الكشف عن المتصورة Sporozoites في بعوض الأنوفيليس باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم

يصف هذا البروتوكول مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم الساندويتش للكشف عن سبوروزويتات الغدد اللعابية في البعوض. وباستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المتاحة بسهولة، تتيح هذه الطريقة الكشف الفعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية عن البعوض الذي يحمل المتصورة المنجلية أو المتصورة النشيطة. وهذه الطريقة مناسبة لبحوث انتقال الملاريا، بما في ذلك مسوحات النواقل.

المتصورة sporozoites هي المرحلة المعدية من طفيليات الملاريا التي تصيب البشر. تنتقل الأسبوغات الموجودة في الغدد اللعابية لأنثى بعوض الأنوفيليس إلى البشر عن طريق لدغات البعوض أثناء تغذية الدم. وبالتالي فإن وجود sporozoites في الغدد اللعابية للبعوض يحدد عدوى البعوض. لتحديد ما إذا كانت بعوضة الأنوفيليس تحمل المتصورة sporozoites ، كانت طريقة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) هي الأداة القياسية للكشف عن بروتين Plasmodium circumsporozoite (CSP) ، وهو البروتين السطحي الرئيسي لل sporozoites. في هذه الطريقة ، يتم فصل الرأس مع الصدر لكل بعوضة عن البطن ، وتجانسها ، وتعريضها لشطيرة ELISA للكشف عن وجود CSP خاص بالمتصورة المنجلية وكل من النوعين الفرعيين ، VK210 و VK247 ، من المتصورة النشيطة. وقد استخدمت هذه الطريقة لدراسة انتقال الملاريا، بما في ذلك الديناميات الموسمية لعدوى البعوض وأنواع ناقلات الملاريا الرئيسية في مواقع الدراسة.

Plasmodium sporozoites هي المرحلة المعدية من طفيليات الملاريا في البعوض. يتم تسليم sporozoites إلى البشر عن طريق لدغات البعوض. في البعوض ، تتشكل sporozoites أولا داخل البويضات على جدار الأمعاء الوسطى. بمجرد أن تصبح جاهزة ، يتم إطلاقها في الهيموكول والسفر إلى الغدد اللعابية البعوض. هناك ، تنضج وتصبح جاهزة للانتقال إلى البشر أثناء تغذية الدم. في البشر ، يتم ترسيب sporozoites في الأدمة. ثم يدخلون الأوعية الدموية ويسافرون على طول الدورة الدموية للوصول إلى الكبد لإثبات العدوى في خلايا الكبد ^1,2.

تم استخدام ثلاث طرق مختلفة لتحديد عدوى sporozoite للغدد اللعابية البعوضية. الطريقة الأولى هي تشريح الغدد اللعابية متبوعا بالفحص المباشر للسبوروزويتات تحت المجهر الضوئي. هذه الطريقة هي المعيار الذهبي للكشف عن الأسبوغية وقياسها في الغدد اللعابية للبعوض Anopheles ³. ومع ذلك ، فإنه يتطلب فنيا مدربا جيدا في كل من التشريح والفحص المجهري. علاوة على ذلك ، لا يمكن استخدامه لتحديد أنواع البلازموديوم والتنميط الفرعي ل CSP (ل P. vivax)^4,5. تستخدم الطريقة الثانية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) للكشف عن الحمض النووي للبلازميوم في الجزء العلوي من جسم البعوض⁶. بالنظر إلى خصوصية PCR ، فإن كلا من الأنواع والأنواع الفرعية للطفيلي ممكنة^7،8،9،10. على الرغم من استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل متزايد ، إلا أنه يتطلب معدات باهظة الثمن نسبيا وموظفين مدربين تدريبا جيدا. الطريقة الأخيرة ، ELISA للكشف عن بروتين محيطي البلازموديوم المحدد (CSP) ، كانت الدعامة الأساسية لمدة ثلاثة عقود^11،12،13. يوجد CSP في كل من البويضات sporozoites و sporozoites الغدد اللعابية^12،14. باستخدام أجسام مضادة محددة ، تسمح هذه الطريقة بتحديد أنواع البلازموديوم والتنميط الفرعي ل CSP ل P. vivax sporozoites. الأساس المنطقي لهذا الفحص هو اشتراط اختبار بسيط عالي الإنتاجية لفحص عدد كبير من البعوض البري لفهم انتقال الملاريا (أي تحديد معدل الإصابة بالأسبوروزويت).

تتميز طريقة ELISA بميزتين رئيسيتين على الفحص المجهري. أولا ، يسمح للباحثين بالاحتفاظ بعينات البعوض حتى تصبح جاهزة لمعالجة العينات. ثانيا ، يمكن استخدام طريقة ELISA للتمييز بين أنواع البلازموديوم من خلال الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة بالأنواع. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تستوعب ELISA عددا أكبر من عينات البعوض ، مما يسمح بإنتاجية أعلى بكثير¹⁵. بالمقارنة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل ، الذي يكتشف الحمض النووي للسبوروزويت ، يستغرق إجراء ELISA وقتا أطول ولكنه يكلف^{أقل 16}. تم تطوير اختبار ELISA الموصوف هنا لتحديد عدوى البعوض والكشف بشكل منفصل عن CSP من P. falciparum وكل من متغيري CSP من P. vivax و VK210 و VK247. تم استخدام طريقة ELISA هذه في العديد من الدراسات لتحديد الديناميات الموسمية لعدوى البعوض وتحديد أنواع ناقلات الملاريا الرئيسية في الحقل^{12،13،17،18}. لإجراء هذا الفحص ، يكفي وجود مختبر قياسي مجهز بقارئ لوحة ELISA.

يتم تلخيص النهج العام في الشكل 1. في شطيرة ELISA هذه ، يتم استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة الأساسي (التقاط) (mAb) الخاص بكل نوع / نوع فرعي من البلازموديوم لأول مرة لتغليف لوحة ELISA. كل لوحة مغلفة بالتقاط واحد mAb. وظيفة mAb هي التقاط مستضد CSP المقابل في متجانسات البعوض. بعد التقاط المستضد وغسل الصفيحة ، يتم استخدام جسم مضاد ثان خاص ب CSP يحمل علامة البيروكسيديز للكشف عن وجود CSP مرتبط ب mAb الملتقط. ينتج عن التفاعل الكيميائي الذي يحفزه البيروكسيديز تطور اللون في الآبار الإيجابية ل CSP.

1. إعداد الكواشف

ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للحصول على قائمة بالمعدات والكواشف والمواد الاستهلاكية الأخرى المستخدمة في هذا البروتوكول وإلى الجدول 1 للحصول على قائمة بالحلول وتكوينها.

1. التقاط و mAbs مترافق البيروكسيديز
   1. لإعادة تكوين mAb ، أعد تعليق mAb المجفف بالتجميد في خليط 1: 1 من الماء المقطر: الجلسرين عند 0.5 مجم / مل. قم بعمل الحصص حسب الحاجة لتجنب تكرار ذوبان الجليد ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.
2. حظر المخزن المؤقت (BB)
   1. قم بإعداد المخزن المؤقت للحظر عن طريق إذابة 5 جم من الكازين بدرجة ELISA في 100 مل من 0.1 N NaOH. أضف 900 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (انظر الجدول 1) ليصل الحجم النهائي إلى 1.0 لتر.
   2. أضف 0.02 جم من الفينول الأحمر كمؤشر واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك. قم بتخزين BB في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد ، أو القسمة إلى 50 مل للتخزين طويل الأجل عند -20 درجة مئوية.
3. الضوابط الإيجابية
   1. لإعادة تكوين الضوابط الإيجابية ، أعد ترطيب البروتينات المجففة بالتجميد بإضافة 1000 ميكرولتر من BB. قم بعمل حصص من حلول التحكم الإيجابي في المخزون حسب الحاجة ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.
   2. للتخفيف التسلسلي ، قم بتخفيف كل عنصر تحكم إيجابي إلى تركيز العمل النهائي في BB على النحو التالي: Pf ، 2 بيكوغرام / ميكرولتر ؛ الكهروضوئية (VK210) ، 182 (بيكوغرام / ميكرولتر) ؛ الكهروضوئية (VK247) ، 89 بيكوغرام / ميكرولتر.
      ملاحظة: قد يختلف بالضبط تركيزات الضوابط الموجبة من دفعة إلى أخرى. راجع ورقة معلومات المنتج لمعرفة التركيز الدقيق المطلوب. تركيزات التحكم الإيجابية ، بدءا من تركيز العمل أعلاه ، هي 2 ، 1 ، 0.5 ، 0.25 ، 0.13 ، 0.06 بيكوغرام / ميكرولتر ل Pf ؛ 182 ، 91 ، 46 ، 23 ، 11 ، 5.7 بيكوغرام / ميكرولتر ل PV210 ؛ و 89 ، 45 ، 22 ، 11 ، 5.6 ، 2.8 بيكوغرام / ميكرولتر PV247.
4. الضوابط السلبية
   ملاحظة: السيطرة السلبية المثالية هي تجانس الرأس والصدر لإناث بعوض الأنوفيلة المحضرة بشكل مماثل لعينات الاختبار. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام BB كعنصر تحكم سلبي.
   1. مع BB كعنصر تحكم سلبي ، استخدم عتبة الامتصاص 2 أضعاف للحصول على قراءات إيجابية موثوقة.

2. إعداد عينة البعوض

1. افصل الرأس والصدر لكل بعوضة بالغة تم جمعها عن البطن بشفرة حلاقة معقمة. ضع الرأس والصدر في أنبوب طحن بالطرد المركزي سعة 1.5 مل محدد مسبقا. تجمع الرؤوس والصدر لما يصل إلى 10 بعوض إذا رغبت في ذلك.
   ملاحظة: لإعداد العينة ، عادة ، سيتم تشريح الغدة اللعابية من البعوض المصاب وتعريضها ل CS-ELISA. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام رأس وصدر البعوض الذي تم جمعه لأداء CS-ELISA مباشرة (دون تشريح الغدد اللعابية)^12،13،19.
2. أضف 50 ميكرولتر من محلول الطحن (GB) في كل أنبوب وقم بتجانس العينة بمدقة نظيفة (مغسولة بالصابون). شطف المدقة المستخدمة مع 250 ميكرولتر من GB في الأنبوب الذي يحتوي على البعوض (البعوض) متجانسة إلى حجم نهائي من ~ 300 ميكرولتر.
3. احتفظ بالعينة في المجمد (-20 درجة مئوية) حتى الاستخدام أو تابع على الفور لإجراء ELISA.

3. سبوروزويت إليسا

1. املأ ورقة عمل sporozoite ELISA (انظر المادة التكميلية 1). قم بإعداد لوحة ELISA واحدة لكل CSP (Pf أو Pv-210 أو Pv-247).
2. تحضير محلول عمل mAb عن طريق إذابة الجسم المضاد في PBS: 4 ميكروغرام / مل Pf ؛ 2 ميكروغرام / مل PV-210 ؛ 2 ميكروغرام / مل من PV-247. احسب الأحجام المطلوبة بناء على إضافة 5 مل لكل لوحة. دوامة الحل بلطف.
3. ماصة 50 ميكرولتر من كل محلول mAb عامل من الخطوة 3.2 في كل بئر من لوحة ELISA. غطي الطبق بغطاء بلاستيكي واحتضانه لمدة 30 دقيقة أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
4. استنشق محتويات البئر واضغط على اللوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية 5 مرات على الأقل لإزالة كل السوائل.
   ملاحظة: في حالة عدم توفر نظام شفط (شفط فراغ متعدد القنوات متصل بأطراف نظيفة) ، فقم بتفريغ الأجسام المضادة في الحوض ثم انقر فوق اللوحة الموجودة على مناشف ورقية.
5. أضف 200 ميكرولتر من BB لملء جميع الآبار في اللوحة. غطي اللوحة بغطاء بلاستيكي. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. نضح أو تفريغ محتويات البئر. اضغط على اللوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية 5 مرات لإزالة كل السوائل.
6. تحميل متجانسة البعوض والسيطرة على لوحة على النحو التالي.
   1. أضف 50 ميكرولتر من التحكم الإيجابي إلى الآبار H1 و H2.
   2. أضف 50 ميكرولتر من BB إلى الآبار في العمودين 1 و 2 من الصف C إلى G. ثم أضف 50 ميكرولتر من التحكم الإيجابي في الآبار G1 و G2. قم بإجراء تخفيف تسلسلي للتحكم الإيجابي بدءا من G1 و G2 متبوعا ب F1 و F2 حتى C1 و C2.
      ملاحظة: يجب أن تحتوي جميع آبار التحكم الإيجابي على 50 ميكرولتر.
   3. أضف 50 ميكرولتر من BB (التحكم السلبي) إلى الآبار A1 و A2 و B1 و B2.
   4. أضف 50 ميكرولتر من كل عينة متجانسة إلى بئر غير معروف (Unk).
   5. غطي اللوحة واحتضانها لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
7. بعد حوالي 2 ساعة ، ابدأ في تحضير الركائز. بالنسبة لمجموعة الركيزة المكونة من 2 مكون من ABTS ، امزج الركيزة A والركيزة B بنسبة 1: 1.
   ملاحظة: تتطلب اللوحة الكاملة المكونة من 96 بئرا 5 مل من الركيزة A و 5 مل من الركيزة B.
8. قم بإعداد حلول العمل ل mAbs المسمى بالبيروكسيديز ل Pf و Pv-210 و Pv-247 عن طريق إضافة BB إلى mAb المترافق المعاد تشكيله للحصول على تركيز عمل قدره 1 ميكروغرام / مل.
   1. احسب الأحجام المطلوبة بناء على إضافة 5 مل من محلول mAb المترافق العامل لكل لوحة.
   2. اختبر نشاط البيروكسيديز عن طريق خلط 5 ميكرولتر من mAb المسمى بالبيروكسيديز المصنوع في الخطوة 3.8 مع 100 ميكرولتر من الركيزة المصنوعة في الخطوة 3.7 في أنبوب منفصل 1.5 مل. دوامة بلطف.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك تغيير سريع في اللون من واضح إلى أخضر ، مما يشير إلى أن إنزيم البيروكسيديز والركائز تعمل.
9. قم بشفط أو تفريغ محتويات البئر واضغط على اللوحة رأسا على عقب على مناشف ورقية 5 مرات لإزالة كل السوائل.
10. اغسل الآبار مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBS-Tween ، واستنشق محتويات البئر ، واضغط على اللوحة 5 مرات لكل منهما.
11. أضف 50 ميكرولتر من mAb المسمى بالبيروكسيديز المصنوع في الخطوة 3.8 إلى كل بئر. غطي اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. نضح أو تفريغ محتويات البئر واضغط على اللوحة رأسا على عقب على منشفة ورقية 5 مرات.
12. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر من PBS-Tween ، واستنشق محتويات البئر ، واضغط على اللوحة 5 مرات لكل منها.
13. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة المحضر في الخطوة 3.7 إلى كل بئر. غطي الطبق واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
14. بعد 30 دقيقة ، اقرأ الامتصاص عند 405-414 نانومتر باستخدام قارئ لوحة ELISA.
    ملاحظة: اتبع التعليمات المحددة لقارئ لوحات ELISA المستخدم. للحصول على تفاصيل حول التعليمات الخاصة بالبرنامج المستخدم لهذا البروتوكول ، راجع المواد التكميلية S2. يجب أن يكون هناك تغيير ملحوظ في اللون من واضح إلى أخضر في آبار التحكم الإيجابية.

4. التحليل

1. الكشف عن العينات الإيجابية.
   1. قم بتسمية العينات ذات قيم الامتصاص أعلى من الحد الفاصل (ضعف متوسط قيمة الامتصاص للعينات السالبة) على أنها موجبة.
2. القياس الكمي للطاقة الشمسية المركزة
   1. قم بتقدير تركيز CSP في العينة باستخدام المنحنى القياسي المبني من سلسلة تخفيف التحكم على النحو التالي.
      1. قم بإنشاء المنحنى القياسي عن طريق رسم قيم الامتصاص (المحور الصادي) لعناصر التحكم المخففة بشكل متسلسل مقابل تركيزاتها (المحور السيني).
      2. قم بإجراء الانحدار الخطي لتحديد أفضل ملاءمة باستخدام y = A + Bx ، حيث A و B معلمات مجانية.
      3. أوجد تركيز الطاقة الشمسية المركزة لكل عينة موجبة عن طريق حل معادلة قيمة امتصاص معطاة.

تظهر نتائج ELISA التمثيلية في الشكل 2. في هذه التجربة ، اكتشفت P. falciparum ELISA عدوى sporozoite في البئر A7. يمكن اكتشاف البئر الموجب بصريا من خلال لونه الأخضر الباهت (الشكل 2 أ). كانت قيمة امتصاص هذا البئر أعلى من عتبة القطع (ضعف القيمة المتوسطة لآبار التحكم السلبية الأربعة) (الشكل 2 ب). يوضح الشكل 2 ج توزيع قيم الامتصاص لجميع الآبار ال 80 غير المعروفة. يشير القياس الكمي ل CSP للبئر A7 بواسطة المنحنى القياسي داخل اللوحة بعد طرح الخلفية (التحكم السلبي) إلى تركيز CSP يبلغ 0.35 بيكوغرام / ميكرولتر (الشكل 2D). كانت مقايسات P. vivax ل VK210 و VK247 سلبية لمجموعة العينات هذه (البيانات غير معروضة) ، مما يشير إلى أن عدوى sporozoite في A7 كانت أحادية النوع P. falciparum.

الشكل 1: نظرة عامة على شطيرة CSP ELISA . (أ) يستخدم الجسم المضاد أحادي النسيلة المحدد (التقاط mAb) لتغطية سطح كل بئر. يرتبط مستضد CSP في تجانس البعوض بالآبار المطلية ب mAb. (ب) يستخدم mAb المسمى HRP للكشف عن Ag. الاختصارات التي تم التقاطها: CSP = بروتين محيطي ؛ ELISA = مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ؛ Ag = مستضد. mAb = جسم مضاد وحيد النسيلة ؛ HRP = بيروكسيديز الفجل. OD = الكثافة البصرية ؛ BB = حظر المخزن المؤقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: النتائج التمثيلية للكشف عن المتصورة المنجلية CSP. (أ) صورة لوحة ELISA بعد حضانة لمدة 30 دقيقة مع ABTS. يمثل السهم الأحمر والدائرة الحمراء البئر الموجب المجهول (A7). (ب) قيم الامتصاص التي يقرأها قارئ لوحة ELISA. كانت الآبار الأربعة العلوية اليسرى (A1 و A2 و B1 و B2) هي عناصر التحكم السلبية. تم تشغيل عناصر التحكم الإيجابية المخففة في نسختين: C1 / C2 (1:32) ، D1 / D2 (1:16) ، E1 / E2 (1: 8) ، F1 / F2 (1: 4) ، و G1 / G2 (1: 2). كانت الضوابط الإيجابية غير المخففة هي H1 / H2. ج: توزيع امتصاص 80 بئرا مجهولة. يمثل الخط المتصل متوسط امتصاص آبار التحكم السلبية. يمثل الخط المتقطع عتبة الإيجابية. (د) المنحنى القياسي المبني من التخفيف التسلسلي المزدوج للتحكم الموجب. كان أعلى تركيز للمراقبة الإيجابية 2 بيكوغرام / ميكرولتر. قدر الانحدار الخطي للبيانات تركيز الطاقة الشمسية المركزة في A7 ب 0.35 بيكوغرام / ميكرولتر. الاختصارات: CSP = بروتين محيطي. ABTS = 2،2'-أزينو دي- (3-إيثيل بنزثيازولين-6-سلفونات) ؛ ELISA = مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ؛ القيمة المطلقة = الامتصاص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: وصفات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

المادة التكميلية S1: ورقة عمل Sporozoite ELISA. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المواد التكميلية S2: إرشادات لبرنامج قارئ لوحة ELISA. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

يوفر CSP-ELISA طريقة محددة للغاية وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن البلازموديوم CSP. يسمح بالتمييز بين P. falciparum و P. vivax sporozoites وكذلك بين النوعين الفرعيين ، VK210 و VK247 ، من P vivax^{11،13،14،15}. يجب النظر في بعض النقاط الحرجة للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. يجب أن تبقى جميع الحلول في الثلاجة لمدة تقل عن 1 أسبوع لمنع نمو الميكروبات. يجب حفظ mAb في مادة مخففة تحتوي على 50٪ من الجلسرين و aliquote حسب الحاجة لمنع ذوبان الجليد المتعدد. يجب أن تكون الضوابط الإيجابية مقتبسة للاستخدام الفردي. يجب تغطية لوحة ELISA بالغطاء خلال فترة الحضانة لمنع التبخر. يجب تنفيذ الخطوات التي تنطوي على حضانة mAb المسمى بيروكسيديز في الظلام.

يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على تغيير المحلول بسرعة لمنع الجفاف ، مما قد يؤدي إلى خلفية عالية. يجب أن يبقى محلول الركيزة العاملة في الظلام عن طريق لفه بورق الألمنيوم وإضافته إلى اللوحة مباشرة بعد التحضير. عند العمل مع متجانسات البعوض المجمدة ، يجب اختبار العينات في نفس يوم الذوبان. يجب الحفاظ على الرقم الهيدروجيني للتفاعل في نطاق 7-7.4 حيث يتم تثبيط التفاعل عند قيم الأس الهيدروجيني خارج هذا النطاق. يجب أن يتم الغسيل بعناية لتجنب الإيجابيات الكاذبة. يمكن أن يؤدي تضمين المنظف غير الأيوني ، Tween-20 ، في محلول الغسيل إلى تقليل الإشارة من الخلفية.

() عدل هذا البروتوكول من البروتوكول الذي وصفه فيرتز ^{وآخرون.19}. أحد الاختلافات هو انخفاض عدد عناصر التحكم السلبية للسماح بالمنحنى القياسي المكون من ست نقاط. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تخفيف معايير البروتين بشكل متسلسل في BB دون تحلل البعوض. لذلك ، يختلف تكوين الخلفية عن تكوين عينات الاختبار. تستخدم هذه المعايير لتوفير تقدير كمي متسق ل CSP لعينات الاختبار عبر لوحات مختلفة. إذا كانت هناك حاجة إلى تقدير كمي أكثر دقة ، يمكن إعداد المعايير باستخدام محللة البعوض غير المصاب المعالج بشكل مماثل لعينات الاختبار ولكن مع إضافة كمية معروفة من البروتين. أخيرا ، كما هو الحال مع معظم المقايسات التشخيصية ، فإن CSP ELISA ليس خاليا من^{الأخطاء 20}. يجب تأكيد جميع العينات الإيجابية عن طريق تكرار الفحص مع التجانس المسخن (100 درجة مئوية ، 10 دقائق) أو بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بأنواع البلازموديوم ، باستخدام التجانس المتبقي كمصدر لقالب الحمض النووي²⁰.

عند تنفيذها بشكل صحيح ، يمكن أن تكون طريقة CSP ELISA هذه موثوقة للغاية. وقد تم استخدامه ، ومن المحتمل أن يستمر ، في العديد من الدراسات حول انتقال الملاريا ، بهدف تحديد الديناميات الموسمية لعدوى البعوض وتحديد أنواع ناقلات الملاريا الرئيسية^{12،13،17،18}. بالمقارنة مع الفحص المجهري المباشر لل sporozoites ، فإن هذا الفحص له إنتاجية أكبر بكثير وهو أكثر ملاءمة للبحث الذي يشمل عددا كبيرا من البعوض. بالمقارنة مع اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل للسبوروزويتات ، يستغرق إجراء ELISA وقتا أطول ولكنه يكلف^{أقل 16}. بشكل عام ، تسمح بساطته وإنتاجيته العالية وتكلفته المنخفضة نسبيا بإجراء اختبار واسع النطاق في مختبر قياسي.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

نشكر السيد كيراكورن كياتيبوتر ، MVRU ، على التدريب والتوجيه. ونشكر أيضا السيدة بينيابات كونغنغين، MVRU، على مساعدتها التقنية في إعداد الشكل 2. تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والمعهد الوطني للصحة (U19 AI089672).