Method Article
Bu protokol, proteotoksik antimikrobiyal ile tedaviden sonra Escherichia coli'den agrega ve çözünür proteinlerin çıkarılmasını ve görselleştirilmesini açıklar. Bu prosedürün ardından, farklı bakteri suşlarında ve/veya tedaviler arasında in vivo protein agrega oluşumunun nitel bir karşılaştırmasına izin verir.
Canlı organizmaların çevresel ve hücresel streslere maruz kalması genellikle protein homeostazında bozulmalara neden olur ve protein toplanmasına neden olabilir. Bakteri hücrelerinde protein agregalarının birikmesi, hücresel fenotipik davranışta büyüme oranlarında azalma, stres direnci ve virülans da dahil olmak üzere önemli değişikliklere yol açabilir. Bu stresör aracılı fenotiplerin incelenmesi için çeşitli deneysel prosedürler mevcuttur. Bu makalede, gümüş ruthenium içeren bir antimikrobiyal ile tedavi edildikten sonra farklı Escherichia coli suşlarından agrega ve çözünür proteinlerin çıkarılması ve görselleştirilmesi için optimize edilmiş bir test açıklanmaktadır. Bu bileşiğin reaktif oksijen türleri ürettiği ve yaygın protein toplamasına neden olduğu bilinmektedir.
Yöntem, protein agregalarının ve çözünür proteinlerin işlenmiş ve işlenmemiş hücrelerden santrifüj bazlı ayrıştırılmasını, sodyum dodecyl sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve Coomassie boyama ile daha sonra ayırma ve görselleştirme ile birleştirir. Bu yaklaşım basit, hızlıdır ve farklı E. coli suşlarında protein agrega oluşumunun nitel bir karşılaştırmasına izin verir. Metodoloji, diğer proteotoksik antimikrobiyallerin çok çeşitli bakterilerde in vivo protein toplama üzerindeki etkisini araştırma imkanı da dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalara sahiptir. Ayrıca, protokol proteotoksik maddelere karşı direncin artmasına katkıda bulunan genleri tanımlamak için kullanılabilir. Jel bantlar, özellikle toplanmaya eğilimli proteinlerin daha sonra tanımlanması için kullanılabilir.
Bakteriler kaçınılmaz olarak düşük pH da dahil olmak üzere sayısız çevresel strese maruz kalır (örneğin,memelimidesinde) 1,2, reaktif oksijen ve klor türleri (ROS/RCS) (örneğin, fagositlerde oksidatif patlama sırasında)3,4,5,yüksek sıcaklıklar (örneğin, kaplıcalarda veya ısı şoku sırasında)6,7ve birkaç güçlü antimikrobiyal (örneğin, bu protokolde kullanılan AGXX)8. Proteinler bu stresörlerden herhangi birine karşı özellikle savunmasızdır ve maruz kalma, proteinin toplanmasına neden olabilir. Tüm organizmalar protein yanlış katlama ile başa çıkmalarını sağlayan koruyucu sistemler kullanmaktadır9. Bununla birlikte, şiddetli stres protein kalite kontrol makinelerini bunaltabilir ve proteinlerin ikincil ve/veya üçüncül yapısını bozabilir ve sonuçta proteinleri devre dışı bırakabilir. Sonuç olarak, protein agregaları bakteri üreme ve hayatta kalma, stres direnci ve virülans için gerekli kritik hücresel fonksiyonları ciddi şekilde bozabilir10. Bu nedenle, protein toplama ve bakterilerdeki sonuçlarına odaklanan araştırmalar, bulaşıcı hastalık kontrolü üzerindeki potansiyel etkisi nedeniyle ilgili bir konudur.
Isı kaynaklı protein açma ve toplama genellikle geridönüşümlüdür 7. Buna karşılık, oksidatif stres gibi diğer proteotoksik gerilmeler, spesifik amino asit yan zincirlerinin oksidasyonu yoluyla geri dönüşü olmayan protein değişikliklerine neden olabilir ve bu da proteinin yanlış/ yanlış katlanmasına ve sonunda protein toplama4. Çözünmeyen protein agregalarının stres kaynaklı oluşumu, moleküler refakatçiler ve maya ve bakterilerdeki koruyucu işlevleri bağlamında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir11,12,13. Çözünmeyen protein agregalarının izolasyonu ve analizi için çeşitli biyokimyasal teknikler kullanan çeşitli protokoller yayınlanmıştır14,15,16,17. Mevcut protokoller esas olarak ısı şoku ve/veya moleküler refakatçilerin tanımlanması üzerine bakteriyel protein toplamayı incelemek için kullanılmıştır. Bu protokoller kesinlikle sahaya ilerlemekle birlikte, deneysel prosedürlerde bazı büyük rahatsızlıklar vardır, çünkü (i) hücre bozucuların, Fransız basınının ve/veya sonication14 , 15,17veya (iii) zaman alıcı tekrarlanan kullanımı da dahil olmak üzere 10 L 14,17, (ii) karmaşık fiziksel bozulma süreçlerine kadar büyük bir bakteri kültürü hacmi gerektirirler. yıkama ve kuluçka adımları15,16,17.
Bu makale, önceki yaklaşımların sınırlamalarını ele almayı amaçlayan ve proteotoksik antimikrobiyal yüzey kaplaması ile tedaviden sonra iki farklı Escherichia coli suşunda oluşan protein agregalarının miktarının analiz edilmesine izin veren değiştirilmiş bir protokolü açıklar. Kaplama, askorbik asit ile şartlandırılmış metal-gümüş (Ag) ve ruthenium (Ru) oluşur ve antimikrobiyal aktivitesi reaktif oksijen türlerinin üretilmesi ile elde edilir8,18. Burada, antimikrobiyal bileşik ile tedaviden sonra bakteri kültürünün hazırlanmasının ayrıntılı bir açıklaması ve antimikrobiyal konsantrasyonun artmasına karşı belirgin duyarlılık profillerine sahip iki E. coli suşunun maruz kalması üzerine protein toplama durumunun karşılaştırılması yer alıyor. Açıklanan yöntem ucuz, hızlı ve tekrarlanabilir ve diğer proteotoksik bileşiklerin varlığında protein toplamayı incelemek için kullanılabilir. Ek olarak, protokol, belirli gen silmelerinin çeşitli farklı bakterilerde protein toplama üzerindeki etkisini analiz etmek için değiştirilebilir.
1. E. coli suşlarının stres tedavisi MG1655 ve CFT073
Şekil 1: Escherichia coli stres tedavisi. Bakteri kültürleri MOPS-g'de yetiştirilir ve orta kütük fazı ulaştığında gümüş-ruthenium içeren antimikrobiyalin belirtilen konsantrasyonları ile tedavi edilir. Kısaltmalar: LB = lysogeny et suyu; Ag-Ru = gümüş-ruthenium; MOPS-g = 3-(N-morpholino)propansülofik asit (MOPS)-glikoz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Bakteri hücresi örneklerinin toplanması
Şekil 2: Bakteriyel numune toplama. Hücre örnekleri santrifüjleme ile toplanır ve lizis tamponunda yeniden depolanır ve ardından -80 °C'de depolanır.
3. Çözünmeyen protein agregalarının çıkarılması
Şekil 3: Çözünmeyen protein agregalarının ekstraksiyonu. Protein agregalarının çıkarılması, hücre bozulması, protein agregalarının çözünür proteinlerden ayrılması, membran proteinlerinin çözünmesi ve yıkanması dahil olmak üzere bir dizi adımı içerir. Kısaltma: SDS = sodyum dodecyl sülfat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Çözünür protein numunesi hazırlama
Şekil 4: Çözünür proteinlerin hazırlanması. Çözünür proteinin hazırlanması, trikloroasetik asit ile bir çökeltme adımı ve buz gibi aseton ile tekrarlanan yıkamayı içerir. Kısaltmalar: TCA = trikloroasetik asit; SDS = sodyum dodecyl sülfat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
5. SDS-PAGE kullanılarak çıkarılan protein agregalarının ayrılması ve görselleştirilmesi
Şekil 5: Protein ayırma ve görselleştirme. Örnekler SDS-PAGE ile ayrılır ve Coomassie boyama ile görselleştirilir. Kısaltma: SDS-PAGE = sodyum dodecyl sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Kommensal Escherichia coli suşu MG1655 ve UPEC suşu CFT073'te antimikrobiyal kaynaklı protein toplamanın temsili sonuçları. E. coli suşları MG1655 ve CFT073 belirtilen konsantrasyonlarla tedaviden önce MOPS-g ortamlarında 37 °C ve 300 rpm'de OD600= 0.5-0.55 arasında yetiştirildi (-, 0 mg/mL; +, 175 mg/mL; ++, 200 mg/mL) antimikrobiyal 45 dk. Çözünür ve çözünmeyen protein örnekleri protokolde açıklandığı gibi hazırlanmış ve Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3ve Şekil 4'te görselleştirilmiş ve %12 SDS poliakrilamid jel üzerinde görselleştirilmiştir (Şekil 5). Antimikrobiyal varlığında her iki suşta protein agrega oluşumu (çözünmeyen fraksiyon) artarken çözünür protein miktarları azaldı. Genel olarak, antimikrobiyal MG1655 üzerinde CFT073'ten çok daha güçlü bir etkiye sahipti. Kısaltmalar: M= Protein belirteci; UPEC = üropatojenik E. coli; MOPS-g = 3-(N-morpholino)propansülofik asit (MOPS)-glikoz; SDS = sodyum dodecyl sülfat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Burada, bu protokolü göstermek için proteotoksik gümüş-ruthenium içeren bir antimikrobiyal duyarlılığa karşı farklılık gösteren iki E. coli suşu kullanılmıştır. Ön sağkalım verileri, KOMMENSAL E. coli suşu MG1655'in ROS üreten antimikrobiyal için UPEC strain CFT073'ten (veriler gösterilmez) önemli ölçüde daha hassas olduğunu ortaya koydu. Her iki suş da MOPS-g ortamlarında 37 °C ve 300 rpm'de yetiştirildi. Orta kütük aşamasında, hücreler ya tedavi edilmez ya da antimikrobiyalin sırasıyla 175 μg/mL ve 200 μg/mL ile tedavi edilir ve 45 dakika inkübe edilir. Daha sonra, hücreler lised edildi ve hücresel protein agregaları çözünür proteinlerden ayrıldı. Her iki fraksiyondaki proteinler daha sonra SDS-PAGE ile ayrıldı ve Coomassie boyama ile görselleştirildi. Şekil 6'da gösterilen çözünmeyen fraksiyon, antimikrobiyal varlığında hücreler tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla inkübe edildiğinde artan protein agregalarının miktarını temsil eder. Protein agrega oluşumundaki artış, daha hassas olan MG1655 suşunda agrega oluşumunda çok daha belirgin bir artış tespit edilse de, gerinim arka planından bağımsızdı. Tersine, tedavi edilmeyen muadili ile karşılaştırıldığında hücrelerin antimikrobiyal tedavisinden sonra daha düşük miktarlarda çözünür protein (çözünür fraksiyon) gözlenmiştir. CFT073'te antimikrobiyal toleransın MG1655'ten önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösteren ön veriler göz önüne alındığında bu sonuç bekleniyordu.
Çözümleri | Tarifler |
Arabellek A | 10 mM potasyum fosfat (pH 6.5), 1 mM EDTA |
Arabellek B | %2 Nonidet P-40 içeren A tamponu. Daha sonra kullanmak üzere oda sıcaklığında saklanabilir. |
Fairbanks A (Boyama çözümü) | %25 izopropanol, %10 Buzul Asetik asit, 1,4 g Coommassie R-250 |
Fairbanks D (Destaining çözümü) | %10 Buzul asetik asit çözeltisi |
Lizis arabelleği | 10 mM potasyum fosfat (pH 6.5), 1 mM EDTA, %20 sakkaroz hazırlanabilir ve uzun süreli kullanım için oda sıcaklığında saklanabilir. Kullanmadan önce 1 mg/mL lysozyme ve 50 u/mL Benzonase taze ekleyin. |
MOPS-g medya | 100 mL 10x MOPS, 10 mL 0.132 M K2HPO4, 10 mL% glikoz, 0.5 mL 20 mM tiamin. DDH 2 O ve steril filtre ile1L'ye kadar doldurun |
1x SDS örnek arabelleği | 6.5 mM Tris-HCl (pH 7), %10 gliserol, %2 SDS, %0.05 bromofenol mavisi ve %2.5 β-mercaptoethanol. -20 °C'de saklanır. |
%12 SDS poliakrilamid jel hazırlama (2 jel için) | Ayırma jeli: 5.1 mL ddH2O, 3,75 mL Tris-HCl (pH 8,8), 75 mL %20 w/v SDS, 6 mL %30 Akrilamid/Bisacrylamide çözeltisi 29:1 çözelti, 75 mL %10 w/v amonyum persülfate, 10 mL TEMED |
İstifleme jeli: 1.535 mL ddH2O, 625 mL Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 mL %20 w/v SDS, 335 mL %30 Akrilamid/Bisacrylamide çözeltisi 29:1 çözelti, 12.5 mL %10 w/v amonyum persülfat, 2.5 mL TEMED | |
Arabellek çalıştıran SDS | 25 mM Tris, 192 mM Glisinin% 0.1 SDS DDH2O.'da oda sıcaklığında depolayın. |
Tablo 1: Arabellek, Ortam ve Çözümler. Bu protokolde kullanılan arabellek, ortam ve çözüm tarifleri.
Bu protokol, farklı E. coli suşlarının proteotoksik bir antimikrobiyal ile tedavisinden sonra protein agrega oluşumunun analizi için optimize edilmiş bir metodolojiyi açıklar. Protokol, tedavi edilen ve işlenmemiş E. coli hücrelerinden çözünmeyen ve çözünür protein fraksiyonlarının aynı anda çıkarılmasını sağlar. 14 , 15 , 16,20hücrelerinden protein agrega yalıtımı için mevcut protokollerle karşılaştırıldığında, bu yöntemin birkaç avantajı vardır: (i) sadece küçük kültür hacimlerine (4-8 mL) ihtiyaç vardır; (ii) hücre bozulması işlemi Fransız basını, hücre bozucu veya sonicator gibi özel ekipmanlara dayanmaz; ve (iii) protokolün, alanında nispeten erken kariyerli bilim adamları için bile takip etmesi kolaydır.
Bakteriler doğal ortamlarında sayısız stresle karşılaşırlar ve birçoğu, özellikle hücredeki en bol makromolekül olan proteinler için bir tehdit oluşturur21. Açıklanan metodoloji birçok olası uygulama sunar. Bunlardan biri, çok çeşitli streslerin (örneğin, yüksek sıcaklıklar, reaktif oksijen türleri, reaktif klor türleri) ve kimyasal bileşiklerin bakterilerde, arkealarda ve hatta ökaryotik hücrelerde protein homeostazını etkilediği etkinliği araştırma imkanıdır5,12,22,23. Ekstraksiyonumuz, uzaktan ilişkili iki E. coli suşu, MG1655 ve CFT073 ile gerçekleştirildi. Bununla birlikte, vahşi tip ve mutant suşlarında protein agrega oluşumunu karşılaştırarak protein homeostazı için spesifik gen ürünlerinin rolünü incelemek için de başarıyla uygulanmıştır11,12.
Büyüme koşullarının ve stresör konsantrasyonlarının uygun modifikasyonları ve sorun gidermeleri göz önünde bulundurulduktan sonra, bu protokol diğer Gram-negatif5 ve Gram-pozitif bakterilerde protein agrega oluşumunu belirlemek için de kullanılabilir8. Özellikle, SDS-PAGE'den sonra ayrılan jel bantları densitometrik olarak analiz edilebilir (yani ImageJ kullanılarak). Bu yaklaşım, moleküler refakatçilerin inhibitörleri gibi ek terapötik bileşiklerin etkisini analiz etmek için de kullanılabilir24. En ilgi çekici olanı, sadece çözünmeyen protein fraksiyonu 5,15'tekivarlıklarını veya yokluklarını belirleyerek, belirli bir stres koşulu altında toplamaduyarlı protein türlerinin türü hakkında bilgi sağlamak için kütle spektrometrik yaklaşımları ile birleştirilebilir.
Bu protokolün başarısı, hücrelerin maruz kaldığı stresör konsantrasyonlarının ve maruziyetin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirir. Bu nedenle, proteotoksik konsantrasyonu belirlemek için artan stresör konsantrasyonları ile bir ön sağkalım testi yapmanızı öneririz. Ayrıca, stresör çözümleri her deneyden önce taze olarak hazırlanmalı ve numune toplama süreleri tutarlı tutulmalıdır. Bu yöntemin bir sınırlaması, aynı anda işlenebilen düşük sayıda örnektir. Bunun başlıca nedeni, sedimentasyonu önlemek için bileşiğin kültürlere eklenmesi arasında antimikrobiyal çözeltinin önemli girdap adımlarını içeren bölüm 1'deki örneklerin zamana duyarlı işlenmesidir. Ancak, farklı çözünür stresörler uygulandığında bu böyle bir sorun olmayabilir. Ayrıca, açıklanan prosedür protein toplam konumu ve yörüngesi hakkında zaman aşımına neden olan herhangi bir bilgi sağlamaz, bu da zaman atlamalı mikroskopi25ile birlikte floresan mikroskopisi gibi daha ileri teknikler gerektirir. Özetle, geliştirilmiş metodoloji basit, takip edilmesi kolay, ucuzdur ve proteotoksik bileşikleri veya bakteriyel stres tepki genlerini tanımlamak için özel bir yaklaşım sağlayan ek modifikasyon potansiyeli sunar.
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Bu çalışma Illinois State University School of Biological Sciences başlangıç fonları, Illinois State University New Faculty Initiative Grant ve NIAID hibesi R15AI164585 (J.-U.'ya) tarafından desteklendi. D.). G.M.A., Illinois State Üniversitesi Lisans Araştırma Destek Programı (G.M.A.'ya) tarafından desteklendi. K. P. H., Alman Akademik Değişim Servisi (DAAD) tarafından sağlanan rise bursu ile desteklendi. Yazarlar, AGXX tozunu sağladıkları için Largentech Vertriebs GmbH'den Dr. Uwe Landau ve Dr. Carsten Meyer'e teşekkür ediyor. Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4ve Şekil 5 Biorender ile oluşturulmuştır.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals/Reagents | |||
Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
Material/Equipment | |||
Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır