הערכה בזמן אמת של מיקרופרפוזיה בחוט השדרה במודל חזירי של איסכמיה/רפרפוזיה

מיקרו-סירקולציה בחוט השדרה ממלאת תפקיד מרכזי בפגיעה בחוט השדרה. רוב השיטות אינן מאפשרות הערכה בזמן אמת של מיקרו-סירקולציה של חוט השדרה, החיונית לפיתוח טיפולים ממוקדי מיקרו-סירקולציה. כאן, אנו מציעים פרוטוקול באמצעות לייזר-דופלר-זרימה מחט בדיקות במודל בעלי חיים גדול של איסכמיה / רפרפוזיה.

פגיעה בחוט השדרה היא סיבוך הרסני של תיקון בוני העורקים. למרות ההתפתחויות במניעה וטיפול בפגיעה בחוט השדרה, שכיחותו עדיין גבוהה במידה ניכרת ולכן משפיעה על תוצאות המטופל. מיקרו-סירקולציה ממלאת תפקיד מרכזי בהזרמת רקמות ובאספקת חמצן ולעתים קרובות מנותקת ממקרוהמודינמיקה. לכן, הערכה ישירה של מיקרו-סירקולציה של חוט השדרה חיונית להתפתחות טיפולים ממוקדי מיקרו-סירקולציה ולהערכת גישות קיימות לגבי מיקרו-סירקולציה של חוט השדרה. עם זאת, רוב השיטות אינן מספקות הערכה בזמן אמת של מיקרו-סירקולציה של חוט השדרה. מטרת מחקר זה היא לתאר פרוטוקול סטנדרטי להערכה מיקרו-סירקולטורית של חוט השדרה בזמן אמת באמצעות בדיקות מחט לייזר-דופלר המוחדרות ישירות לחוט השדרה. השתמשנו במודל חזירי של איסכמיה/רפרפוזיה כדי לגרום להידרדרות של מיקרו-סירקולציה של חוט השדרה. בנוסף, נעשה שימוש בטכניקת הזרקת מיקרוספירה פלואורסצנטית. בתחילה, בעלי חיים היו מרדים ומאווררים מכנית. לאחר מכן, הכנסה מחט לייזר-דופלר בוצעה, ואחריו המיקום של ניקוז נוזל השדרתי. כריתת החזה החציונית בוצעה לחשיפת אב העורקים היורד לביצוע הידוק צולב של אב העורקים. איסכמיה/רפרפוזיה נגרמה על ידי הידוק אב העורקים של על-צליאק במשך 48 דקות בסך הכל, ואחריו רפרפוזיה וייצוב המודינמי. שטף לייזר-דופלר בוצע במקביל להערכה מקרוהמודינמית. בנוסף, ניקוז נוזל השדרתי אוטומטי שימש כדי לשמור על לחץ מוחי יציב. לאחר השלמת הפרוטוקול, בעלי חיים הוקרבו, וחוט השדרה נקצר לניתוח היסטופתולוגי ומיקרוספירה. הפרוטוקול חושף את ההיתכנות של מדידות מיקרופרפוזיה בחוט השדרה באמצעות בדיקות לייזר-דופלר ומראה ירידה ניכרת במהלך איסכמיה, כמו גם התאוששות לאחר reperfusion. התוצאות הראו התנהגות דומה להערכת מיקרוספרה פלואורסצנטית. לסיכום, פרוטוקול חדש זה עשוי לספק מודל בעלי חיים גדול שימושי למחקרים עתידיים באמצעות הערכת מיקרופרפוזיה של חוט השדרה בזמן אמת בתנאי איסכמיה/רפרפוזיה.

פגיעה בחוט השדרה הנגרמת על ידי איסכמיה / רפרפוזיה (SCI) הוא אחד הסיבוכים ההרסניים ביותר של תיקון באטי העורקים הקשורים לתוצאה מופחתת^1,2,3,4. אפשרויות מניעה וטיפול נוכחיות עבור SCI כוללות אופטימיזציה של פרמטרים מקרוהמודינמיים, כמו גם נורמליזציה של לחץ נוזל השדרתי (CSP) כדי לשפר את לחץ זלוף חוט השדרה^2,5,6,7,8,9. למרות יישום תמרונים אלה, השכיחות של SCI עדיין נע בין 2% ל 31% בהתאם למורכבות של תיקון בוני^{העורקים 10,11,12}.

לאחרונה, מיקרו-סירקולציה זכתה לתשומת לב מוגברת^13,14. מיקרו-סירקולציה היא אזור של ספיגת חמצן תאית וחילופי מטבוליים ולכן, ממלא תפקיד קריטי בתפקוד האיברים ושלמות^{התאים 13}. זרימת דם מיקרו-סירקולטורית לקויה היא דטרמיננטה עיקרית של איסכמיה של רקמות הקשורה לתמותה מוגברת^{15,16,17,18,19}. פגיעה במיקרו-סירקולציה של חוט השדרה קשורה לתפקוד נוירולוגי מופחת ולתוצאה^20,21,22,23. לכן, אופטימיזציה של microperfusion לטיפול SCI היא גישה מבטיחה ביותר. התמדה של הפרעות מיקרו-סירקולטוריות, למרות אופטימיזציה מקרו-סירקולטורית, תוארה^26,27,28,29. אובדן זה של קוהרנטיות המודינמית מתרחש לעתים קרובות בתנאים שונים כולל איסכמיה / reperfusion, המדגיש את הצורך בהערכה מיקרו-סירקולטורית ישירה טיפולים ממוקדי מיקרו-סירקולציה^26,27,30.

עד כה, רק מחקרים מעטים השתמשו בבדיקות לייזר-דופלר להערכה בזמן אמת של התנהגות מיקרו-סירקולטורית בחוט השדרה^20,31. מחקרים קיימים השתמשו לעתים קרובות בטכניקות הזרקת מיקרוספירה, המוגבלות על ידי שימוש לסירוגין וניתוח שלאחר המוות^32,33. מספר המדידות השונות בטכניקת הזרקת מיקרוספירה מוגבל על ידי הזמינות של מיקרוספרות עם אורכי גל שונים. יתר על כן, בניגוד לטכניקות לייזר-דופלר, הערכה בזמן אמת של מיקרופרפוזיה אינה אפשרית, שכן עיבוד וניתוח רקמות לאחר המוות נדרשים לשיטה זו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ניסיוני להערכה בזמן אמת של מיקרו-סירקולציה בחוט השדרה במודל חייתי גדול חזירי של איסכמיה / רפרפוזיה.

מחקר זה היה חלק מפרויקט בעלי חיים גדול המשלב מחקר אקראי המשווה את ההשפעה של גבישים לעומת קולואידים על מיקרו-סירקולציה באיסכמיה/ רפרפוזיה, כמו גם מחקר אקראי חוקר על ההשפעות של נוזלים לעומת מסופרסורים על מיקרופרפוזיה בחוט השדרה. כיול גשושית זרימה 2 נקודות כמו גם כיול קטטר קצה לחץ תוארו בעבר³⁴. בנוסף לפרוטוקול שדווח, מיקרוספרות פלואורסצנטיות שימשו למדידה של מיקרופרפוזיה בחוט השדרה, כפי שתואר בעבר, באמצעות 12 דגימות של רקמת חוט השדרה עבור כל בעל חיים, עם דגימות 1-6 המייצגות את חוט השדרה העליון ו 7-12 המייצגים את חוט השדרה התחתון^35,36. הזרקת מיקרוספירה בוצעה עבור כל שלב מדידה לאחר השלמת הקלטות לייזר-דופלר והערכה מקרוהמודינמית. הערכה היסטופתולוגית בוצעה באמצעות ציון קליינמן כפי שתואר בעבר³⁷.

המחקר אושר על ידי הוועדה הממשלתית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בעיר המבורג (Reference-No. 60/17). בעלי החיים קיבלו טיפול בהתאם ל'מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה' (פרסום NIH מס ' 86-23, תוקן בשנת 2011) וכן המלצות וניסויים של FELASA בוצעו על פי הנחיות ARRIVE^24,25. מחקר זה היה ניסוי חריף, וכל בעלי החיים הומתו בסוף הפרוטוקול.

הערה: המחקר בוצע בשישה חזירים זכרים ונקבות בני שלושה חודשים (Landrace הגרמני) במשקל של כ -40 ק"ג. בעלי חיים הובאו למתקני הטיפול בבעלי חיים לפחות 7 ימים לפני הניסויים ושוכנו בהתאם להמלצות לרווחת בעלי החיים. לבעלי חיים ניתנו מזון ומים עד ליביטום, ומצבם הבריאותי נבדק באופן קבוע על ידי הווטרינר האחראי. זמן צום של 12 שעות נשמר לפני הניסויים. כל ההליך הניסיוני והטיפול בבעלי החיים היה בפיקוח הווטרינר האחראי.

1. אינדוקציה הרדמה ותחזוקה של הרדמה

1. עבור אינדוקציה הרדמה ותחזוקה של הרדמה, premedicate בעלי החיים עמוקה מרגיע אותם באמצעות זריקה תוך שרירית ואחריו זריקות תוך ורידי, במידת הצורך, כדי לבצע צנרול אנדוטראצ'אל. לאחר מכן, לגרום ולשמור על הרדמה באמצעות שילוב של סוכן הרדמה נדיף עם יישום אופיואידים רציף השלים עם הזרקת בולוס אופיואידים נוספים.
2. בצע זריקות תוך שריריות של קטמין 20 מ"ג^-1, אזפרון 4 מ"ג^-1, ו midazolam 0.1 מ"ג-1 עבור פרמדיקציה וסמיך.
3. מניחים קטטר ורידי בווריד האוזן, מאבטחים קיבעון תקין, ולהעריך את הפונקציונליות על ידי יישום מהיר של 10 מ"ל של מלוחים.
4. מניחים את החיה בתנוחה על שמיכת חימום כדי למנוע אובדן חום.
5. להקים ניטור בסיסי עם אלקטרוקרדיוגרפיה (אק"ג) ואוקסימטריה דופק כדי לפקח על מצב הלבו-ריאתי של בעלי החיים, ולחבר אותו לחומרת הניטור הבסיסית.
6. יש לתת 15 ליטר^-1 של חמצן באמצעות מסכה בצורת חזיר עבור preoxygenation.
7. הזריקו בולולי תוך ורידי של 0.1 מ"ג^-1 של 1% פרופופול, במידת הצורך, ובצעו צנרוד אנדוטריאצ'אל.
8. אבטח מיקום נכון עם קפנוגרפיה ו auscultation סוף גאות ושפל, לנהל 0.1 מ"ג• קילוגרם^-1 של pancuronium, ולהבטיח קיבוע נאות של צינור אנדוטראצ'אל.
9. להקים אוורור מבוקר נפח באמצעות נפחי גאות ושפל של 10 מ"ל^-1 משקל גוף^-1, לחץ חיובי תפוגת קצה של 10 ס"מH₂O, שבריר של חמצן השראה (FiO₂) של 0.3 באמצעות מכונת ההרדמה. התאם את תדירות מכונת ההנשמה כדי לשמור על מתח פחמן דו חמצני שפג תוקפו הסופי (etCO₂₎של 35-45 מ"מ ל"ג.
10. הצג צינור קיבה, לבצע יניקה של נוזלי קיבה, כראוי לתקן את הצינור, ולחבר אותו לשקית איסוף. בזהירות לעצום את העיניים של החיה כדי למנוע יובש של העיניים במהלך הרדמה.
11. לשמור על הרדמה על ידי עירוי רציף של פנטניל (10 מיקרוגרם^-1·h^-1) ו sevoflurane (3.0% ריכוז שפג תוקפו, נמסר על ידי האדים). להבטיח רמה נאותה של הרדמה על ידי התבוננות זהירה של סימנים חיוניים ופרמטרים אוורור, כמו גם על ידי היעדר תנועות במהלך הפרוטוקול כולו, תוך תשומת לב מיוחדת לשלבים של גירוי כירורגי. תן מינונים נוספים בולוס של פנטניל (50 מיקרוגרם) אם יש אינדיקציה כלשהי של כאב או מצוקה.
    הערה: יש להקפיד על נוכחותם של חוקרים המנוסים בהרדמה בבעלי חיים במהלך כל ההליך, ולהשתמש בפיקוח על ידי וטרינר מנוסה כדי להבטיח הרדמה נאותה.
12. ניהול קצב עירוי בסיסי של 10 מ"ל^-1·h^-1 גבישים מאוזנים כדי לפצות על אובדן נוזלים במהלך הרדמה, הכנה כירורגית, וביצוע הפרוטוקול הניסיוני. השתמש מחמם נוזלים כדי למנוע אובדן חום.
13. נקו בעדינות את עור החזיר באמצעות מי סבון. השתמש בתמיסת חיטוי עור המכילה פובידון-יוד כדי להפחית את זיהום העור. השתמש כפפות סטריליות להכנות כירורגיות. החל 300 מ ג של clindamycin כמו מניעת מיקרוביאלית, ולחזור על המינון לאחר 6 שעות.

2. מיקום בדיקה

1. מניחים את החיה במצב לרוחב הנכון, ומכופפים את גב החיה כדי להרחיב את הרווח בין החוליות.
2. חשיפה כירורגית של האזור הפרוורת-חולייתי להכנת תהליכים ספיניים וקשתות חוליות(איור 1A).
3. מניחים פרמדיה של כלי דם 14 גרם וריד היקפי בחוט השדרה ברמה של חוליית בית החזה (Th) 13/14 או חוליה מותנית (L) 1/2 בין שתי קשתות חוליות(איור 1B).
4. הסר את המחט, הכנס את בדיקת מחט הלייזר/דופלר מעל צנתר הוורידים (איור 1C), ובדוק את איכות האות באמצעות חיבור לתוכנה הקשה והתוכנה המיועדת. ודא כי יש אות יציב עם pulsatility מתון.
5. תקן בקפידה את הגשוש בתפרים (איור 1D) והשתמש בריפוד כדי למנוע נקע או קינקיה של הגשוש.
6. עבור מיקום עורי של ניקוז נוזל השדרתי למדידה ושליטה בלחץ השדרתי, לזהות את הרמה של L 4/5 או L 5/6, לנקב את העור ואת החלל התת עורי עם מחט המציג, ולהסיר את מחט שיבוץ.
7. מניחים מזרק מלא מלוח על המחט, ומכניסים בזהירות את המחט עם לחץ מתמיד על המזרק המלא בנוזל.
8. לאחר אובדן ההתנגדות מורגש כראיה לתנוחת אפידורל, להציג מחדש את מחט שיבוץ, ולהציג את המחט 2-3 מ"מ עוד יותר כדי לנקב את dura mater ולהסיר את מחט שיבוץ.
9. אמת את המיקום התוך-תיא-תקלי על-ידי טפטוף מהיר של משקאות שקופים. הציגו את הניקוז בעומק של עד 20 ס"מ, חברו את מתאם מנעול הלואר ואמתו את המיקום על ידי שאיפה זהירה של משקאות חריפים.
10. בזהירות לתקן את הניקוז עם תפרים, ולחבר אותו למערכת ניקוז נוזל השדרתי.
11. לחשוף את הגולגולת מאחורי האוזן השמאלית, ולבצע בזהירות trepanation חור מקדחה של העור באמצעות קובץ מצורף מקדחה 6 מ"מ.
12. הציגו גשושית דופלר לייזר שנייה ישירות למוח. תקן בזהירות את הבדיקה עם תפרים, ובדוק את איכות האות על ידי חיבור לתוכנה הקשה והתוכנה המיועדת. שוב, לוודא שיש אות יציב עם פולסאוויליות מתונה.
13. נתק את כל הבדיקות, מקם בזהירות את החיה בתנוחה על-מינית, והבטח תנוחת בדיקה לא מושפעת. ודא כי לפחות 4-5 חוקרים לבצע את התמרון הזה.
14. חבר מחדש את הבדיקות ובדוק מחדש את איכות האות.
15. חבר את ערוצי הפלט של חומרת הלייזר-דופלר לחומרה ותוכנה לרכישה מגברת וסינכרונית כדי להקליט בנוסף את שטף הלייזר/דופלר בו זמנית עם אותות מקרוהמודינמיים.
16. כייל שטף לפי יחידה (PU) עם כיול של 2 נקודות.
    1. הקש Enter כדי לפתוח את התפריט ולבחור את הגדרת הפלט האנלוגי.
    2. השתמש במקדם ההמרה המוצג (5.0 V = 1000 PU) כדי לכייל את Flux עם כיול של 2 נקודות לשימוש עם תוכנת הרכישה הסינכרונית.
    3. בחרו 'חזור' כדי לחזור לתפריט הקודם ובחרו 'מדידה' כדי להמשיך עם המידה.
    4. פתח את תוכנת הרכישה הסינכרונית. בחר אפס את כל הקלטים מתפריט התקנה. חבר את כל הקלטים עם ההתקנים והבדיקות המשמשים.
    5. בצע כיול של 2 נקודות עבור Flux על ידי לחיצה על התפריט הנפתח של ערוץ Flux. בחר כיול של 2 נקודות. הגדר/י את ״המרת יחידות״ ל״ת״ ובחר/י BPU כיחידות. עבור נקודה 1, הגדר 0 V ל- 0 BPU. לנקודה 2, הגדר 5.0 V עד 1000 BPU. בחר יחידות מוגדרות עבור כל הנתונים החדשים . לחץ על אישור כדי לסגור את התפריט.
17. התחל ניקוז נוזל השדרתי מתמשך עם לחץ יעד של 10 מ"מ כ"ג ונפח ניקוז של 20 mL ·h^-1.

3. מיקום צנתר

1. לחשוף את שני עורקי הירך.
2. ליג את החלק הדיסטלי של עורק הירך הימני, חסם באופן זמני את הלומן הפרוקסימלי של העורק באמצעות לולאת כלי דם, בצע חתך של 2 מ"מ של הכלי באמצעות מספריים של פוטס, ולהציג את חוט המדריך.
3. הצג את חוט המדריך עוד יותר, הבטחת החדרה ללא התנגדות והימנעות מכל קינקיה של החוט; להציג את הצנתר מעל החוט.
4. תקן את הצנתר עם תפרים.
5. ודא מיקום נכון על ידי שאיפה של דם עורקי מאומת עם ניתוח גז דם ומדידת אותות עורקים לאחר חיבור נכון ללחץ הדם וניטור חוצה קרדיו-ריאות קשה - ותוכנה.
6. הנח בדיקת זרימה של 5 מ"מ על עורק הירך השמאלי, ובדוק את איכות האות על ידי חיבור למדידת הזרימה.
7. סגור את שתי המפשעות עם תפרים.
8. לחשוף את העורק הראשי הנכון, כמו גם את וריד הצוואר הפנימי הנכון למיקום של 8 Fr. מציג נדן.
9. למיקום צנתר, המשך באותו אופן כמתואר ב 3.2-3.4.
10. חבר את לומן הצד של העורק הראשי מציג נדן לניטור הלחץ הבסיסי וחומרת תרמודילוציה ריאתית למדידת לחץ עורקי.
11. הכניסו קטטר קצה לחץ לאוה העורקים העולה, ואמתו את המיקום באמצעות חיבור למגבר ולרכישה הסינכרונית קשה ותוכנה.
12. מניחים צנתר עורק ריאות של ברבור-גנץ דרך הנדן הווריארי בעורק הריאות על ידי ניפוח הבלון בעומק 20 ס"מ והכנסתו בעדינות עד שנראה לחץ טריז בעקומה המודינמית. מנפחים את הבלון ומושכים את הקטטר 2 ס"מ אחורה. ודאו איכות אות מספקת של לחץ עורקי הריאות. חבר את התרמיסטורים לניטור לחץ בסיסי ולחומרת תרמודילולציה ריאתית.
13. השתמש הדרכה סונוגרפית למיקום עורי של 12 Fr. 5-לומן צנתר ורידים מרכזי עבור ניהול תרופות ומדידת לחץ ורידים מרכזי לתוך וריד הצוואר הימני החיצוני. השתמש בגישה של 6 שלבים למיקום סונוגרף³⁸
14. חברו את הלומן הדיסטלי של הקטטר ללחץ הדם ולניטור הטרנס-קרדיו-רילוקימוני. להעביר את כל התרופות והחליטות לקטטר ורידים מרכזי. השתמש לומן שונים עבור כלאי סכר, נוזלים, קטכולאמין, ולחסוך את לומן הגדול לניהול של קולואידים במהלך שלבי טעינת נפח.

4. הכנה כירורגית

1. בצע מיני לפרוסטומיה, לגייס את שלפוחית השתן, להכניס קטטר פולי לניקוז שתן, לנפח את הבלון עם מלוחים, ולתקן את הצנתר עם תפרים כיס.
2. חבר את הקטטר לשקית איסוף שתן המציגה את כמות השתן ב- mL.
3. הגדל את ה- FiO₂ עד 1.0, ונהל מחדש 0.1 מ"ג^-1 פנאקורוניום תוך ורידי.
4. בצע סטרנוטומיה חציונית באמצעות אלקטרו-קטרים להכנה עד ליר החזה. מנתחים בעדינות את החזה מהרקמה שמסביב. בצע מיקום רטרוסטרלי של דחיסה כדי למנוע פציעות.
5. להפסיק אוורור ולחלק את העצם עם מסור מתנדנד. המשך אוורור והפחת את FiO₂ ל- 0.3. השתמש electrocautery כדי להפחית את הדימום, ולאטום את עצם החזה עם שעוות עצם.
6. בזהירות לגייס את פסגת הריאה השמאלית, ולחלק את החלק לרוחב השמאלי של הסרעפת כדי להקל על חשיפה כירורגית.
7. חשפו את אב העורקים היורד פרוקסימלי לתא המטען הצליאק על ידי נסיגה עדינה של הריאה השמאלית, הבטחת אוורור ללא הפרעה והימנעות מטראומה לריאה השמאלית(איור 2A)וחלוקת הרקמה שמסביב(איור 2B). יש צורך לבצע קולואיד עמילן הידרוקסיאתיל 7 מ"ל^-1 אם יש צורך בייצוב המודינמי.
8. הניחו דריסת יתר סביב העורקים היורד כדי להבטיח חשיפה נאותה(איור 2C).
9. חברו גשושית זרימה סביב ביש העורקים החזי היורד(איור 2D). ודא איכות אותות נאותה על-ידי חיבור למודול הזרימה והרכישה הסינכרונית הקשה והתוכנה. השתמש בג'ל מגע כדי לשפר את איכות האות במידת הצורך.
10. חבר לולאת חללית סביב אב העורקים היורד, דיסטלי לגשושית הזרימה כדי לסמן את האזור של הידוק צולב בתחום העורקים.

5. הערכה ורכישת נתונים

1. אפס את כל הצנתרים וצנתרים ברמה באמצעות קווים מלאים בנוזלים הממוקמים ברמת האיתור הימנית.
2. הניחו אלקטרודות א.ק.ג. מחט וקשרו אותן לרכישה הסינכרונית הקשה והתוכנה.
3. הערכה של תרמודילוציה טרנס-קרדיו-ריאה, כמו גם זרימה ומדידת לחץ של העורקים תוארו בעבר ³⁴.
4. למדידת פלט לב באמצעות תרמודילולציה של עורק הריאות, בצע 3 זריקות עם 10 מ"ל של תמיסת מלח קרה, ושים לב לערך הממוצע המוצג על ידי חומרת ניטור בסיסית.
5. הפעל את תוכנת הלייזר-דופלר על-ידי לחיצה פשוטה על Start, והגדר סימן עבור כל שלב מדידה על-ידי סימון קפדני של השלבים כ- M0 עד M5.

6. פרוטוקול ניסיוני

1. ביצוע מדידות בסיסיות (M0).
2. בצע אופטימיזציה המודינמית באמצעות שלבי טעינת נפח של 7 מ"ל^-1 קולואיד עמילן הידרוקסיאתיל. בצע כל שלב טעינת נפח מעל 5 דקות באמצעות חליטות בלחץ. לאחר השלמת כל שלב טעינת נפח, אפשר 5 דקות עבור שאיון. התחל טעינת נפח עד העלייה בפלט הלב הוא <15%.
3. חזור על מדידות (M1) לאחר השלמת המיטוב המודינמי.
4. לגרום איסכמיה / reperfusion בסך הכל 48 דקות של מהדק אב העורקים supra-צליאק על ידי הצבת מלחציים אב העורקים באזור המסומן.
5. החל מהדק אב העורקים בסדר עולה של מרווחי זמן של 1, 2, 5, 10 ו-30 דקות כדי לשפר את הישרדותם של בעלי החיים במהלך פרוטוקול המחקר.
6. המשך הידוק צולב אב העורקים לאחר כל מרווח לאחר מקסימום של 5 דקות או לאחר נורמליזציה של זרימת עורק הירך.
7. בצע זרימה ידנית של הוועד הנתון הנחות כדי למנוע עליות לחץ דם של > 100 מ"מ ליש"ט לחץ עורקי ממוצע.
8. ניהול זריקות בולוס של נוראדרנלין או אפינפרין במהלך שלב הידוק, במידת הצורך, כדי למנוע ירידות בלחץ העורקים הממוצע מתחת 40 מ"מ כ"ג.
9. חזור על מדידות בסוף מרווח הידוק של 30 דקות לפני השיפוץ (M2).
10. פתח בהדרגה את המלחציים כדי להבטיח יציבות המודינמית. סגור את המלחציים אם לחץ הדם יורד מהר מדי ולאפשר ייצוב.
11. ניהול 7 mL·kg^-1 של קולואידים עמילן הידרוקסיאתיל, כמו גם זריקות בולוס נוספות של 10-20 מיקרוגרם של נוראדרנלין ו/או אפינפרין לייצוב. יש לתת 2 מ"ל ק"ג^-1 של 8.4% נתרן ביקרבונט אם ה- pH יורד מתחת ל -7.1. להבטיח התאמה נכונה של קצב הנשימה כדי להבטיח normocapnia.
12. יש לחזור על מדידות שעה לאחר השיפוץ (M3).
13. חזור על אופטימיזציה המודינמית כמתואר תחת 6.2, ומדידות חוזרות (M4).
14. בצע מדידות סופיות 4.5 שעות לאחר האינדוקציה של איסכמיה / רפרפוזיה (M5).

7. המתת חסד

1. יש צורך ב-40 מ"מ של אשלגן כלורי תוך ורידי להמתת חסד כדי לגרום לפרפור חדרי ולאסיסטולה.
2. יש להפסיק את האוורור ולהסיר את כל הצנתרים.

8. קצירת איברים

1. מניחים את החיה בתנוחה נוטה, ולהסיר את בדיקות המחט, כמו גם את הניקוז.
2. לחשוף את עמוד השדרה על ידי חתכים בעור והסרה של רקמת שריר באמצעות אזמל ומלקחיים.
3. השתמש מסור מתנדנד כדי לחלק את קשת החוליות paramedian משני הצדדים, ולהסיר את החלק החלק החלקי של עצם החוליות על ידי הזזה זהירה של התהליך הסיבובי הצידה כדי לשחרר את החיבורים הנותרים.
4. השתמש במלקחיים כדי להרים בזהירות את חוט השדרה מהקב"ה לקצוות הגולגולתיים, והשתמש באזמל כדי לחתוך את עצבי עמוד השדרה כדי להסיר את חוט השדרה.
5. לאחסן את חוט השדרה ב 4% פורמלין עד ניצול נוסף להערכה היסטופתולוגית או כימות מיקרוספירה.

9. ניתוח סטטיסטי

1. השתמש בתוכנה סטטיסטית.
2. ודא הפצה רגילה על-ידי בדיקת היסטוגרמה ומשתנים לשינוי יומן רישום במידת הצורך.
3. נושא משתנים תלויים- חוט השדרה שטף, תפוקת לב, קצב לב, נפח שבץ, לחץ עורקי סיסטולי, לחץ עורקי ממוצע, לחץ עורקי דיאסטולי, לחץ ורידי מרכזי, התנגדות כלי דם מערכתית - כמו גם microperfusion חוט השדרה העליון והתחתון כפי שהוערך עם מיקרוספרות פלואורסצנטיות אם תרצה - לנתחי מודל מעורב ליניארי כללי, באמצעות GENLIN מעורב השגרתי עבור נתונים רציפים עם פונקציית קישור זהות.
4. השתמש בהתאמות בסיסיות.
5. ציין מודלים עם אפקטים קבועים עבור קו בסיס משתנה ונקודת מידה. שקול נקודת מדידה כאמצעי חוזר ונשנים בתוך בעלי חיים.
6. דווח על ערכי p של אפקטים קבועים עבור נקודת מדידה עבור כל פרמטר.
7. לניתוח מיקרוספרה פלואורסצנטית של חוט השדרה, השתמש באזור (חוט השדרה התחתון, חוט השדרה העליון) בנוסף כהשפעה קבועה ואינטראקציה בין אזור לנקודת מדידה כדי להעריך אינטראקציות בין אזורים לנקודת מדידה, ולדווח על ערכי p של השפעות קבועות לאינטראקציה גם כן.
8. חשב אמצעים שוליים מותאמים בסיסית עם מרווח ביטחון של 95% (CI) עבור כל המשתנים התלויים בנקודות המדידה M1-M5, ולאחר מכן השוואות בין זוגות באמצעות בדיקות הבדלים פחות משמעותיות.
9. לבטא משתנים כממוצע (95% CI). לבטא משקל בעלי חיים כמו ממוצע ± סטיית התקן.
10. הצג ערכי p לא מותאמים.

כל שש החיות שרדו עד להשלמת הפרוטוקול. משקל בעלי החיים היה 48.2 ± 2.9 ק"ג; חמש חיות היו זכרים, וחיה אחת הייתה נקבה. החדרת מחט חוט השדרה, כמו גם מדידת שטף חוט השדרה היה אפשרי בכל בעלי החיים.

דוגמאות להקלטות מיקרו-סירקולטוריות של חוט השדרה בזמן אמת בשילוב עם הקלטות מיקרו-סירקולטוריות ומקרוהמודינמיות מוחיות במהלך הידוק צולב של אבי העורקים לאינדוקציה של איסכמיה, כמו גם במהלך אי-הפעלה ורפרפוזיה מוצגות באיור 3A, איור 3B. ההפרעה של זרימה בוני העורקים היורדת לוותה בירידה ניכרת בשטף חוט השדרה, בעוד הלחץ באפטיקה העולה גדל(איור 3A). רפרופוזיה הובילה להשפעות הפוכות (איור 3B).

ניתוח סטטיסטי של פרמטרי מאקרו ומיקרו-סירקולטוריה מוצג בטבלה 1. אמצעים שוליים מוערך מודל מעורב ומרווחי הביטחון שלהם מצביעים על ירידה ניכרת של שטף חוט השדרה במהלך איסכמיה. לעומת זאת, שטף מוחי גדל באופן משמעותי במהלך איסכמיה, כפי שצוין על ידי האמצעים השוליים המשוערים ומרווחי הביטחון שלהם. זה לווה בעלייה בלחץ העורקי, קצב הלב, ועמידות כלי דם מערכתית, בעוד תפוקת הלב ונפח השבץ ירד. ניתוח מיקרוספרה פלואורסצנטית גילה ירידה ניכרת בזרימת הדם המיקרו-סירקולטורית של חוט השדרה התחתון, בעוד שלא חל שינוי משמעותי בחוט השדרה העליון, כפי שצוין על ידי האמצעים השוליים המשוערים ומרווחי הביטחון שלהם. רפרופוזיה הובילה להשפעות הפוכות. למרות שהייתה ירידה נוספת בתפוקת הלב, נפח השבץ ולחץ העורקים בסוף הפרוטוקול, שטף חוט השדרה, כמו גם זרימת הדם מיקרו-סירקולטורית בחוט השדרה היו יציבות.

תוצאות מחקר זה מראות את היכולת של בדיקות מחט לייזר/דופלר לזהות שינויים בזמן אמת במיקרופרפוזיה בחוט השדרה. כצפוי, הירידה במיקרו-סירקולציה של חוט השדרה במהלך איסכמיה הייתה דרסטית עם שטף מיקרו-סירקולטורי מינימלי. התאוששות של שטף חוט השדרה התרחשה לאחר reperfusion. זלוף חוט השדרה התחתון, כפי שהוערך במיקרוספירות פלואורסצנטיות, הראה התנהגות דומה, ובכך תמך בשיטה. כצפוי, זלוף חוט השדרה העליון ושטף מוחי הראו התנהגויות שונות. למרות שהמיקרו-סירקולציה של חוט השדרה הייתה יציבה, המקרו-סירקולציה ירדה בסוף הפרוטוקול, והראתה אובדן קוהרנטיות המודינמית. בעוד הזרימה בבט העורקים היורד הייתה אפס במהלך איסכמיה, רפרטוזיה הובילה להתאוששות של זרימת העורקים. ניתוח היסטופתולוגי גילה נמק קל של חוט השדרה עם ציונים קליינמן עבור חוט השדרה התחתון בין 0 ל 2 עבור חוט השדרה העליון בין 0 ל 1.

איור 1: מיקום גשושית מחט לייזר/דופלר בחוט השדרה. (A)חשיפה כירורגית של מבני חוליות. (B)ניקוב חוט השדרה באמצעות צנתר וריד. (C)החדרת המחט לאחר הסרת מחט שיבוץ. (ד)קיבעון של גשושית המחט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: חשיפת בוני העורקים היורד ומיקום של גשושית זרימה ולולאת כלי שיט. (א)חשיפת באבי העורקים היורד לאחר גיוס פסגת הריאה השמאלית וחלוקת החלק השמאלי-רוחבי של הסרעפת. (B)חלוקת הרקמה שמסביב לחשיפה כירורגית. (ג)מיקום של דריסת יתר סביב העורקים היורד כדי להבטיח חשיפה מעגלית נאותה. (D)מיקום של גשושית זרימה כמו גם לולאת כלי שיט סביב העורקים היורד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הקלטות לדוגמה של אותות מיקרו-ביולוגיים ומקרו-מודרנינמיים במהלך איסכמיה וכן רפרופוזיה. הקלטות מדגמיות של אק"ג, לחץ באבי העורקים העולה כפי שנמדד באמצעות מיקרו-קטטר, זרימה באבי העורקים היורד כפי שנמדד באמצעות בדיקת זרימה קולית, חוט השדרה, כמו גם FLUX מיקרו-סירקולטורי מוחי כפי שנמדד באמצעות בדיקות מחט לייזר / דופלר. (A)מדגם 50 s במהלך אינדוקציה איסכמיה על ידי מהדק צולב אב העורקים supra-צליאק. (B)20 s מדגם במהלך אינדוקציה reperfusion על ידי פתיחה עדינה מחדש של מלחציים צולבים בוני העורקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: שינויים בפרמטרים המודינמיים במהלך הפרוטוקול. ערכים ניתנים כאמצעי שולי משוער מותאם בסיסית עם מרווחי ביטחון של 95%. ערכי p לא מותאמים של בדיקות F של ההשפעות העיקריות של נקודת המדידה ניתנים עבור כל פרמטר, כמו גם של השפעות אינטראקציה בין אזור לנקודת מדידה עבור microperfusion חוט השדרה העליון והתחתון. ערכי p לא מותאמים של השוואות זוגיות של נקודות מדידה בודדות עם M1 מוצגים גם הם. נקודות המדידה הן: M1 = אופטימיזציה המודינמית לפני איסכמיה/רפרפוזיה, M2 = במהלך איסכמיה, M3 = 1 שעות לאחר reperfusion M4 = אופטימיזציה המודינמית לאחר איסכמיה / רפרפוזיה, M5 = 4.5 שעות לאחר אינדוקציה של איסכמיה / reperfusion.

SCI המושרה על ידי איסכמיה חוט השדרה הוא סיבוך גדול של תיקון בוני העורקים עם השפעה עצומה על התוצאה החולה^{1,2,3,4,10,11,12}. טיפולים ממוקדי מיקרו-סירקולציה כדי למנוע ולטפל ב- SCI הם המבטיחים ביותר. הפרוטוקול מספק שיטה ניתנת לשחזור להערכה מיקרו-סירקולטורית של חוט השדרה בזמן אמת ומציע את היכולת להעריך השפעות של גישות טיפוליות חדשניות על מיקרו-סירקולציה של חוט השדרה בתנאי איסכמיה/רפרפוזיה.

ישנם כמה צעדים מתודולוגיים קריטיים במודל ניסיוני זה. כדי למנוע אובדן בעלי חיים, החוקרים חייבים להיות מנוסים בטכניקות הרדמה (החדרת ניקוז נוזל השדרתי, גישה סונוגראפית לכלי דם וטיפול המודינמי במהלך חשיפה אבי העורקים, מהדק צולב אבי העורקים, reperfusion) כמו גם בטכניקות כירורגיות (סטרנוטומיה, חשיפה לכלי דם, חשיפה כירורגית של אבי העורקים היורד). החדרת גשושית מחט חוט השדרה דורשת ניסיון, ידע מעמיק באנטומיה וכישורים טכניים מבוססים. עם זאת, מניסיוננו, עקומת הלמידה תלולה במידה ניכרת, ורוב החוקרים המנוסים יגיעו להצלחה תוך זמן קצר, אם כי יש להימנע מניסיונות מרובים למנוע פגיעות בחוט השדרה שעלולות להשפיע על המתודולוגיה.

צעד קריטי נוסף הוא השינוי מהמצב לרוחב ימין לעמדה עלובה כדי למנוע נקע או נזק של גשושית מחט חוט השדרה. עבור תמרון זה, 4-5 אנשים מומלצים, ריפוד נכון של אתר ההחדרה הוא חיוני, ויש לנקוט זהירות קפדנית לא לפרוק את הגשוש. חשיפת בינת העורקים היורדת דורשת גם כמה צעדים קריטיים. יש לגייס את פסגת הריאה השמאלית כדי לאפשר נסיגה עדינה של הריאה השמאלית כדי לחשוף את השדה הכירורגי. בנוסף, החלק השמאלי-לרוחב של הסרעפת צריך להיות ניתח כדי להקל על החשיפה. במהלך הכנה לאבי העורקים, תקשורת אופטימלית בין אותם חוקרים המבצעים ניתוח ואלה המספקים הרדמה וניהול המודינמי נדרשת כדי להבטיח יציבות לב-ריאה נאותה. במהלך הידוק צולב באבי העורקים, מומלץ להפחית את התשואה הוורידית. ללא תמרון זה, עלייה עומס חמור עלולה להתרחש שעלולה להוביל לפגיעה שריר הלב מזיק^39,40.

רפרופסיה צריכה להתבצע בזהירות עם נוזלים, vasopressors, inotropes מוכן לשימוש. במהלך reperfusion, שינויים דרמטיים להתרחש שעלולים להוביל תת לחץ דם חמור, arrythmias לב, וכישלון במחזור הדם⁴¹. עם זאת, התבוננות זהירה בהתנהגות המודינמית, ייזום מהיר של התערבויות, כמו גם שימוש בביצועים מובנים ועדינים במהלך שלב קריטי זה יכולים למנוע אובדן בעלי חיים. בנוסף, השימוש במרווחי זמן עולים של הידוק צולב של אב העורקים, ואחריו תקופות זמן לשיפור ההתחדשות, כפי שנעשה בפרוטוקול, מניע השפעות איסכמיות טרום מיזוג המשפרות את היציבות המודינמית במהלך reperfusion^42,43.

המודל מספק את היכולת לפקח על מיקרו-סירקולציה של חוט השדרה בנוסף להערכת מקרו-סירקולטוריה. בשל אובדן קוהרנטיות המודינמית שנראית לעתים קרובות בניתוח בסיכון גבוה וחולים במצב קריטי, יש צורך בהערכה ישירה של מיקרו-סירקולציה בחוט השדרה^13,30. מיקרו-מקיף תת-לשוני משמש לעתים קרובות להחלפת הערכה מיקרו-סירקולרית ישירה באיבר העניין⁴⁴. עם זאת, הניתוק בין מיקרו-קוטביות תת-לשונית לאיברים חיוניים הוכח, תוך הדגשת הערך של הערכה מיקרו-סירקולטורית ישירה בחוט השדרה, כפי שנעשה שימוש במודל הניסויי⁴⁵. לבסוף, למודל יש את היתרון של ניטור בזמן אמת של זרימת הדם בחוט השדרה בהשוואה להערכת מיקרוספרה פלואורסצנטית, המוגבלת על ידי שימוש לסירוגין וניתוח שלאחר המוות⁴⁶. את ההשפעה של הערכה בזמן אמת ניתן לראות בצורה הטובה ביותר כאשר מסתכלים על הקלטות לדוגמה במהלך איסכמיה, כמו גם אינדוקציה reperfusion, מראה שינויים מהירים microperfusion חוט השדרה. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי הכנסה גשושית לייזר דופלר בחוט השדרה עלולה להוביל לפציעות קטנות, אך ניכרות, של חוט השדרה.

כמו שלמות חוט השדרה יכול אולי להשפיע על הפרמטרים המודינמיים, זה יכול להיות חיסרון של השיטה. עם זאת, השימוש בטכניקות לייזר-דופלר להערכת מיקרופרפוזיה בחוט השדרה שימשו בעבר^47,48,49,50. יתר על כן, למרות שלא ראינו שינויים המודינמיים לאחר החדרת בדיקה, לא יכולנו לשלול השפעות המודינמיות הנגרמות על ידי שיטה זו. יש לציין כי שינויים hemodynamic עשויים גם להיגרם על ידי שימוש בזריקות מיקרוספירה, אשר, עם זאת, יהיה בעל חשיבות מינורית בבעלי חיים גדולים⁵¹. יתר על כן, תפקוד חושי או מוטורי עשוי להיות מושפע החדרת בדיקה ולכן, השימוש בהערכה פוטנציאלית חושית או מוטורית צריך להתבצע בזהירות בשילוב עם הערכת לייזר-דופלר.

בהקשר זה, טכניקת הזרקת המיקרוספירה עשויה להיות יתרון. בנוסף, הטכניקות לא צריך לשמש לניסויים כרוניים; עם זאת, זה נכון גם עבור זריקות מיקרוספירה, אשר מוגבלים לניסויים חריפים כי הם תלויים בניתוח רקמות שלאחר המוות. רוב המחקרים באמצעות טכניקות לייזר דופלר בוצעו בבעלי חיים קטנים^47,48,49,50 כאן, אנו מתארים טכניקה לשימוש חזירים, כמודל בעלי חיים גדול, אשר יכול להקל על תרגום למחקרים קליניים. טכניקת החדרת הפאראמדיה מתגברת על הבעיה של תהליכים ספיניים גדולים בחזירים, מה שמסבך מיקום נכון של בדיקות חוט השדרה. יתר על כן, הטכניקה יש את היתרון כי לכריתת או הסרה של רקמת דורה אין צורך, מניעת אובדן מתמיד של ליקר. כמו לחץ נוזל השדרתי יש השפעה עצומה על זלוף חוט השדרה³², המודל יש את היתרון של מדידה ואופטימיזציה של לחץ נוזל השדרתי בנוסף microperfusion חוט השדרה ויתייחס להשפעה של לחץ נוזל השדרתי על microperfusion חוט השדרה בפרויקטים עתידיים.

לפרוטוקול יש כמה מגבלות שיש להזכיר. ערכים מוחלטים של שטף חוט השדרה שונים במידה ניכרת בין בעלי חיים בשל הבדלים במצב בדיקה מדויק וקרבה של כלי חוט השדרה גדולים יותר. לכן, יש לבצע התאמות בסיסיות בעת השוואת ערכים. עם זאת, הבדלים פנים-אישיים בין נקודות מדידה עקביים מאוד כל עוד זהירות קפדנית מופעלת כדי למנוע תנועות של בדיקה מחט במהלך הפרוטוקול. יתר על כן, מחקר זה לא תוכנן כמחקר השוואה בין לייזר דופלר ושיטות מיקרוספירה פלואורסצנטית. בהתחשב במספר בעלי החיים, לא ביצענו ניתוח מתאם בין שתי השיטות האלה.

למרות ששתי השיטות הראו התנהגות דומה עם הפחתות משמעותיות במהלך איסכמיה והתאוששות לאחר reperfusion עבור שניהם, יש להתייחס להשוואה של השיטות באמצעות מחקרים שתוכננו כראוי בעתיד. עם זאת, השימוש במיקרוספרות אפשר גם הערכה של התנהגויות שונות למיקרופרפוזיה של חוט השדרה העליון והתחתון. בנוסף, ניתוח היסטופתולוגי גילה רק נמק חוט השדרה מתון בהשוואה למודלים אחרים של איסכמיה חוט השדרה³⁷. הארכת משך איסכמיה, כמו גם השמטת אמצעי התניה מוקדמת עלול להוביל לשינויים חמורים יותר שעשויים להיות הרצויים על ידי חוקרים מסוימים. למרות שהערכנו רק שינויים היסטופתולוגיים קלים, זה עשוי להיות שונה עם משך זמן ארוך יותר של איסכמיה. בהקשר זה, תקופה ארוכה יותר לאחר איסכמיה / רפרפוזיה לפני סיום הפרוטוקול עשויה גם הובילה לשינויים היסטופתולוגיים חמורים יותר. עם זאת, הפרוטוקול אפשר יציבות המודינמית שעה אחת לאחר reperfusion ללא צורך ביישום אינוטרופי או vasopressor נוסף או אפילו רציף.

להערכת התערבויות המודינמיות שונות, מודל זה מספק תנאים אופטימליים. למרות שהשתמשנו באופטימיזציה של נוזלים כדוגמה להתערבות המומינמית, ניתן להעריך גישות אחרות בשיטה זו. בעוד פרוטוקול זה מספק הערכה מיקרו-סירקולטורית במודל של איסכמיה/רפרפוזיה, משך איסכמיה מגביל את הערכת הגישות הטיפוליות במהלך איסכמיה לפני השיפוץ. יתר על כן, במהלך איסכמיה, וריאציה שינויים המודינמיים התרחשה (למשל, יתר לחץ דם, תת לחץ דם, טכיקרדיה, ברדיקרדיה, כמו גם אריתמיאס לב). תזרים ידני משפיע עוד יותר על משתנים המודינמיים במהלך שלב זה. לכן, הפרוטוקול אינו מומלץ להערכת גישות טיפוליות במהלך איסכמיה לפני reperfusion. עם זאת, הגדרות ניסיוניות אחרות, כגון שימוש בטכניקות תסחיף או קשירה, עשויות להיות משולבות עם הערכת בדיקת מחט לייזר/דופלר בחוט השדרה, כמתואר בפרוטוקול זה.

קונסטנטין ג'יי.C טרפטה קיבל אות כבוד על הרצאות של מקט. כל המחברים האחרים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים. מחקר זה נתמך על ידי האגודה האירופית להרדמה חוקר צעיר סטארט-אפ גרנט 2018.

המחברים רוצים להודות לנה בריקס, V.M.D, המכון לחקר בעלי חיים, בית הספר לרפואה האנובר, כמו גם גברת ג'וטה דממן, מתקן המחקר לטיפול בבעלי חיים, המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף, גרמניה, על מתן טיפול בבעלי חיים לפני פריופרטיבי וסיוע טכני שלהם בטיפול בבעלי חיים. עוד מבקשים המחברים להודות לד"ר דניאל מנזוני, המחלקה לכירורגיית כלי דם, הופיטל קירצברג, לוקסמבורג, על הסיוע הטכני.