된 단백질을 재수화합니다. 필요에 따라 원액 양성 대조 용액의 부분 표본을 만들고 -20 °C에서 보관하십시오.
   2. 연속 희석을 위해 다음과 같이 각 양성 대조군을 BB의 최종 작업 농도로 더 희석합니다: Pf, 2pg/μL; PV(VK210), 182(pg/μL); PV(VK247), 89pg/μL.
      알림: 양성 대조군의 정확한 농도는 로트마다 다를 수 있습니다. 필요한 정확한 농도에 대해서는 제품 정보 시트를 참조하십시오. 위의 작업 농도에서 시작하는 양성 대조군 농도는 Pf의 경우 2, 1, 0.5, 0.25, 0.13, 0.06pg/μL입니다. PV210의 경우 182, 91, 46, 23, 11, 5.7pg/μL; 및 89, 45, 22, 11, 5.6, 2.8pg/μL PV247.
4. 네거티브 컨트롤
   알림: 이상적인 음성 대조군은 테스트 샘플과 동일하게 준비된 암컷 Anopheles 모기의 머리-흉부 균질화입니다. 그러나 BB는 음성 대조군으로도 사용할 수 있습니다.
   1. BB를 네거티브 컨트롤로 사용하면 신뢰할 수 있는 포지티브 판독을 위해 2배 흡광도 임계값을 사용합니다.

2. 모기 샘플 준비

1. 멸균 면도날로 수집된 각 성충 모기의 머리와 흉부를 복부에서 분리합니다. 머리와 흉부를 사전 라벨이 부착된 1.5mL 원심분리기 분쇄 튜브에 넣습니다. 원하는 경우 최대 10마리의 모기의 수영장 머리와 흉부.
   참고: 샘플 준비를 위해 일반적으로 감염된 모기의 타액선을 절개하고 CS-ELISA를 투여합니다. 그러나 수집된 모기의 머리와 흉부는 침샘을 절개하지 않고 직접 CS-ELISA를 수행하는 데 사용할 수도 있습니다.12,13,19.
2. 각 튜브에 50μL의 분쇄 완충액(GB)을 추가하고 깨끗한 유봉(비누로 세척)으로 샘플을 균질화합니다. 사용한 유봉을 250μL의 GB로 헹구고 균질화된 모기가 들어있는 튜브에 최종 부피 ~300μL로 헹굽니다.
3. 샘플을 사용할 때까지 냉동고(-20 °C)에 보관하거나 즉시 ELISA를 수행하십시오.

3. 스포로조이트 엘리사

1. sporozoite ELISA 워크시트를 작성합니다( 보충 자료 1 참조). 각 CSP(Pf, Pv-210 또는 Pv-247)에 대해 하나의 ELISA 플레이트를 준비합니다.
2. 항체를 PBS에 용해시켜 포획 mAb 작업 용액을 준비합니다: 4 μg/mL Pf; 2 μg / mL Pv-210; Pv-247 2μg/mL. 플레이트당 5mL의 추가를 기준으로 필요한 부피를 계산합니다. 용액을 부드럽게 소용돌이치십시오.
3. 3.2단계에서 각 작업 mAb 용액 50μL를 ELISA 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다. 플라스틱 뚜껑으로 접시를 덮고 실온에서 30분 또는 하룻밤 동안 배양합니다.
4. 웰 내용물을 흡입하고 종이 타월에 접시를 거꾸로 5번 이상 두드려 모든 액체를 제거합니다.
   알림: 흡입 시스템(클린 팁에 연결된 다중 채널 진공 흡입)을 사용할 수 없는 경우 항체를 싱크대에 버린 다음 종이 타월에 플레이트를 두드립니다.
5. 200μL의 BB를 추가하여 플레이트의 모든 웰을 채웁니다. 플라스틱 뚜껑으로 접시를 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 우물 내용물을 흡인하거나 버리십시오. 종이 타월에 접시를 거꾸로 5번 두드려 모든 액체를 제거합니다.
6. 다음과 같이 모기 균질액과 대조군을 플레이트에 로드합니다.
   1. 50 μL의 positive control을 웰 H1 및 H2에 추가합니다.
   2. C행에서 G행까지 1열과 2열의 웰에 50μL의 BB를 추가합니다. 그런 다음 50 μL의 positive control을 웰 G1 및 G2에 추가합니다. G1 및 G2에서 시작하여 F1 및 F2, C1 및 C2까지 포지티브 대조군을 연속적으로 희석합니다.
      참고: 모든 포지티브 컨트롤 웰에는 50μL가 포함되어야 합니다.
   3. 웰 A1, A2, B1 및 B2에 50μL의 BB(음성 대조군)를 추가합니다.
   4. 각 균질화 샘플 50μL를 미지(Unk) 웰에 추가합니다.
   5. 플레이트를 덮고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
7. 약 2시간 후 기판 준비를 시작합니다. ABTS 기판 2성분 키트의 경우 기판 A와 기판 B를 1:1 비율로 혼합합니다.
   참고: 전체 96웰 플레이트에는 5mL의 기판 A와 5mL의 기판 B가 필요합니다.
8. 재구성된 접합체 mAb에 BB를 첨가하여 Pf, Pv-210 및 Pv-247에 대한 과산화효소 표지 mAb의 작업 용액을 준비하여 1μg/mL의 작업 농도를 얻습니다.
   1. 플레이트당 5mL의 working conjugate mAb 용액을 추가하여 필요한 부피를 계산합니다.
   2. 3.8단계에서 만든 과산화효소 표지 mAb 5μL와 3.7단계에서 만든 기판 100μL를 별도의 1.5mL 튜브에 혼합하여 과산화효소 활성을 테스트합니다. 부드럽게 소용돌이.
      참고: 투명에서 녹색으로 빠르게 색상이 변해야 하며, 이는 과산화효소와 기질이 작동하고 있음을 나타냅니다.
9. 우물 내용물을 흡입하거나 버리고 종이 타월에 접시를 거꾸로 5번 두드려 모든 액체를 제거합니다.
10. PBS-Tween 200μL로 웰을 두 번 세척하고 웰 내용물을 흡인하고 플레이트를 각각 5번 두드립니다.
11. 3.8단계에서 만든 50μL의 과산화효소 표지 mAb를 각 웰에 추가합니다. 접시를 덮고 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 우물 내용물을 흡입하거나 버리고 종이 타월에 접시를 거꾸로 5번 두드립니다.
12. PBS-Tween 200μL로 웰을 3번 세척하고 웰 내용물을 흡인하고 플레이트를 각각 5번 두드립니다.
13. 3.7단계에서 준비한 기판 용액 100μL를 각 웰에 추가합니다. 접시를 덮고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
14. 30분 후 ELISA 플레이트 리더를 사용하여 405-414nm에서 흡광도를 판독합니다.
    알림: 사용된 ELISA 플레이트 리더에 대한 특정 지침을 따르십시오. 이 프로토콜에 사용되는 소프트웨어의 지침에 대한 자세한 내용은 보충 자료 S2를 참조하십시오. positive control well에서 투명에서 녹색으로 눈에 띄는 색상 변화가 있어야 합니다.

4. 분석

1. 양성 샘플 검출.
   1. 컷오프(음성 샘플의 평균 흡광도 값의 두 배)보다 높은 흡광도 값을 가진 샘플에 양으로 라벨을 지정합니다.
2. CSP 정량화
   1. 다음과 같이 control dilution series에서 구성된 표준 곡선을 사용하여 샘플의 CSP 농도를 추정합니다.
      1. 연속적으로 희석된 대조군의 흡광도 값(y축)을 농도(x축)에 대해 플로팅하여 표준 곡선을 생성합니다.
      2. 선형 회귀를 수행하여 y = A + Bx를 사용하여 가장 적합한 피팅을 결정합니다(여기서 A와 B는 자유 파라미터임).
      3. 주어진 흡광도 값에 대한 방정식을 풀어 각 양성 샘플에 대한 CSP 농도를 결정합니다.

대표적인 ELISA 결과는 그림 2에 나와 있습니다. 이 실험에서 P. falciparum ELISA는 우물 A7에서 sporozoite 감염을 감지했습니다. 포지티브 웰은 희미한 녹색으로 시각적으로 감지할 수 있습니다(그림 2A). 이 웰의 흡광도 값은 차단 임계값(4개의 음성 대조군 웰 평균값의 2배)보다 높았습니다(그림 2B). 알려지지 않은 80개의 모든 웰의 흡광도 값의 분포는 그림 2C에 표시되어 있습니다. 배경(음성 대조군) 빼기 후 플레이트 내 표준 곡선에 의한 웰 A7의 CSP 정량화는 0.35pg/μL의 CSP 농도를 제안합니다(그림 2D). VK210 및 VK247에 대한 P. vivax 분석은 모두 이 샘플 세트에 대해 음성이었으며(데이터는 표시되지 않음), 이는 A7의 sporozoite 감염이 단종 P. falciparum임을 나타냅니다.

그림 1: CSP 샌드위치 ELISA 개요. (A) 특정 포획 단클론 항체(포획 mAb)는 각 웰의 표면을 코팅하는 데 사용됩니다. 모기 균질액의 CSP 항원은 mAb 코팅된 웰에 결합합니다. (B) HRP 표지 mAb는 포획된 Ag를 검출하는 데 사용됩니다. 약어: CSP = circumsporozoite protein; ELISA = 효소 결합 면역 흡착 분석; Ag = 항원; mAb = 단클론 항체; HRP = 양 고추 냉이 과산화 효소; OD = 광학 밀도; BB = 블로킹 버퍼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: Plasmodium falciparum CSP 검출을 위한 대표적인 결과. (A) ABTS로 30분 배양 후 ELISA 플레이트의 이미지. 빨간색 화살표와 빨간색 원은 양의 알 수 없는 우물(A7)을 나타냅니다. (B) ELISA 플레이트 리더가 읽은 흡광도 값. 4개의 왼쪽 상단 우물(A1, A2 및 B1, B2)은 음성 대조군이었습니다. 희석된 양성 대조군은 C1/C2(1:32), D1/D2(1:16), E1/E2(1:8), F1/F2(1:4) 및 G1/G2(1:2)로 중복하여 실행되었습니다. 희석되지 않은 양성 대조군은 H1/H2였습니다. (C) 80개의 알려지지 않은 우물의 흡광도 분포. 실선은 negative control well의 평균 흡광도를 나타냅니다. 점선은 양성 임계값을 나타냅니다. (D) 포지티브 대조군의 2중 연속 희석으로 구성된 표준 곡선. 양성 대조군의 최고 농도는 2pg/μL였습니다. 데이터의 선형 회귀 분석은 A7의 CSP 농도를 0.35pg/μL로 추정했습니다. 약어 : CSP = circumsporozoite 단백질; ABTS = 2,2'-아지노-디-(3-에틸벤치아졸린-6-설포네이트); ELISA = 효소 결합 면역 흡착 분석; Abs = 흡광도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 조리법. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 자료 S1 : Sporozoite ELISA 워크 시트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 자료 S2: ELISA 플레이트 리더 소프트웨어에 대한 지침. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

CSP-ELISA는 Plasmodium CSP를 검출하는 매우 구체적이고 비용 효율적인 방법을 제공합니다. P. falciparum 및 P. vivax sporozoites 간의 구별뿐만 아니라 P vivax 11,13,14,15의 두 가지 아형 VK210 및 VK247 간의 구별을 허용합니다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 특정 임계점을 고려해야 합니다. 모든 용액은 미생물 성장을 방지하기 위해 냉장고에 1주일 미만으로 보관해야 합니다. mAb는 50% 글리세롤을 함유한 희석제에 보관해야 하며 다중 동결-해동을 방지하기 위해 필요에 따라 분주해야 합니다. 포지티브 컨트롤은 일회용으로 분주해야 합니다. ELISA 플레이트는 증발을 방지하기 위해 배양 기간 동안 뚜껑으로 덮어야 합니다. 과산화효소 표지 mAb 배양과 관련된 단계는 어두운 곳에서 수행해야 합니다.

용액 교체와 관련된 모든 단계는 배경이 높아질 수 있는 건조를 방지하기 위해 신속하게 수행해야 합니다. 작업 기판 용액은 알루미늄 호일로 싸서 어두운 곳에 보관하고 준비 후 즉시 플레이트에 첨가해야 합니다. 냉동 모기 균질제로 작업할 때 샘플은 해동 당일에 테스트해야 합니다. 반응의 pH는 이 범위를 벗어난 pH 값에서 반응이 억제되므로 7-7.4 범위로 유지되어야 합니다. 거짓 긍정을 피하기 위해 세탁을 조심스럽게 수행해야 합니다. 비이온성 세제인 Tween-20을 세척 용액에 포함하면 배경에서 오는 신호를 최소화할 수 있습니다.

이 프로토콜은 Wirtz et ^al.19에 의해 설명된 프로토콜에서 수정되었습니다. 한 가지 차이점은 6점 표준 곡선을 허용하기 위해 음수 컨트롤의 수가 더 적다는 것입니다. 또한, 단백질 표준물질은 모기 용해물 없이 BB에서 연속적으로 희석됩니다. 따라서 배경 구성은 테스트 샘플의 구성 구성과 다릅니다. 이러한 표준물질은 서로 다른 플레이트에서 테스트 샘플의 일관된 CSP 정량화를 제공하는 데 사용됩니다. 보다 정확한 정량화가 필요한 경우, 테스트 샘플과 동일하게 처리된 감염되지 않은 모기의 용해물을 사용하여 알려진 양의 단백질을 첨가하여 표준물질을 준비할 수 있습니다. 마지막으로, 대부분의 진단 분석과 마찬가지로 CSP ELISA는 오류가 없습니다²⁰. 모든 양성 샘플은 가열된 균질액(100°C, 10분)으로 분석을 반복하거나 나머지 균질액을 DNA^{템플릿 20}의 소스로 사용하여 Plasmodium 종 특이적 PCR로 확인해야 합니다.

올바르게 수행되면 이 CSP ELISA 방법은 매우 신뢰할 수 있습니다. 말라리아 전염에 대한 여러 연구에서 사용되어 왔으며 앞으로도 계속 사용될 것으로 보이며, 모기 감염의 계절적 역학을 결정하고 주요 말라리아 매개체 12,13,17,18의 종을 식별하는 것을 목표로 합니다. sporozoites의 직접 현미경 검사와 비교할 때 이 분석법은 처리량이 훨씬 더 크며 많은 수의 모기와 관련된 연구에 더 적합합니다. sporozoites의 PCR 검출과 비교하여, ELISA 절차는 시간이 더 걸리지만 비용은 더 적게 든다¹⁶. 전반적으로 단순성, 높은 처리량 및 상대적으로 저렴한 비용으로 표준 실험실에서 대규모 테스트를 수행할 수 있습니다.

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

교육과 지도를 해주신 Mr. Kirakorn Kiatibutr, MVRU에게 감사드립니다. 또한 그림 2를 준비하는 데 기술적인 도움을 준 MVRU의 Mrs. Pinyapat Kongngen에게도 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립알레르기·전염병연구소(National Institute for Allergy and Infectious Diseases)와 국립보건원(National Institute of Health, U19 AI089672)의 보조금으로 지원되었습니다.