Method Article
يصف هذا البروتوكول مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم الساندويتش للكشف عن سبوروزويتات الغدد اللعابية في البعوض. وباستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المتاحة بسهولة، تتيح هذه الطريقة الكشف الفعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية عن البعوض الذي يحمل المتصورة المنجلية أو المتصورة النشيطة. وهذه الطريقة مناسبة لبحوث انتقال الملاريا، بما في ذلك مسوحات النواقل.
المتصورة sporozoites هي المرحلة المعدية من طفيليات الملاريا التي تصيب البشر. تنتقل الأسبوغات الموجودة في الغدد اللعابية لأنثى بعوض الأنوفيليس إلى البشر عن طريق لدغات البعوض أثناء تغذية الدم. وبالتالي فإن وجود sporozoites في الغدد اللعابية للبعوض يحدد عدوى البعوض. لتحديد ما إذا كانت بعوضة الأنوفيليس تحمل المتصورة sporozoites ، كانت طريقة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) هي الأداة القياسية للكشف عن بروتين Plasmodium circumsporozoite (CSP) ، وهو البروتين السطحي الرئيسي لل sporozoites. في هذه الطريقة ، يتم فصل الرأس مع الصدر لكل بعوضة عن البطن ، وتجانسها ، وتعريضها لشطيرة ELISA للكشف عن وجود CSP خاص بالمتصورة المنجلية وكل من النوعين الفرعيين ، VK210 و VK247 ، من المتصورة النشيطة. وقد استخدمت هذه الطريقة لدراسة انتقال الملاريا، بما في ذلك الديناميات الموسمية لعدوى البعوض وأنواع ناقلات الملاريا الرئيسية في مواقع الدراسة.
Plasmodium sporozoites هي المرحلة المعدية من طفيليات الملاريا في البعوض. يتم تسليم sporozoites إلى البشر عن طريق لدغات البعوض. في البعوض ، تتشكل sporozoites أولا داخل البويضات على جدار الأمعاء الوسطى. بمجرد أن تصبح جاهزة ، يتم إطلاقها في الهيموكول والسفر إلى الغدد اللعابية البعوض. هناك ، تنضج وتصبح جاهزة للانتقال إلى البشر أثناء تغذية الدم. في البشر ، يتم ترسيب sporozoites في الأدمة. ثم يدخلون الأوعية الدموية ويسافرون على طول الدورة الدموية للوصول إلى الكبد لإثبات العدوى في خلايا الكبد 1,2.
تم استخدام ثلاث طرق مختلفة لتحديد عدوى sporozoite للغدد اللعابية البعوضية. الطريقة الأولى هي تشريح الغدد اللعابية متبوعا بالفحص المباشر للسبوروزويتات تحت المجهر الضوئي. هذه الطريقة هي المعيار الذهبي للكشف عن الأسبوغية وقياسها في الغدد اللعابية للبعوض Anopheles 3. ومع ذلك ، فإنه يتطلب فنيا مدربا جيدا في كل من التشريح والفحص المجهري. علاوة على ذلك ، لا يمكن استخدامه لتحديد أنواع البلازموديوم والتنميط الفرعي ل CSP (ل P. vivax)4,5. تستخدم الطريقة الثانية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) للكشف عن الحمض النووي للبلازميوم في الجزء العلوي من جسم البعوض6. بالنظر إلى خصوصية PCR ، فإن كلا من الأنواع والأنواع الفرعية للطفيلي ممكنة7،8،9،10. على الرغم من استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل متزايد ، إلا أنه يتطلب معدات باهظة الثمن نسبيا وموظفين مدربين تدريبا جيدا. الطريقة الأخيرة ، ELISA للكشف عن بروتين محيطي البلازموديوم المحدد (CSP) ، كانت الدعامة الأساسية لمدة ثلاثة عقود11،12،13. يوجد CSP في كل من البويضات sporozoites و sporozoites الغدد اللعابية12،14. باستخدام أجسام مضادة محددة ، تسمح هذه الطريقة بتحديد أنواع البلازموديوم والتنميط الفرعي ل CSP ل P. vivax sporozoites. الأساس المنطقي لهذا الفحص هو اشتراط اختبار بسيط عالي الإنتاجية لفحص عدد كبير من البعوض البري لفهم انتقال الملاريا (أي تحديد معدل الإصابة بالأسبوروزويت).
تتميز طريقة ELISA بميزتين رئيسيتين على الفحص المجهري. أولا ، يسمح للباحثين بالاحتفاظ بعينات البعوض حتى تصبح جاهزة لمعالجة العينات. ثانيا ، يمكن استخدام طريقة ELISA للتمييز بين أنواع البلازموديوم من خلال الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة بالأنواع. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تستوعب ELISA عددا أكبر من عينات البعوض ، مما يسمح بإنتاجية أعلى بكثير15. بالمقارنة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل ، الذي يكتشف الحمض النووي للسبوروزويت ، يستغرق إجراء ELISA وقتا أطول ولكنه يكلفأقل 16. تم تطوير اختبار ELISA الموصوف هنا لتحديد عدوى البعوض والكشف بشكل منفصل عن CSP من P. falciparum وكل من متغيري CSP من P. vivax و VK210 و VK247. تم استخدام طريقة ELISA هذه في العديد من الدراسات لتحديد الديناميات الموسمية لعدوى البعوض وتحديد أنواع ناقلات الملاريا الرئيسية في الحقل12،13،17،18. لإجراء هذا الفحص ، يكفي وجود مختبر قياسي مجهز بقارئ لوحة ELISA.
يتم تلخيص النهج العام في الشكل 1. في شطيرة ELISA هذه ، يتم استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة الأساسي (التقاط) (mAb) الخاص بكل نوع / نوع فرعي من البلازموديوم لأول مرة لتغليف لوحة ELISA. كل لوحة مغلفة بالتقاط واحد mAb. وظيفة mAb هي التقاط مستضد CSP المقابل في متجانسات البعوض. بعد التقاط المستضد وغسل الصفيحة ، يتم استخدام جسم مضاد ثان خاص ب CSP يحمل علامة البيروكسيديز للكشف عن وجود CSP مرتبط ب mAb الملتقط. ينتج عن التفاعل الكيميائي الذي يحفزه البيروكسيديز تطور اللون في الآبار الإيجابية ل CSP.
1. إعداد الكواشف
ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للحصول على قائمة بالمعدات والكواشف والمواد الاستهلاكية الأخرى المستخدمة في هذا البروتوكول وإلى الجدول 1 للحصول على قائمة بالحلول وتكوينها.
2. إعداد عينة البعوض
3. سبوروزويت إليسا
4. التحليل
تظهر نتائج ELISA التمثيلية في الشكل 2. في هذه التجربة ، اكتشفت P. falciparum ELISA عدوى sporozoite في البئر A7. يمكن اكتشاف البئر الموجب بصريا من خلال لونه الأخضر الباهت (الشكل 2 أ). كانت قيمة امتصاص هذا البئر أعلى من عتبة القطع (ضعف القيمة المتوسطة لآبار التحكم السلبية الأربعة) (الشكل 2 ب). يوضح الشكل 2 ج توزيع قيم الامتصاص لجميع الآبار ال 80 غير المعروفة. يشير القياس الكمي ل CSP للبئر A7 بواسطة المنحنى القياسي داخل اللوحة بعد طرح الخلفية (التحكم السلبي) إلى تركيز CSP يبلغ 0.35 بيكوغرام / ميكرولتر (الشكل 2D). كانت مقايسات P. vivax ل VK210 و VK247 سلبية لمجموعة العينات هذه (البيانات غير معروضة) ، مما يشير إلى أن عدوى sporozoite في A7 كانت أحادية النوع P. falciparum.
الشكل 1: نظرة عامة على شطيرة CSP ELISA . (أ) يستخدم الجسم المضاد أحادي النسيلة المحدد (التقاط mAb) لتغطية سطح كل بئر. يرتبط مستضد CSP في تجانس البعوض بالآبار المطلية ب mAb. (ب) يستخدم mAb المسمى HRP للكشف عن Ag. الاختصارات التي تم التقاطها: CSP = بروتين محيطي ؛ ELISA = مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ؛ Ag = مستضد. mAb = جسم مضاد وحيد النسيلة ؛ HRP = بيروكسيديز الفجل. OD = الكثافة البصرية ؛ BB = حظر المخزن المؤقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية للكشف عن المتصورة المنجلية CSP. (أ) صورة لوحة ELISA بعد حضانة لمدة 30 دقيقة مع ABTS. يمثل السهم الأحمر والدائرة الحمراء البئر الموجب المجهول (A7). (ب) قيم الامتصاص التي يقرأها قارئ لوحة ELISA. كانت الآبار الأربعة العلوية اليسرى (A1 و A2 و B1 و B2) هي عناصر التحكم السلبية. تم تشغيل عناصر التحكم الإيجابية المخففة في نسختين: C1 / C2 (1:32) ، D1 / D2 (1:16) ، E1 / E2 (1: 8) ، F1 / F2 (1: 4) ، و G1 / G2 (1: 2). كانت الضوابط الإيجابية غير المخففة هي H1 / H2. ج: توزيع امتصاص 80 بئرا مجهولة. يمثل الخط المتصل متوسط امتصاص آبار التحكم السلبية. يمثل الخط المتقطع عتبة الإيجابية. (د) المنحنى القياسي المبني من التخفيف التسلسلي المزدوج للتحكم الموجب. كان أعلى تركيز للمراقبة الإيجابية 2 بيكوغرام / ميكرولتر. قدر الانحدار الخطي للبيانات تركيز الطاقة الشمسية المركزة في A7 ب 0.35 بيكوغرام / ميكرولتر. الاختصارات: CSP = بروتين محيطي. ABTS = 2،2'-أزينو دي- (3-إيثيل بنزثيازولين-6-سلفونات) ؛ ELISA = مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ؛ القيمة المطلقة = الامتصاص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: وصفات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
المادة التكميلية S1: ورقة عمل Sporozoite ELISA. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
المواد التكميلية S2: إرشادات لبرنامج قارئ لوحة ELISA. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
يوفر CSP-ELISA طريقة محددة للغاية وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن البلازموديوم CSP. يسمح بالتمييز بين P. falciparum و P. vivax sporozoites وكذلك بين النوعين الفرعيين ، VK210 و VK247 ، من P vivax11،13،14،15. يجب النظر في بعض النقاط الحرجة للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. يجب أن تبقى جميع الحلول في الثلاجة لمدة تقل عن 1 أسبوع لمنع نمو الميكروبات. يجب حفظ mAb في مادة مخففة تحتوي على 50٪ من الجلسرين و aliquote حسب الحاجة لمنع ذوبان الجليد المتعدد. يجب أن تكون الضوابط الإيجابية مقتبسة للاستخدام الفردي. يجب تغطية لوحة ELISA بالغطاء خلال فترة الحضانة لمنع التبخر. يجب تنفيذ الخطوات التي تنطوي على حضانة mAb المسمى بيروكسيديز في الظلام.
يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على تغيير المحلول بسرعة لمنع الجفاف ، مما قد يؤدي إلى خلفية عالية. يجب أن يبقى محلول الركيزة العاملة في الظلام عن طريق لفه بورق الألمنيوم وإضافته إلى اللوحة مباشرة بعد التحضير. عند العمل مع متجانسات البعوض المجمدة ، يجب اختبار العينات في نفس يوم الذوبان. يجب الحفاظ على الرقم الهيدروجيني للتفاعل في نطاق 7-7.4 حيث يتم تثبيط التفاعل عند قيم الأس الهيدروجيني خارج هذا النطاق. يجب أن يتم الغسيل بعناية لتجنب الإيجابيات الكاذبة. يمكن أن يؤدي تضمين المنظف غير الأيوني ، Tween-20 ، في محلول الغسيل إلى تقليل الإشارة من الخلفية.
() عدل هذا البروتوكول من البروتوكول الذي وصفه فيرتز وآخرون.19. أحد الاختلافات هو انخفاض عدد عناصر التحكم السلبية للسماح بالمنحنى القياسي المكون من ست نقاط. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تخفيف معايير البروتين بشكل متسلسل في BB دون تحلل البعوض. لذلك ، يختلف تكوين الخلفية عن تكوين عينات الاختبار. تستخدم هذه المعايير لتوفير تقدير كمي متسق ل CSP لعينات الاختبار عبر لوحات مختلفة. إذا كانت هناك حاجة إلى تقدير كمي أكثر دقة ، يمكن إعداد المعايير باستخدام محللة البعوض غير المصاب المعالج بشكل مماثل لعينات الاختبار ولكن مع إضافة كمية معروفة من البروتين. أخيرا ، كما هو الحال مع معظم المقايسات التشخيصية ، فإن CSP ELISA ليس خاليا منالأخطاء 20. يجب تأكيد جميع العينات الإيجابية عن طريق تكرار الفحص مع التجانس المسخن (100 درجة مئوية ، 10 دقائق) أو بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بأنواع البلازموديوم ، باستخدام التجانس المتبقي كمصدر لقالب الحمض النووي20.
عند تنفيذها بشكل صحيح ، يمكن أن تكون طريقة CSP ELISA هذه موثوقة للغاية. وقد تم استخدامه ، ومن المحتمل أن يستمر ، في العديد من الدراسات حول انتقال الملاريا ، بهدف تحديد الديناميات الموسمية لعدوى البعوض وتحديد أنواع ناقلات الملاريا الرئيسية12،13،17،18. بالمقارنة مع الفحص المجهري المباشر لل sporozoites ، فإن هذا الفحص له إنتاجية أكبر بكثير وهو أكثر ملاءمة للبحث الذي يشمل عددا كبيرا من البعوض. بالمقارنة مع اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل للسبوروزويتات ، يستغرق إجراء ELISA وقتا أطول ولكنه يكلفأقل 16. بشكل عام ، تسمح بساطته وإنتاجيته العالية وتكلفته المنخفضة نسبيا بإجراء اختبار واسع النطاق في مختبر قياسي.
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
نشكر السيد كيراكورن كياتيبوتر ، MVRU ، على التدريب والتوجيه. ونشكر أيضا السيدة بينيابات كونغنغين، MVRU، على مساعدتها التقنية في إعداد الشكل 2. تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والمعهد الوطني للصحة (U19 AI089672).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
ELISA plate reader | BioTek Instrument, Inc. | Synergy H1 | Absorbance is measured using UV-VIS absorbance detection mode |
Grinder pestle | Axygen | PES-15-B-SI | For homogenizing the mosquito head/thorax |
Reagents | |||
ABTS substrate 2-component | KPL | 50-62-00 | For peroxidase driven detection |
Blocking buffer (BB) | Note: solution | ||
Capture and peroxidase-conjugated monoclonal antibodies (mAbs) | Note: mAbs can be obtained in the lyophilized form as part of the Sporozoite ELISA Reagent Kits (MRA-890 for P. falciparum and MRA-1028K for P. vivax) from BEI Resources (https://www.beiresources.org.) | ||
Casein | Sigma aldrich | 9000-71-9 | For blocking buffer preparation |
Grinding buffer (GB) | Note: solution | ||
Igepal CA-630 | Sigma aldrich | 9002-93-1 | For grinding buffer preparation |
KCl | Sigma aldrich | 7447-40-7 | For phosphate buffer saline preparation |
KH2PO4 | Sigma aldrich | 7778-77-0 | For phosphate buffer saline preparation |
Na2HPO4 | Sigma aldrich | 7558-79-4 | For phosphate buffer saline preparation |
NaCl | Sigma aldrich | 7647-14-5 | For phosphate buffer saline preparation |
NaOH | Sigma aldrich | 1310-73-2 | For blocking buffer preparation |
PBS-Tween | |||
Pf capture mAb | CDC | Pf-CAP | For capturing Pf circumsporozoite protein |
Pf peroxidase mAb | CDC | Pf-HRP | For detecting Pf circumsporozoite protein |
Pf positive control | CDC | Pf-PC | Pf positive control |
Phenol red | Sigma aldrich | 143-74-8 | For blocking buffer preparation |
Phosphate buffered saline (PBS) | Note: solution | ||
Positive controls | Note: solution | ||
Pv210 capture mAb | CDC | Pv210-CAP | For capturing Pv210 circumsporozoite protein |
Pv210 peroxidase mAb | CDC | Pv210-HRP | For detecting Pv210 circumsporozoite protein |
Pv210 positive control | CDC | Pv210-PC | Pv210 positive control |
Pv247 capture mAb | CDC | Pv247-CAP | For capturing Pv247 circumsporozoite protein |
Pv247 peroxidase mAb | CDC | Pv247-HRP | For detecting Pv247 circumsporozoite protein |
Pv247 positive control | CDC | Pv247-PC | Pv247 positive control |
Tween20 | Sigma aldrich | 9005-64-5 | For PBS-Tween preparation |
Consumables | |||
Disposable pipetting reservoirs | Generic | For working reagents | |
ELISA plates: 96 well clear round bottom PVS | Corning Life Science | 2797 | For ELISA |
Gloves: disposable gloves and freezer gloves | Generic | For personal protection | |
Lab gown | Generic | for personal protection | |
Multichannel Pipette P30-300 | Generic | For solution transfer | |
Pipette set, P2, P20, P200, and P1000 | Generic | For solution transfer | |
Pipette tips 10 µL, 200 µL, and 1000 µL | Generic | For solution transfer | |
Serological pipettes 5 mL, 10 mL | Generic | For solution transfer | |
Transfer pipettes | Generic | For solution transfer |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved