İskemi/Reperfüzyon Porsin Modelinde Omurilik Mikroperfüzyonunun Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi

Omurilik mikroskrkülasyonu omurilik yaralanmasında önemli bir rol oynar. Çoğu yöntem, mikroskrkülasyon hedefli tedavilerin geliştirilmesi için gerekli olan omurilik mikroskrkülasyonunun gerçek zamanlı değerlendirilmesine izin vermez. Burada, büyük bir iskemi /reperfüzyon hayvan modelinde Lazer-Doppler-Akış İğne probları kullanarak bir protokol öneriyoruz.

Omurilik yaralanması aort onarımının yıkıcı bir komplikasyonudur. Omurilik hasarının önlenmesi ve tedavisine yönelik gelişmelere rağmen, görülme sıklığı hala oldukça yüksektir ve bu nedenle hasta sonucunu etkiler. Mikroskrkülasyon doku perfüzyonu ve oksijen temininde önemli bir rol oynar ve genellikle makrohemodynamiklerden ayrışır. Bu nedenle, omurilik mikroskrkülasyonunun doğrudan değerlendirilmesi, mikrosilkülasyon hedefli tedavilerin geliştirilmesi ve omurilik mikroskrkülasyonu ile ilgili mevcut yaklaşımların değerlendirilmesi için gereklidir. Bununla birlikte, yöntemlerin çoğu omurilik mikroskrkülasyonunun gerçek zamanlı değerlendirmesini sağlamaz. Bu çalışmanın amacı, doğrudan omuriliğe yerleştirilen lazer-Doppler iğne probları kullanılarak gerçek zamanlı omurilik mikrosikülatör değerlendirmesi için standartlaştırılmış bir protokolü tanımlamaktır. Omurilik mikroserkülasyonunun bozulmasını sağlamak için bir porcine iskemi/reperfüzyon modeli kullandık. Ayrıca floresan mikrokürez enjeksiyon tekniği kullanılmıştır. Başlangıçta, hayvanlar uyuşturuldu ve mekanik olarak havalandırıldı. Daha sonra lazer-Doppler iğne probu yerleştirilmesi, ardından beyin omurilik sıvısı drenajının yerleştirilmesi gerçekleştirildi. Aort çapraz kenetleme yapmak için alçalan aortun maruz kalması için ortanca sternotomi yapıldı. İskemi/reperfüzyon, toplam 48 dk supra-çölyak aort çapraz kenetlenmesi ile indüklendi, ardından reperfüzyon ve hemodinamik stabilizasyon yapıldı. Lazer-Doppler Flux makrohemodynamik değerlendirmeye paralel olarak gerçekleştirildi. Ek olarak, stabil bir beyin omurilik basıncını korumak için otomatik beyin omurilik sıvı drenajı kullanılmıştır. Protokolün tamamlanmasının ardından hayvanlar kurban edildi, histopatolojik ve mikrosfer analizi için omurilik hasadı yapıldı. Protokol, lazer-Doppler probları kullanılarak omurilik mikroperfüzyon ölçümlerinin fizibilitesini ortaya koymakta ve iskemi sırasında belirgin bir azalmanın yanı sıra reperfüzyon sonrası iyileşme göstermektedir. Sonuçlar floresan mikroküreci değerlendirme ile karşılaştırılabilir davranış gösterdi. Sonuç olarak, bu yeni protokol iskemi/ reperfüzyon koşullarında gerçek zamanlı omurilik mikroperfüzyon değerlendirmesi kullanılarak gelecekteki çalışmalar için yararlı bir büyük hayvan modeli sağlayabilir.

İskemi/reperfüzyon (SCI) ile indüklenen omurilik hasarı, aort onarımınınazaltılmış sonuç 1 , 2^,3,4ile ilişkili en yıkıcı komplikasyonlarından biridir. SCI için mevcut önleme ve tedavi seçenekleri arasında makrohemodynamik parametrelerin optimizasyonu ve omurilik perfüzyon basıncını iyileştirmek için beyin omurilik sıvı basıncının (CSP) normalleştirilmesi 2 ,^5,6,7,^8,9bulunur. Bu manevraların uygulanmasına rağmen, SCI insidansı hala aort onarımının karmaşıklığına bağlı olarak% 2 ila%³¹arasında değişmektedir 10^,11,12.

Son zamanlarda, mikrosirkülasyon artan dikkat kazanmıştır^13,14. Mikroskrkülasyon hücresel oksijen alımı ve metabolik değişim alanıdır ve bu nedenle organ fonksiyonu ve hücresel bütünlükte kritik bir rol oynar¹³. Bozulmuş mikrosirkülatör kan akışı, artan mortalite^{15 , 16 , 17 , 18,19}ile ilişkili doku iskemisinin önemli bir belirleyicisidir. Omurilik mikrosirkülasyonunun bozulması, nörolojik fonksiyonun azalması ve sonucu^{20 , 21,22,23}ile ilişkilidir. Bu nedenle, SCI tedavisi için mikroperfüzyonun optimizasyonu en umut verici bir yaklaşımdır. Makrosikülatör optimizasyonuna rağmen mikro sirkülatör bozuklukların kalıcılığı^{26 , 27,28,29}olarak tanımlanmıştır. Bu hemodinamik tutarlılık kaybı, iskemi/reperfüzyon dahil olmak üzere çeşitli koşullarda sıklıkla meydana gelir ve doğrudan mikro sirkülasyon hedefli tedavilere duyulan ihtiyacı vurgular^26,27,30.

Şimdiye kadar, sadece birkaç çalışma omurilik mikro sirkülatör davranışının gerçek zamanlı değerlendirilmesi için lazer-Doppler probları kullandı^20,31. Mevcut çalışmalar genellikle aralıklı kullanım ve ölüm sonrası analiz ile sınırlı olan mikroküreci enjeksiyon tekniklerini kullanmıştır^32,33. Mikroküreç enjeksiyon tekniği kullanılarak yapılan farklı ölçümlerin sayısı, farklı dalga boylarına sahip mikrokürelerin mevcudiyeti ile sınırlıdır. Ayrıca, Lazer-Doppler tekniklerinin aksine, bu yöntem için ölüm sonrası doku işleme ve analize ihtiyaç duyulduğu için mikroperfüzyonun gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesi mümkün değildir. Burada, bir porcine büyük hayvan modeli olan iskemi/reperfüzyonda omurilik mikroskrkülasyonunun gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesi için deneysel bir protokol sunuyoruz.

Bu çalışma, kristaloidlerin ve kolloidlerin iskemi/reperfüzyondaki mikroserkülasyon üzerindeki etkisini karşılaştıran randomize bir çalışmanın yanı sıra sıvıların ve vazopresörlerin omurilik mikroperfüzyonu üzerindeki etkileri üzerine yapılan keşifsel randomize bir çalışmanın bir parçasıydı. Akış probu 2 noktalı kalibrasyon ve basınç ucu kateter kalibrasyonu daha önce^{tanımlanmıştır 34}. Bildirilen protokole ek olarak, floresan mikroküreler, daha önce açıklandığı gibi, her hayvan için 12 omurilik dokusu örneği kullanılarak, üst omuriliği temsil eden 1-6 ve alt omuriliği temsil eden 7-12 örnekleri kullanılarak omurilik mikroperfüzyonunun ölçümü için kullanılmıştır^35,36. Lazer-Doppler kayıtları ve makrohemodynamik değerlendirmenin tamamlanmasından sonra her ölçüm adımı için mikrosfer enjeksiyonu yapıldı. Histopatolojik değerlendirme daha önce açıklandığı gibi Kleinman-Score kullanılarak yapıldı³⁷.

Çalışma Hamburg ŞehriNin Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Hükümet Komisyonu tarafından onaylanmıştır (Referans-No. 60/17). Hayvanlar, 'Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu' (NIH yayını No. 86-23, revize edilmiş 2011) ve FELASA önerileri ve deneyleri ARRIVE yönergeleri^24,25uyarınca yapılmıştır. Bu çalışma akut bir denemeydi ve protokolün sonunda tüm hayvanlar ötenaziye tabi tökezlendi.

NOT: Çalışma yaklaşık 40 kg ağırlığında altı üç aylık erkek ve dişi domuzlarda (Alman Landrace) gerçekleştirildi. Hayvanlar deneylerden en az 7 gün önce hayvan bakım tesislerine getirildi ve hayvan refahı önerileri doğrultusunda barındırıldı. Hayvanlara mama ve su ad libitum sağlandı ve sağlık durumları sorumlu veteriner tarafından düzenli olarak değerlendirildi. Deneylerden önce 12 saat oruç tutma süresi korunmuştu. Hayvanların tüm deneysel prosedürü ve kullanımı sorumlu veteriner tarafından denetlendi.

1. Anestezi indüksiyonu ve anestezinin bakımı

1. Anestezi indüksiyonu ve anestezinin sürdürülmesi için, endotrakeal entübasyon yapmak için gerekirse intravenöz enjeksiyonlar ile takip edilen intramüsküler enjeksiyon kullanarak hayvanları önceden planlayın ve derinden yatıştırın. Bundan sonra, ek bir opioid bolus enjeksiyonu ile tamamlanan sürekli bir opioid uygulaması ile uçucu bir anestezi ajanının bir kombinasyonunu kullanarak anesteziyi teşvik edin ve koruyun.
2. Premedikasyon ve sedasyon için ketamin 20 mg·kg^-1, azaperone 4 mg·kg^-1ve midazolam 0.1 mg·kg^-1 kas içi enjeksiyonları gerçekleştirin.
3. Bir kulak damarı içine venöz kateter yerleştirin, uygun sabitlemleri güvence altına alın ve 10 mL tuzlu su hızlı bir şekilde uygulanarak işlevselliği değerlendirin.
4. Isı kaybını önlemek için hayvanı ısınan bir battaniyeye supine pozisyonuna yerleştirin.
5. Hayvanların kardiyo-pulmoner durumunu izlemek için elektrokardiyografi (EKG) ve nabız oksimetresi ile temel izlemeyi oluşturun ve temel izleme donanımına bağlayın.
6. Preoksijenasyon için domuz şeklinde bir maske ile 15 L·dk^-1 oksijen verin.
7. Gerekirse 0.1 mg·kg^-1%1 propofol intravenöz boli enjekte edin ve endotrakeal entübasyon gerçekleştirin.
8. Uç gelgit kapnografisi ve auscultation ile doğru yerleşimi sağlayın, 0,1 mg•kg^-1 panküronyum verin ve endotrakeal tüpün uygun şekilde sabitlenmesini sağlayın.
9. Anestezi makinesini kullanarak 10 mL·kg^-1 vücut ağırlığı^-1gelgit hacimleri, 10 cmH 2 O pozitif uç ekspirasyon basıncı ve_0,3'lükilham verici oksijenin (FiO₂₎bir kısmını kullanarak hacim kontrollü havalandırma oluşturun. 35-45 mmHg'lik bir uç ekspiratuar karbondioksit gerilimini (etCO₂₎korumak için ventilatör frekansını ayarlayın.
10. Bir mide tüpü tanıtın, mide sıvılarının emişini gerçekleştirin, tüpü düzgün bir şekilde sabitlayın ve bir toplama torbasına bağlayın. Anestezi sırasında gözlerin kurumasını önlemek için hayvanın gözlerini dikkatlice kapatın.
11. Fentanil (10 μg·kg -1 ·h^-1)ve sevoflurane (%3,0 süresi dolmuş konsantrasyon, buhar tarafından teslim edilir) sürekli infüzyonu ile anesteziyi koruyun. Tüm protokol sırasında herhangi bir hareketin olmamasının yanı sıra hayati belirtilerin ve ventilasyon parametrelerinin dikkatli bir şekilde gözlemlenmesi ve cerrahi uyaranın evrelerine özel dikkat larak yeterli anestezi seviyesini sağlayın. Ağrı veya sıkıntı belirtisi varsa ek bolus dozlarında fentanil (50 μg) verin.
    NOT: Tüm prosedür boyunca hayvan anestezisinde deneyimli araştırmacıların varlığını sağlayın ve uygun anesteziyi güvence altına almak için deneyimli bir veteriner tarafından gözetim kullanın.
12. Anestezi, cerrahi hazırlık ve deneysel protokolün uygulanması sırasında sıvı kayıplarını telafi etmek için¹⁰mL·kg -1 ·h^-1 dengeli kristaloidler taban çizgisi infüzyon oranı uygulanır. Isı kaybını önlemek için bir sıvı ısıtıcı kullanın.
13. Sabun suyu kullanarak domuzun derisini hafifçe temizleyin. Cilt kirlenmesini azaltmak için povidon-iyot içeren bir cilt dezenfeksiyon çözeltisi kullanın. Cerrahi preparatlar için steril eldiven kullanın. Antimikrobiyal profilaksi olarak 300 mg klindamisin uygulayın ve 6 saat sonra dozrayı tekrarlayın.

2. Prob yerleşimi

1. Hayvanı sağ yanal konuma yerleştirin ve omurlar arasındaki boşluğu genişletmek için hayvanın sırtını esnetin.
2. Dikenli proseslerin ve omur kemerlerinin hazırlanması için paravertebral alanı cerrahi olarak maruz bırakmak (Şekil 1A).
3. Omurlara torasik omur (Th) 13/14 veya bel omur (L) 1/2 düzeyinde iki omur kemeri(Şekil 1B)arasında vasküler 14 G periferik kateter paramedian yerleştirin.
4. İğneyi çıkarın, lazer/Doppler iğne probını damar kateterinin üzerine yerleştirin (Şekil 1C) ve belirlenen sert ve yazılıma bağlanarak sinyal kalitesini test edin. Orta derecede pulsatiliteli kararlı bir sinyal olduğundan emin olun.
5. Probu dikişlerle dikkatlice sabitleyin (Şekil 1D) ve probun yerinden çıkmasını veya bükülmesini önlemek için dolgu kullanın.
6. Beyin omurilik basıncını ölçmek ve kontrol etmek için beyin omurilik sıvı drenajının perkütan yerleşimi için L 4/5 veya L 5/6 seviyesini tanımlayın, cildi ve deri altı boşluğu indeksleyici iğne ile delin ve kakma iğnesini çıkarın.
7. İğneye tuzlu su dolu bir şırınga yerleştirin ve iğneyi sıvı dolu şırıngaya sabit basınçla dikkatlice sokun.
8. Bir direnç kaybı epidural pozisyon için kanıt olarak hissedildikten sonra, kakma iğnesini yeniden tanıtın ve dura mater'i delmek ve kakma iğnesini çıkarmak için iğneyi 2-3 mm daha sokun.
9. Temiz likörün hızlı damlatılarak intratekal konumunu doğrulayın. Drenajı 20 cm derinliğe kadar tanıtın, Luer-lock adaptörünü takın ve dikkatli bir likör aspirasyonu ile pozisyonu doğrulayın.
10. Drenajı dikişlerle dikkatlice sabitleyin ve beyin omurilik sıvısı drenaj sistemine bağlayın.
11. Kafatasını sol kulağın arkasına maruz bırak ve 6 mm matkap ataşmanı kullanarak cildin matkap deliği trepanasyonunu dikkatlice gerçekleştirin.
12. İkinci bir lazer doppler prob doğrudan beyne tanıtın. Probu dikişlerle dikkatlice sabitle ve belirlenen sert ve yazılıma bağlanarak sinyal kalitesini test edin. Yine, orta derecede pulsatiliteli kararlı bir sinyal olduğundan emin olun.
13. Tüm probların bağlantısını kesin, hayvanı dikkatlice bir destek konumuna yerleştirin ve etkilenmemiş prob konumunu sağlayın. En az 4-5 araştırmacının bu manevrayı yaptığından emin olun.
14. Probları yeniden bağlayın ve sinyal kalitesini yeniden kontrol edin.
15. Lazer-Doppler donanımının çıkış kanallarını amplifikatöre ve senkronik alım donanımına ve yazılımına bağlayarak lazer/Doppler Flux'u makrohemodynamik sinyallerle aynı anda kaydedin.
16. Akı'yı 2 noktalı kalibrasyon ile üniteye (PU) göre kalibre edin.
    1. Menüyü açmak ve analog çıkış ayarını seçmek için Enter tuşuna basın.
    2. Flux'u senkronik satın alma yazılımıyla kullanılmak üzere 2 nokta kalibrasyonla kalibre etmek için görüntülenen dönüştürme faktörünü (5.0 V = 1000 PU)kullanın.
    3. Önceki menüye dönmek için İade Et'i seçin ve ölçüme devam etmek için Ölçü'nün öğesini seçin.
    4. Senkronik alma yazılımını açın. Kurulum menüsünden tüm girişleri sıfır olarak seçin. Tüm girişleri kullanılan cihazlara ve problara bağlayın.
    5. Flux kanalınınaçılır menüsüne tıklayarak Flux için 2 noktalı kalibrasyon gerçekleştirin. 2 noktalı kalibrasyon seçin. Birimleri dönüştürmeyi açık olarak ayarlayın ve birim olarak BPU'yu seçin. Nokta 1için, 0 V'yi 0 BPU olarak ayarlayın. Nokta 2 için, 5.0 V'yi 1000 BPU olarak ayarlayın. Tüm ve yeni verileriçin birimleri ayarla 'yı seçin. Menüyü kapatmak için Tamam'a basın.
17. 10 mmHg hedef basınç ve 20 mL·h^-1drenaj hacmi ile sürekli beyin omurilik sıvı drenajı başlatın.

3. Kateter yerleşimi

1. Her iki uyluk atardamarını da açığa çıkar.
2. Sağ femoral arterin distal kısmını bağlayın, bir damar döngüsü kullanarak atardamarın proksimal lümenini geçici olarak tıkayın, bir Potts makası kullanarak damarın 2 mm'lik bir kesimini gerçekleştirin ve kılavuz teli tanıtın.
3. Kılavuz teli daha fazla tanıtın, dirençsiz yerleştirme sağlayın ve telin bükülmesini önleyin; kateteri telin üzerine tanıtın.
4. Kateteri dikişlerle sabitle.
5. Kan basıncına uygun bağlantı ve trans-kardiyopulmoner izleme sert ve yazılımdan sonra kan gazı analizi ve arteriyel sinyal ölçümü ile doğrulanan arteriyel kanın aspirasyonu ile doğru pozisyonu sağlayın.
6. Sol uyluk atardamarı üzerine 5 mm'lik bir akış probu yerleştirin ve akış cihazına bağlanarak sinyal kalitesini test edin.
7. Her iki kasıkları dikişlerle kapatın.
8. 8 Fr. indeksleyici kılıtların yerleştirilmesi için doğru şahdamarının yanı sıra sağ iç juguler damarı da açığa çıkarın.
9. Kateter yerleşimi için, 3.2-3.4'te açıklanan şekilde devam edin.
10. Şahdamar indirgisi kılıbının yan lümenini, arteriyel basınç ölçümü için temel basınç izleme ve pulmoner termodilüzasyon donanımına bağlayın.
11. Yükselen aort içine bir basınç ucu kateteri sokun ve amplifikatöre ve senkron alım sert ve yazılıma bağlanarak konumu doğrulayın.
12. Balonu 20 cm derinlikte hava ile şişirerek ve hemodinamik eğride kama basıncı görülene kadar hafifçe yerleştirerek pulmoner arterdeki venöz kılıt üzerinden bir Swan-Ganz pulmoner arter kateteri yerleştirin. Balonu söndür ve kateteri 2 cm geri çekin. Pulmoner arter basıncının tatmin edici sinyal kalitesini sağlayın. Termistörleri temel basınç izleme ve pulmoner termodilüzyon donanımına bağlayın.
13. İlaç kullanımı için 12 Fr. 5-Lumen merkezi venöz kateterin perkütan yerleşimi ve dış sağ şahdamarına merkezi venöz basınç ölçümü için sonografik rehberlik kullanın. Sonografik yerleştirme için 6 adım yaklaşımını kullanın³⁸
14. Kateterin distal lümenini kan basıncına ve trans-kardiyopulmoner izleme sert ve yazılıma bağlayın. Tüm ilaçları ve infüzyonları merkezi venöz katetere geçirin. Analjezikler, sıvılar ve katekolaminler için farklı lümenler kullanın ve hacim yükleme adımları sırasında kolloidlerin yönetimi için büyük lümeni ayırın.

4. Cerrahi hazırlık

1. Mini laparotomi gerçekleştirin, mesaneyi harekete geçirin, idrar drenajı için bir foley kateteri yerleştirin, balonu salinle şişirin ve kateteri kese dikişleriyle sabitleyin.
2. Kateteri idrar miktarını mL olarak gösteren bir idrar toplama torbasına bağlayın.
3. FiO_2'yi 1.0'a çıkarın ve 0.1 mg·kg^-1 panküronyumu intravenöz olarak yeniden uygulayın.
4. Sternuma hazırlık için elektrokoter kullanarak ortanca sternotomi gerçekleştirin. Sternumu çevre dokudan hafifçe parçalara temizleyin. Yaralanmaları önlemek için kompresin retrosternal yerleşimini gerçekleştirin.
5. Havalandırmayı durdurun ve kemiği salınımlı bir testere ile bölün. Havalandırmaya devam edin ve FiO_2'yi 0,3'e düşürün. Kanamayı azaltmak için elektrokoter kullanın ve sternumu kemik balmumu ile kapatın.
6. Sol akciğerin tepesini dikkatlice harekete geçirin ve cerrahi maruziyeti kolaylaştırmak için diyaframın sol yan kısmını bölün.
7. Sol akciğerin hafifçe geri çekilmesiyle azalan aort proksimalini çölyak gövdesine maruz bırakarak bozulmamış havalandırmayı sağlayın ve sol akciğerde travmayı önleyin (Şekil 2A) ve çevre dokuyu bölün (Şekil 2B). Hemodinamik stabilizasyon gerekiyorsa 7 mL·kg^-1 hidroksiyetil nişaste kolloidi uygulayun.
8. Uygun pozlamayı sağlamak için azalan aortun etrafına bir fazla tutma yerleştirin (Şekil 2C).
9. Azalan torasik aortun etrafına bir akış probu takın (Şekil 2D). Akış modülüne ve senkron alım sert ve yazılıma bağlanarak uygun sinyal kalitesini sağlayın. Gerekirse sinyal kalitesini artırmak için kontak jeli kullanın.
10. Aort çapraz sıkıştırma alanını işaretlemek için akış probuna distal olarak alçalanın aortunun etrafına bir damar halkası takın.

5. Değerlendirme ve veri toplama

1. Doğru atriyal seviyeye yerleştirilmiş sıvı dolu çizgiler kullanarak tüm kateterleri ve seviye kateterlerini sıfır.
2. İğne EKG elektrotlarını yerleştirin ve senkronik edinme sert ve yazılıma bağlayın.
3. Trans-kardiyopulmoner termodilüzasyonun yanı sıra aort akışı ve basınç ölçümlerinin değerlendirilmesi daha önce tanımlanmıştır ³⁴.
4. Pulmoner arter termodilüsyon kullanarak kardiyak çıkış ölçümü için 10 mL soğuk salin ile 3 enjeksiyon yapın ve temel izleme donanımı tarafından görüntülenen ortalama değeri not edin.
5. Sadece Başlat tuşuna basarak lazer-Doppler yazılımını başlatınve adımları M0 ila M5olarak dikkatlice etiketleyerek her ölçüm adımı için bir işaret ayarlayın.

6. Deneysel protokol

1. Taban çizgisi ölçümleri (M0) gerçekleştirin.
2. 7 mL·kg^-1 hidroksiyetil nişaste kolloid hacim yükleme adımlarını kullanarak hemodinamik optimizasyon gerçekleştirin. Basınçlı infüzyonları kullanarak 5 dakika boyunca her birim yükleme adımlarını gerçekleştirin. Her hacim yükleme adımı tamamlandıktan sonra, denge için 5 dakika bekleyin. Kardiyak çıkıştaki artış %15 < olana kadar hacim yüklemeye başlayın.
3. Hemodinamik optimizasyonun tamamlanmasından sonra ölçümleri (M1) tekrarlayın.
4. İşaretli bölgeye aort kelepçesi yerleştirerek toplam 48 dk supra-çölyak aort çapraz sıkma için iskemi/reperfüzyon indükleyin.
5. Çalışma protokolü sırasında hayvanların hayatta kalmasını iyileştirmek için aort bağlamayı 1,2, 5, 10 ve 30 dakikalık aralıklarla artan sırayla uygulayın.
6. En fazla 5 dakika sonra veya femoral arter akışının normalleştirilmesinden sonra her aralık sonra aort çapraz kenetleme devam edin.
7. 100 mmHg'lik kan basıncı artışlarını önlemek için alt vena kavanın manuel giriş tıkanıklığını gerçekleştirin > arteriyel basınç anlamına gelir.
8. 40 mmHg'nin altındaki ortalama arteriyel basınçtaki düşüşleri önlemek için gerekirse, sıkma aşamasında norepinefrin veya epinefrin bolus enjeksiyonlarını verin.
9. Reperfüzyondan (M2) önce 30 dakikalık sıkıştırma aralığının sonunda ölçümleri tekrarlayın.
10. Hemodinamik stabiliteyi sağlamak için kelepçeyi yavaş yavaş açın. Kan basıncı çok hızlı düşerse kelepçeyi kapatın ve stabilizasyona izin verin.
11. Stabilizasyon için 7 mL·kg^-1 hidroksiyetil nişasta kolloidinin yanı sıra 10-20 μg norepinefrin ve/veya epinefrin ilave bolus enjeksiyonları verin. pH 7.1'in altına düşerse 2 mL kg^-1% 8.4 sodyum bikarbonatın 1'ini izleyin. Normocapnia'yı sağlamak için solunum hızının uygun şekilde ayarlanmasından emin olun.
12. Reperfüzyondan 1 saat sonra (M3) ölçümleri tekrarlayın.
13. 6.2 altında açıklandığı gibi hemodinamik optimizasyonu tekrarlayın ve ölçümleri (M4) tekrarlayın.
14. İskemi/reperfüzyon indüksiyonu (M5) sonrasında 4,5 saat son ölçümleri gerçekleştirin.

7. Ötenazi

1. Ventriküler fibrilasyon ve asystole indüklenmesi için ötanazi için intravenöz olarak 40 mmol potasyum klorür sürün.
2. Havalandırmayı sonlandır ve tüm kateterleri çıkarın.

8. Organ hasadı

1. Hayvanı eğilimli bir konuma getirin ve iğne problarını ve drenajı çıkarın.
2. Neşter ve tostlar kullanarak deri kesisi ve kas dokusunun alınması ile omurgayı açığa çıkarın.
3. Omur kemeri paramedianını her iki tarafa bölmek için salınımlı bir testere kullanın ve kalan bağlantıları gevşetmek için dikenli işlemi dikkatlice yan hareket ettirerek omur kemiğinin dorsal kısmını çıkarın.
4. Omuriliği kaudalden kranial uçlara dikkatlice kaldırmak için ön ayak kullanın ve omuriliği çıkarmak için omurilik sinirlerini kesmek için bir neşter kullanın.
5. Histopatolojik değerlendirme veya mikrokürez nicelemesi için daha fazla kullanıma kadar omuriliği% 4 formalinde saklayın.

9. İstatistiksel analiz

1. İstatistiksel yazılım kullanın.
2. Gerekirse histogramların ve log-transform değişkenlerinin incelenmesiyle normal dağılımı sağlayın.
3. Bağımlı değişkenleri-omurilik Akısını tabi edin, kardiyak çıkış, kalp atış hızı, inme hacmi, sistolik arteriyel basınç, ortalama arteriyel basınç, diyastolik arteriyel basınç, merkezi venöz basınç, sistemik vasküler direnç - ayrıca istenirse floresan mikroküreciklerle değerlendirildiği gibi üst ve alt omurilik mikroperfüzyonu - genel doğrusal karışık model analizlerine, kimlik bağlantı işlevine sahip sürekli veriler için GENLINMIXED rutinini kullanarak.
4. Taban çizgisi ayarlamalarını kullanın.
5. Değişken taban çizgisi ve ölçüm noktası için sabit efektli modeller belirtin. Ölçüm noktasını hayvanlar içinde tekrarlanan önlemler olarak düşünün.
6. Her parametre için ölçüm noktası için sabit efektlerin p değerlerini rapor edin.
7. Omurilik floresan mikrosfer analizi için, bölgeler ve ölçüm noktası arasındaki etkileşimleri değerlendirmek ve etkileşim için sabit etkilerin p değerlerini raporlamak için bölge ve ölçüm noktası arasında sabit etki ve etkileşim olarak bölge (alt omurilik, üst omurilik) kullanın.
8. M1-M5 ölçüm noktalarındaki tüm bağımlı değişkenler için %95 güven aralığı (CI) ile temel olarak ayarlanmış marjinal araçları hesaplayın ve ardından en az önemli fark testleri ile çift yönlü karşılaştırmalar yapın.
9. Değişkenleri ortalama olarak ifade eder (%95 CI). Hayvan ağırlığını standart sapma ± ortalama olarak ifade edin.
10. Haksız p-değerlerini sanın.

Altı hayvan da protokolün tamamlanmasına kadar hayatta kaldı. Hayvan ağırlığı 48.2 ± 2.9 kg; beş hayvan erkekti ve bir hayvan dişiydi. Omurilik iğnesi probu takılması ve omurilik Flux ölçümü tüm hayvanlarda mümkündü.

İskemi indüksiyonu için aort çapraz kenetleme sırasında ve unclamping ve reperfüzyon sırasında serebral mikro sirkülatör ve makrohemodynamik kayıtlarla birlikte gerçek zamanlı omurilik mikro sirkülatör kayıtlarının örnekleri Şekil 3A , Şekil 3B'degösterilmiştir. Azalan aort akışının bozulmasını omurilik Akısında belirgin bir azalma takip ederken, yükselen aorttaki basınç artmıştır (Şekil 3A). Reperfüzyon zıt etkilere yol açtı (Şekil 3B).

Makro ve mikro sirkülatör parametrelerin istatistiksel analizi Tablo 1'degösterilmiştir. Karışık model tahmini marjinal araçlar ve güven aralıkları iskemi sırasında omurilik Akısının belirgin bir şekilde azalmasına işaret eder. Buna karşılık, serebral Flux, tahmini marjinal araçlar ve güven aralıklarında belirtildiği gibi, iskemi sırasında belirgin bir şekilde artmıştır. Buna arteriyel basınç, kalp atış hızı ve sistemik vasküler dirençte artış eşlik ederken, kardiyak çıkış ve inme hacmi azaldı. Floresan mikrosfer analizi, alt omurilikteki omurilik mikrosikülatör kan akışında belirgin bir azalma olduğunu ortaya koydu, ancak üst omurilikte tahmini marjinal araçlar ve güven aralıklarında belirtildiği gibi önemli bir değişiklik olmadı. Reperfüzyon zıt etkilere yol açtı. Protokol sonunda kardiyak çıkış, inme hacmi ve arteriyel basınçta daha fazla azalma olmasına rağmen, omurilik Akısı ve omurilik mikrosikülatör kan akışı stabildi.

Bu çalışmanın sonuçları Lazer/Doppler iğne problarının omurilik mikroperfüzyonunda gerçek zamanlı değişiklikleri tespit etme yeteneğini göstermektedir. Beklendiği gibi, iskemi sırasında omurilik mikro sirkülasyonundaki azalma minimal mikrosikülatör Akı ile sertti. Omurilik Akısının iyileşmesi reperfüzyondan sonra meydana geldi. Floresan mikroküreçlerle değerlendirildiği gibi daha düşük omurilik perfüzyonu benzer bir davranış gösterdi, böylece yöntemi destekledi. Beklendiği gibi, üst omurilik perfüzyonu ve serebral Flux farklı davranışlar gösterdi. Omurilik mikroskrkülasyonu stabil olmasına rağmen, protokolün sonunda makroserkülasyon azalarak hemodinamik tutarlılık kaybı gösterdi. İnen aorttaki akış iskemi sırasında sıfır iken, reperfüzyon aort akışının iyileşmesine yol açtı. Histopatolojik analiz, omuriliğin hafif nekrozunu 0 ile 2 arasındaki alt omurilik ve 0 ile 1 arasındaki üst omurilik için Kleinman skoru ile ortaya koydu.

Şekil 1: Lazer/Doppler iğne probunun omuriliğe yerleştirilmesi. (A) Omur yapılarının cerrahi olarak maruz kalması. (B) Damar kateteri kullanılarak omuriliğin delinmesi. (C) Kakma iğnesi çıkarıldıktan sonra iğne probunun yerleştirilmesi. (D) İğne probunun sabitlenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Azalan aortun maruz kalması ve akış probu ve damar döngüsünün yerleştirilmesi. (A) Sol akciğerin tepesini harekete geçirdikten ve diyaframın sol-yan kısmını böldükten sonra alçalandan aortun maruz kalması. (B) Cerrahi maruziyet için çevre dokunun bölünmesi. (C) Uygun dairesel pozlamayı güvence altına almak için alçalanın etrafına bir aşırı tutma yerleştirilmesi. (D) Akış probunun yanı sıra azalan aort etrafında damar halkasının yerleştirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İskemi sırasında mikro sirkülatör ve makrohemodynamik sinyallerin örnek kayıtlarının yanı sıra reperfüzyon. EKG'nin örnek kayıtları, bir mikrotip kateter kullanılarak ölçülen artan aorttaki basınç, ultrasonik akış probu, omurilik ve lazer / Doppler iğne probları kullanılarak ölçülen serebral mikro sirkülatör FLUX kullanılarak ölçülen alçalma aortunda akış. (A) Supra-çölyak aort çapraz sıkma ile iskemi indüksiyonu sırasında 50 s örnek. (B) Aort çapraz kelepçesinin hafifçe yeniden açılmasıyla reperfüzyon indüksiyonu sırasında 20 s numune. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Protokol sırasında hemodinamik parametrelerdeki değişiklikler. Değerler, %95 güven aralıklarıyla taban çizgisiyle ayarlanmış tahmini marjinal araçlar olarak verilir. Ölçüm noktasının ana etkilerinin F-testlerinin haksız p değerleri, her parametre için ve üst ve alt omurilik mikroperfüzyonu için bölge ve ölçüm noktası arasındaki etkileşim etkileri için verilmiştir. Bireysel ölçüm noktalarının M1 ile çift yönlü karşılaştırmalarının haksız p değerleri de sunulmuştur. Ölçüm noktaları şunlardır: M1 = Hemodinamik optimizasyon prior iskemi/reperfüzyon, M2 = İskemi sırasında M3 = reperfüzyondan sonra 1 saat, iskemi/reperfüzyon sonrası hemodinamik optimizasyon, iskemi/reperfüzyon indüksiyonu sonrası M5 = 4.5 h.

Omurilik iskemisi tarafından indüklenen SCI, hasta sonucu 1 , 2 , 3 , 4^,10^,11,12üzerinde muazzam bir etkisi olan aort onarımının önemli bir komplikasyonudur. SCI'yı önlemek ve tedavi etmek için mikrosilkülasyon hedefli tedaviler en umut verici olanıdır. Protokol, gerçek zamanlı omurilik mikro sirkülatörü değerlendirmesi için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar ve yeni terapötik yaklaşımların iskemi/reperfüzyon koşulları altında omurilik mikro sirkülasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirme yeteneği sunar.

Bu deneysel modelde bazı kritik metodolojik adımlar vardır. Hayvan kaybını önlemek için, araştırmacılar anestezik tekniklerde (beyin omurilik sıvı drenajı ekleme, aort maruziyeti sırasında sonografik vasküler erişim ve hemodinamik tedavi, aort çapraz kenetleme ve reperfüzyon) ve cerrahi tekniklerde (sternotomi, damar maruziyeti, inen aortu cerrahi maruziyet) deneyimlenmelidir. Omurilik iğnesi probunun yerleştirilmesi deneyim, anatomi hakkında derin bilgi ve ses teknik becerileri gerektirir. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, öğrenme eğrisi oldukça diktir ve çoğu deneyimli araştırmacı kısa sürede başarıya ulaşacaktır, ancak metodolojiyi etkileyebilecek omurilik yaralanmalarını önlemek için birden fazla girişimden kaçınılmalıdır.

Bir diğer kritik adım ise omurilik iğnesi probunun yerinden çıkmasını veya hasar görmesini önlemek için sağ yanaldan supine pozisyonuna geçtir. Bu manevra için 4-5 kişi tavsiye edilir, ekleme bölgesinin uygun şekilde dolgu yapılması esastır ve probu yerinden etmemek için dikkatli olunmalıdır. Azalan aortu maruz kalmak da bazı kritik adımlar gerektirir. Sol akciğerin tepe kısmı, sol akciğerin hafifçe geri çekilmesinin cerrahi alanı açığa çıkarması için harekete geçirilmelidir. Ek olarak, diyaframın sol-yanal kısmı maruziyeti kolaylaştırmak için parçalanmalıdır. Aort hazırlığı sırasında, yeterli kardiyopulmoner stabiliteyi sağlamak için ameliyat yapan araştırmacılar ile anestezi ve hemodinamik yönetim sağlayanlar arasında optimal iletişim gereklidir. Aort çapraz sıkma sırasında, venöz geri dönüşü azaltmak için alt vena kavanın manuel sıkıştırması önerilir. Bu manevra olmadan, zararlı miyokard yaralanmasına yol açabilecek ciddi artçı artışlar meydana gelebilir^39,40.

Reperfüzyon, kullanıma hazır sıvılar, vazopresörler ve inotroplarla dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Reperfüzyon sırasında, şiddetli hipotansiyon, kardiyak aritmiler ve dolaşım yetmezliğine yol açabilecek dramatik değişiklikler meydana gelir⁴¹. Bununla birlikte, hemodinamik davranışların temkinli gözlemlenmesi, müdahalelerin hızlı başlatılması ve bu kritik aşamada yapılandırılmış ve nazik bir performans kullanılması hayvan kaybını önleyebilir. Ek olarak, protokolde kullanıldığı gibi, artan aort çapraz sıkma aralıklarının kullanımı, ardından rejenerasyonu iyileştirmek için zaman dilimleri, reperfüzyon sırasında hemodinamik stabiliteyi artıran iskemik ön koşullandırma etkilerine neden olur^42,43.

Model, makrosikülatör değerlendirmeye ek olarak omurilik mikro sirkülasyonunu izleme olanağı sağlar. Yüksek riskli cerrahi ve kritik durumdaki hastalarda sıklıkla görülen hemodinamik tutarlılık kaybı nedeniyle, omurilik mikrosirkülasyonunun doğrudan değerlendirilmesi gereklidir^13,30. Dil altı mikro sirkülasyonu genellikle ilgi organında doğrudan mikro sirkülatör değerlendirmesinin yerini almak için kullanılır⁴⁴. Bununla birlikte, deneysel modelde kullanıldığı gibi, omurilikte doğrudan mikro sirkülatör değerlendirmesinin değerini vurgulayan dil altı mikro sirkülasyonu ve hayati organlar arasındaki ayrışma gösterilmiştir⁴⁵. Son olarak, model, aralıklı kullanım ve ölüm sonrası analiz ile sınırlı olan floresan mikrokürez değerlendirmesine kıyasla omurilik kan akışının gerçek zamanlı izlenmesi avantajına sahiptir⁴⁶. Gerçek zamanlı değerlendirmenin etkisi, iskemi sırasındaki örnek kayıtlara ve omurilik mikroperfüzyonunda hızlı değişiklikler gösteren reperfüzyon indüksiyona bakıldığında en iyi şekilde görülebilir. Bununla birlikte, omuriliğe lazer-Doppler prob yerleştirilmesinin omuriliğin küçük, ancak önemli yaralanmalara yol açabileceği düşünülmelidir.

Omuriliğin bütünlüğü hemodinamik parametreleri etkileyebileceğinden, bu yöntemin bir dezavantajı olabilir. Bununla birlikte, omurilik mikroperfüzyonunu değerlendirmek için lazer-Doppler tekniklerinin kullanımı daha önce^{47 , 48,49,50}kullanılmıştır. Ayrıca, prob yerleştirilmesinden sonra hemodinamik değişiklikler gözlemlemesek de, bu yöntemle indüklenen hemodinamik etkileri göz ardı edemedik. Hemodinamik değişikliklerin mikroküreç enjeksiyonlarının kullanılmasıyla da indüklenebileceği belirtilmelidir, ancak büyük hayvanlarda küçük bir öneme sahip^{olacaktır 51}. Ayrıca, duyusal veya motor fonksiyon prob yerleştirmeden etkilenebilir ve bu nedenle, lazer-Doppler değerlendirmesi ile birlikte duyusal veya motor tarafından uyarılmış potansiyel değerlendirmenin kullanımı dikkatli yapılmalıdır.

Bu bakımdan mikrosfer enjeksiyon tekniği avantajlı olabilir. Ek olarak, teknikler kronik denemeler için kullanılmamalıdır; bununla birlikte, bu, ölüm sonrası doku analizine bağımlı oldukları için akut denemelerle sınırlı olan mikroküreği enjeksiyonları için de geçerlidir. Lazer-Doppler tekniklerini kullanan çalışmaların çoğu küçük hayvanlarda yapıldı^47,48,49,50 Burada, domuzlarda kullanım tekniğini, klinik çalışmalara çeviriyi kolaylaştırabilecek büyük bir hayvan modeli olarak tanımlıyoruz. Paramedian-tanıtım tekniği, domuzlarda büyük dikenli süreçler sorununun üstesinden gelir ve bu da omurilik problarının uygun şekilde yerleştirilmesini zorlaştırır. Ayrıca, teknik, laminektomi veya dura dokusunun çıkarılmasına gerek kalmaması avantajına sahiptir ve sürekli bir likör kaybını önler. Beyin omurilik sıvı basıncının omurilik perfüzyonu³²üzerinde muazzam bir etkisi olduğu için, model omurilik mikroperfüzyona ek olarak beyin omurilik sıvı basıncını ölçme ve optimize etme avantajına sahiptir ve gelecekteki projelerde beyin omurilik mikroperfüzyonu üzerindeki beyin omurilik sıvı basıncının etkisini ele alacaktır.

Protokolün belirtilmesi gereken bazı sınırlamaları vardır. Omuriliğin mutlak değerleri Flux, kesin prob pozisyonundaki farklılıklar ve daha büyük omurilik damarlarının yakınlığı nedeniyle hayvanlar arasında önemli ölçüde farklılık gösterir. Bu nedenle, değerler karşılaştırılırken temel ayarlamalar yapılmalıdır. Bununla birlikte, protokol sırasında iğne probunun hareketlerinden kaçınmak için titiz bir dikkat göz önüne bindirildikçe ölçüm noktaları arasındaki birey içi farklılıklar son derece tutarlıdır. Ayrıca, bu çalışma Laser-Doppler ve floresan mikroküreci yöntemleri arasında bir karşılaştırma çalışması olarak tasarlanmamıştır. Hayvan sayısı göz önüne alındığında, bu iki yöntem arasında bir korelasyon analizi yapmadık.

Her iki yöntem de iskemi sırasında önemli azalmalar ve her ikisi için de reperfüzyondan sonra iyileşme ile karşılaştırılabilir bir davranış gösterse de, yöntemlerin bir karşılaştırması gelecekte uygun şekilde tasarlanmış çalışmalar kullanılarak ele alınmalıdır. Bununla birlikte, mikrokürelerin kullanımı ayrıca üst ve alt omurilik mikroperfüzyonu için farklı davranışların değerlendirilmesini sağladı. Ek olarak, histopatolojik analiz, diğer omurilik iskemisi modellerine kıyasla sadece orta derecede omurilik nekrozu ortaya koydu³⁷. İskemi süresinin uzatılması ve ön koşullandırma önlemlerinin atılması, bazı araştırmacılar tarafından isndenebilecek daha ciddi değişikliklere yol açabilir. Sadece hafif histopatolojik değişiklikleri değerlendirmemize rağmen, bu daha uzun süreli iskemi ile farklı olabilir. Bu bakımdan, protokolün feshinden önce iskemi/reperfüzyondan sonra daha uzun bir süre de daha şiddetli histopatolojik değişikliklere yol açmış olabilir. Bununla birlikte, protokol, ek veya hatta sürekli inotrop veya vazopresör uygulamasına gerek kalmadan reperfüzyondan bir saat sonra hemodinamik stabiliteyi sağladı.

Farklı hemodinamik müdahalelerin değerlendirilmesi için bu model en uygun koşulları sağlar. Hemodinamik müdahale örneği olarak sıvı optimizasyonu kullansak da bu yöntemle diğer yaklaşımlar değerlendirilebilir. Bu protokol iskemi/reperfüzyon modelinde mikrosürasyonel değerlendirme sağlarken, iskemi süresi iskemi sırasında terapötik yaklaşımların reperfüzyondan önce değerlendirilmesini sınırlar. Ayrıca, iskemi sırasında hemodinamik değişikliklerde bir varyasyon meydana geldi (örneğin, hipertansiyon, hipotansiyon, taşikardi, bradikardi ve kardiyak arrythmias). Manuel giriş tıkanıklığı bu aşamada hemodinamik değişkenleri daha da etkiler. Bu nedenle, reperfüzyondan önce iskemi sırasında terapötik yaklaşımların değerlendirilmesi için protokol önerilmez. Bununla birlikte, embolizasyon veya ligasyon tekniklerinin kullanımı gibi diğer deneysel ayarlar, bu protokolde açıklandığı gibi omurilik lazeri / Doppler iğne probu değerlendirmesi ile birleştirilebilir.

Constantin J.C. Trepte, Maquet'in dersleri için onur ödülü aldı. Diğer tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder. Bu çalışma Avrupa Anesteziyoloji Derneği Genç Araştırmacı Start-Up Grant 2018 tarafından desteklendi.

Yazarlar Lena Brix, V.M.D, Hayvan Araştırmaları Enstitüsü, Hannover Tıp Fakültesi'nin yanı sıra Bayan Jutta Dammann'a, Araştırma Hayvan Bakım Tesisi, Hamburg-Eppendorf Üniversitesi Tıp Merkezi, Almanya'ya, ameliyat öncesi ve perioperatif hayvan bakımı ve hayvan işleme konusundaki teknik yardımları için teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca, Lüksemburg'daki Hôpital Kirchberg Vasküler Cerrahi Bölümü'nden Dr. Daniel Manzoni'ye teknik yardımı için teşekkür eder.