Iletim bazlı Nomarski-tipi diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile Plazmonik nanopartiküller üzerinde spektroskopisi gerçekleştirme

Bu protokolün amacı, Plazmonik nano madde örneklerinin hazırlanması ve diferansiyel girişim kontrastı (DıC) mikroskobu ile tek parçacık spektroskopisi gerçekleştirme konusunda kanıtlanmış bir yaklaşımın ayrıntısı olmaktır.

Diferansiyel parazit kontrast (DıC) mikroskopisi, görünür menzilli ışık kullanarak görüntüleme mikroölçekli nesneler için en sık kullanılan güçlü bir görüntüleme aracıdır. Bu protokolün amacı, Plazmonik nano madde örneklerini hazırlamak ve onlara DıC mikroskobu ile tek parçacık spektroskopisi gerçekleştirme konusunda kanıtlanmış bir yöntemin ayrıntısı olmaktır. Tekrarlanabilen Spektroskopi denemeleri yapmak için birçok önemli adım dikkatle izlenmelidir. İlk olarak, simgeler örnek yüzey bulmak ve deneyler sırasında ilgi bölgeyi izleme yardımcı örnek substrat içine kazınmış olabilir. Daha sonra, substrat düzgün bir şekilde arındırılabilir ya da numunenin incelenmesini engelleyen veya belirsiz olan kirleticilerin temizlenmelidir. Bir örnek düzgün hazırlanmış bir kez, mikroskop optik yolu, Kohler aydınlatma kullanarak hizalanmalıdır. Standart Nomarski tarzı DıC mikroskop ile, özellikle Plazmonik nanopartiküller oryantasyona bağlı optik özellikleri gösterdiğinde, numunenin dönüşü gerekli olabilir. DıC mikroskobu iki içsel ortogonal polarizasyon alanına sahip olduğu için, dalga boyu bağımlı DıC kontrast deseni, çubuk şeklinde plasmonik nanopartiküller yönünü ortaya çıkarır. Son olarak, veri edinme ve veri analizlerinin dikkatle gerçekleştirilmesi gerekir. Bir kontrast değeri olarak DıC tabanlı spektroskopisi verileri temsil etmek için yaygındır, ancak yoğunluk verileri olarak sunmak da mümkündür. Tek parçacık spektroskopisi için DıC bu gösterisinde, odak küresel ve çubuk şeklinde altın nano-artiküller üzerinde.

1980 ' lerden bu yana, diferansiyel parazit kontrast (DıC) mikroskobu büyük ölçüde biyolojik bilimler içinde mikroölçekli nesneler için ayrılmış önemli bir görüntüleme yöntemi olarak görülmektedir. Ancak, 1950 ' lerde ve 1960 ' larda gelişimi sırasında, malzeme bilimi¹için bir teknik olarak amaçlanmıştır. Plasmonik nanopartiküllerle ilgili malzeme bilimlerindeki son gelişmeler ile optik mikroskopiye sahip malzemelerin karakterizasyonu ile ilgili artan bir ilgi yer almıştır.

Birçok optik teknikleri kesinlikle Nanomateryal karakterizasyon için kullanılabilir (örneğin, karanlık alan, Brightfield, polarize ışık, floresan, vb.). Karanlık alan yaygın nanopartikül araştırma popüler, ancak Scatter koleksiyonuna dayanır ve karmaşık örnekler hakkında sınırlı bilgi sağlar². Floresan kullanışlı olabilir, ancak sadece bu Luminesce veya düzgün lekelenebilir örnekleri ile. DıC microskopi, nanopartiküller analizi için değerli bir araç haline getirmek çeşitli özelliklere sahiptir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında DıC 'nin en sık belirtilen avantajları ve Plazmonik nanopartiküller şunlardır: hiçbir örnek boyama gerekli, hiçbir Halo efektleri, sığ alan derinliği, ve yüksek lateral çözünürlük³. DıC Plazmonik nano madde araştırması için değerli olan ek güçlere sahiptir. Her şeyden önce, iki içsel ve ortogonal polarizasyon alanları mevcut ve Spektroskopi amacıyla aynı anda ölçülebilir². İkincisi, Nanopartiküllerin kutuplanma sinyali son görüntü²' de yakalanmaz, bu da karanlık alan spektroskopisi ölçümlerinde ciddi bir endişe nedeni olabilir.

Bu makalenin amacı, Plazmonik nanopartiküller üzerinde spektroskopinin gerçekleştirilmesi için iletilen ışık Nomarski DıC mikroskopisini kullanmak için net bir metodoloji sağlamaktır. DıC son derece çeşitli malzemeler için uygulanabilir güçlü bir teknik olmasına rağmen, aynı zamanda görüntüleme nanopartiküller düzgün çalışması için büyük beceri ve anlayış gerektiren bir tekniktir. İletim tabanlı Nomarski DıC mikroskobu sadece kısaca burada gözden geçirilecektir karmaşık bir ışık yolu¹ vardır. DıC optik treni Şekil 1' de görüntülenir. Işık, ilk olarak bir polarizatör ve bir kiriş bölme Nomarski prizma aracılığıyla geçirilen önce mikroskop yoluyla aktarılır örnek düzlem üzerine kondansatör tarafından odaklanmıştır. Amaç geçtikten sonra, ışık dedektöre çıkmadan önce bir ışın birleştiren Nomarski prizma ve bir analizörü karşılaştığında. İki polarize ve Nomarski prizmalar DıC görüntü oluşumu için kritik ve DIC iki ortogonal polarizasyon alanları üretmek için sorumludur¹. Okuyucunun çalışma ilkeleri ve Nomarski DıC microscopes optik yolu hakkında daha fazla bilgi almak için, ya da Nomarski DıC ve diğer STIs diğer stilleri arasındaki farklar hakkında bilgi için, lütfen bu konular¹ diğer iyi yazılmış hesapları bakın ^{4 , 5 , 6 , 7}' ye kadar.

Onlar Nomarski DıC, karanlık alan veya başka bir mikroskopi tekniği ile olsun, onlara spektroskopisi gerçekleştirmeye çalışmadan önce Plazmonik Nanopartiküllerin temel doğası anlamak için aynı derecede önemlidir. Plazmonik alanında, nanopartiküller 10-100 Nm^8,9ölçeğinde ölçümlendirmelere sahip parçacıklar olarak tanımlanır. Nanopartiküller birçok şekil (örneğin, küreler, çubuklar, yıldızlar, dumbbells, vb.) alabilir ve önemli özelliklerinin çoğu elektromanyetik spektrumunun ultraviyole-görünür-yakın kızılötesi aralığında ışık ile etkileşimlerden ortaya çıkabilir. "Plazmonik" terimi nanopartiküller¹⁰ile sınırlı değildir; Ancak, nanopartiküller tartışırken, lokalize yüzey plasmon rezonans (LSPR) referans olarak kullanılır. LSPR, yüksek spesifik ve nispeten dar frekans bandı⁸' in elektromanyetik radyasyonuyla Coulombic etkileşimi nedeniyle bir nanopmaddeki iletim elektronlarının osilasyona neden olduğu bir fenomen. Bu aynı frekanslarda, Plazmonik nanopartiküller ışık emilimi ve saçılma artan sergiler, optik mikroskobik ile gözlemlenebilir hale. Birçok durumda, Kondenser²' den önce bant geçiren filtreleri yerleştirerek, görüntüleme kontrastı geliştirmek ve LSPR efektini önlemek için başarısız olan ışığı ortadan kaldırmak için nano opartikülleri gözlemlemek tercih edilir. Filtreleri kullanmak da tek parçacık spektroskopisi deneylerini gerçekleştirmenizi mümkün kılar.

LSPR ile ilgili optik davranış, Nanopartiküllerin boyutuna ve şekline son derece bağımlıdır ve birçok optik mikroskopi tekniği ile incelenebilir. Ancak, bir anisotropik (yani, küresel olmayan) şekli ile Plazmonik nanopartiküller oryantasyon bilgilerini deşifre etmek için, ışık alanının polarizasyon kullanmak gereklidir. Polarizasyon alanını veya numune substrat 'ı küçük artışlarla dikkatle döndürerek, bireysel nanopartiküller için oryantasyona bağlı spektroskopik özellikleri izlemek mümkündür. Rotasyon ve polarizasyon aynı zamanda bir spektral özelliği Nanoparticle yüzey elektronlar bir dipolar veya daha yüksek sipariş salınımı nedeniyle olup olmadığını belirlemede yardımcı olabilir. Ancak, izotropik durumunda (yani, küresel) nanopartiküller, spektral profil aslında polarize ışık altında örnek döndürme üzerine değişmeden kalır.

DıC mikroskop (Şekil 2) ile görüntülendiğinde, nanopartiküller gri bir arka plana karşı gölge dökme beyaz ve siyah bir görünüme sahip havadar bir diske sahiptir. Küresel nanopartiküller bu görünümü rotasyon altında ve bant geçiren filtrelerinin değiştirilmesi ile koruyacaktır; Ancak, filtrenin merkezi dalga boyu, küre 'nin tek dipolar LSPR dalga boyu¹¹' den daha ayrılmış hale geldiği için partiküller giderek görünümden solacak. Nanoçubuklar görünümü,²döndürüldüğü gibi oldukça dramatik bir şekilde değişebilir. Nanoray olan iki LSPR bantları dipolar davranış, konumu nanorods fiziksel boyutları dayanmaktadır. Bir Nanorod boyuna ekseni DIC polarizasyon alanlarından birine paralel olarak yönlendirilmiş olduğunda, havadar disk, LSPR dalga boyu ile ilişkili bir bant geçiren filtresi ile görüntülendiğinde tüm beyaz veya tüm siyah görünecektir. Numuneyi 90 ° döndürdükten sonra, ters rengi alacaktır. Alternatif olarak, bir Nanorod Enine ekseni uzunlamasına eksenine dik olduğundan, iki eksen için LSPR dalga boylarını eşleşen filtreler arasında geçiş yaparken çubuk karşı renk alacaktır. Diğer Oryantasyonlar ve filtre ayarlarında, nanoçubuklar daha fazla küreler gibi görünecektir, çeşitli gölge dökme havadar disk desenleri sunuyor. Enine eksenine sahip nanoçubuklar için 25 Nm <, DIC mikroskobu kullanarak LSPR 'nin dalga boyu sinyalini algılamak zor olabilir.

Tek parçacık spektroskopisi gerçekleştirmek için doğru optik bileşenleri kullanmak ve bunları düzgün şekilde hizalamak önemlidir. DıC microskopi yeteneğine sahip bir objektif kullanılmalıdır. Tek parçacık deneyleri için, 80x veya 100x yağ hedefleri idealdir. Nomarski DıC prizmalar normalde üç çeşit gelir: Standart, yüksek kontrast, ve yüksek çözünürlük. İdeal tip yüksek deney amacına ve nanopartiküller boyutuna bağlıdır. Standart prizmalar birçok deney için iyidir; Ancak daha küçük nanopartiküller (< 50 Nm) ile çalışırken, partikül kontrastı azalır, çünkü partiküller¹¹' de azaldığı için yüksek kontrast prizmalar yararlı olabilir. DIC karşıtlığını ayarlamak, bir polarize döndürerek veya mikroskop markasına veya model⁶' ya bağlı olarak DIC prizlerden birini çevirerek elde edilir.

Kohler aydınlatma ve polarize ayarları ayarladıktan sonra, spektroskopi verileri toplama sırasında bu ayarları yeniden değil önemlidir. Ayrıca, filtreler ve açı ayarları arasında geçiş yaparken bile veri toplama sırasında her zaman sabit bir ortalama arka plan sinyali saklanması gerekir. Gerçek ideal arka plan değeri bilimsel kameranın dinamik aralığına bağlıdır, ancak genel olarak, arka plan kameranın maksimum algılama seviyesinin% 15 –% 40 aralığında olmalıdır. Bu, optimum parçacık karşıtlığını etkinleştirirken kamera sensörünün doyurılması olasılığını azaltır. Spektroskopi verileri toplamak için, renkli kamera aksine, siyah ve beyaz görüntüleri yakalar bilimsel bir kamera ile çalışmak gereklidir.

Numune hazırlama plasmonik nanopartiküller görüntüleme başka bir kritik yönüdür. DıC mikroskobu operatörleri numunenin optik özellikleri ve numunenin substrat bir anlayış olması zorunludur. "Önceden temizlenmiş" mikroskop cam yeterli görüntüleme nanopartiküller için hazırlanmış değildir, ve doğru yeniden temizlenmelidir numunenin engelsiz gözlem sağlamak için numune biriktirme önce. Mikroskop slaytlar için birçok temizlik protokolleri daha önce¹²belgelenmiştir, ancak normalde deneysel çalışmalarda bildirilen bir adım değildir.

Son olarak, veri analizi yöntemleri tek parçacık spektroskopisi için son bileşenidir. Her nano madde için maksimum ve minimum yoğunluklar, yerel arka plan ortalamasının yanı sıra ölçülmelidir. İlgi parçacıkları arka planda enkaz, substrat kusurları veya düzensiz aydınlatma olmayan alanlarda yer olmalıdır. Bir nanopmaddenin spektral profilinin belirlenmesi için bir yöntem, her dalga boyu parçacık karşıtlığı hesaplayarak,¹¹,^13,14,15aşağıdaki denklemin kullanarak:

Alternatif olarak, tek bir parçacık spektrumunun, DıC 'nin iki polarizasyon alanını temsil eden, bireysel maksimum ve minimum sinyal bileşenlerine ayrılabilir, böylece iki eşzamanlı olarak toplanan yön bağımlı spektrumları görüntüler, iki denklem aracılığıyla:

1. standart cam mikroskopisi slaytları ile numune hazırlama

1. Numune biriktirme için cam mikroskop slaytları hazırlayın.
   Not: bazı durumlarda, cam etanol yerine ultra saf suda saklamak için daha uygun olabilir. Ancak, su veya hava depolama zaman içinde cam hidrofobik yapar.
   1. En iyi sonuçlar için cam veya kuvars mikroskop slaytlar ve kapak camı satın alın.
   2. Karalama kalemi kullanarak, her cam kapak kayağının ortasına sığ ve kısa bir çizik işareti koyun.
   3. Cam parçaları, toz, toz, organik kalıntı ve görüntüleme kalitesini veya numune birikimi etkileyen diğer kirleticileri kaldırmak için "önceden temizlenmiş" satın alınsa bile tüm mikroskop camını temizleyin.
      Not: aşağıda bu temizleme yöntemi, burada açıklanan numunelerin türleri için iyi çalışır ve sert kimyasalların kullanımından kaçınır. Harsher kimyasallar cam Etch ve taşıma ve bertaraf daha fazla bakım gerektirir.
      1. Depolama rafları üzerine ve sonra bir Beaker içine veya bir boyama kavanozu içine mikroskop cam yerleştirin. Her parça ve mikroskop cam yüzeyi tamamen temizlik maddeleri maruz olmalıdır, çünkü raf olmadan kadehler ve diğer laboratuar cam altındaki mikroskop cam yerleştirmeyin.
      2. Kap içine ~ 1 mL sıvı deterjan (malzeme tablosu) dökün ve su ile kap kapalı üst. 30 dakika boyunca sonikat.
         Not: temizlik işlemi başladığında, cam üzerinde parmak izi kalıntıları bırakmamak için sadece eldiven takarken camı ele alın.
      3. Temizleme kabının sıvı içeriğini bir lavabonun içine dökün. Deterjanın tüm görünümünü kaldırmak için kabı birkaç kez Ultra Saf suyla durulayın. Kabı Ultra Saf suyla doldurun. Başka bir 30 dakika için mikroskop cam ile konteyner sonikat.
      4. Önceki adımı en az bir kez daha tekrarlayın. Deterjan tüm izleri kaldırılmıştır açıktır kadar su sonication ek Tur gerçekleştirin.
      5. Temizleme konteynerin içeriğini dökün. Kabı Ultra Saf suyla durulayın. Konteyner etanol ile doldurun. 30 dakika boyunca mikroskop camı sonikat.
      6. Temizleme kabının içeriğini bir atık kabına dökün. Etanol ile doldurun. Buharlaşma yoluyla etanol kaybını önlemek için konteyner kapak. Bu konteynerdeki mikroskop camını deneme zamanına kadar saklayın. Slaytlar, kapalı bir konteynerin içinde etanol altında kalmaları sürece temiz ve kullanışlı kalır.
2. Nanopmakale çözeltisi hazırlanması
   1. Bir mikropipet kullanarak, 0,05 mg/mL altın nano-madde çözeltisi olan 100 μL 'nin orijinal depolama konteynerinden çıkarılmasını ve solüsyonu bir 1,5 mL santrifüjler tüpüne çıkarmanız.
   2. Numuneyi 6.000 x g'de 10 dakika santrifüjün.
   3. Aşırı yüzey ortadan kaldırmak için bir mikropipet ile süpernatant çıkarın.
   4. Bir mikropipet kullanarak, 100 μL 'nin santrifüj tüpüne ultra saf su yerleştirin.
      Not: tüm süpernatant ilk denemede kaldırılamaz ise, santrifüjleme ve Resuspension adımlarını tekrarlayın.
   5. Kısa bir süre içinde Pellet yeniden pelletini örnek Vortex. Tamamen pelletini ve nanopartikül toplamları kırmak için 20 dakika hemen sonra sonicate.
      Not: örnek hemen kullanılırsa, mikroskop cam üzerine çözüm yatırma önce 20 dakika boyunca tekrar sonicated olmalıdır.
3. Numune biriktirme
   1. Temizlenmiş kapak fişi ve mikroskop slaytlarını depolama konteynerinden çıkarın. Basınçlı nitrojen veya argon ile bardağı kurutun.
   2. Bir mikropipet kullanarak, adım 1.2.5 ' den kapak fişi üzerine 6 μL nanopmakale solüsyonu bırakın. Damlacık eşit olarak yaymak için, dikkatle ikinci bir kapak slip veya mikroskop slayt gibi, kapak kayma üstüne bir ikinci, daha büyük bir mikroskop cam parçası yerleştirin. Cam iki adet arasında sıkışıp hava kabarcıkları alma kaçının.
      1. Örnek substrat üzerine çevirin ve orta çözeltinin buharlaşma önlemek için tırnak cilası dar bir çizgi ile kapak kayma kenarlarını mühürleyin.
      2. Alternatif olarak, görüntü örnek "kuru", cam istenmeyen parçası çıkarmadan önce, çözüm 5 – 15 dakika kapak slip için stand izin. Hafifçe basınçlı nitrojen veya argon ile kapak fişi kuru darbe.
   3. Mümkünse, hazırlıktan hemen sonra görüntü örnekleri. Eğer bu mümkün değilse, numuneleri görüntüleme kadar Petri tabağı gibi kapalı bir kabın içinde saklayın.

2. DıC görüntüleme

1. Objektif ve kondansatörü hizalayın.
   1. Numuneyi mikroskop üzerine yerleştirdikten sonra, üzerinde örnek ile odak düzlemini bulun. İlk bulun ve daha önce oluşturulan karalama işareti odaklanmak. Sonra nanopartiküller görünüme gelene kadar odak ince tune.
   2. Kondenser doğru yerleşimi belirlemek için, Kohler aydınlatma yöntemini kullanın. ⁵ Kohler aydınlatma yüksek büyütme (80x, 100x) daha kolay ilk olarak 20 x gibi daha düşük bir büyütme, Kohler aydınlatma ayarı ile elde edilir.
      Not: Normalde, Kohler aydınlatma tek bir örnek görüntüleme sırasında yeniden ayarlanması gerekmez. Ancak, yeni bir mikroskop slayt geçiş yaparken Kohler aydınlatma düzgün ayarlanmış olduğunu doğrulamak için iyi bir uygulamadır.
2. Kontrast ayarlarını en iyi duruma getirin.
   1. Görüntüleme için örnek içinde ilgi bir bölge seçin. Bölgenin kamera görünümü alanında merkezi ve gerektiğinde odağı ayarlayın.
      1. Mikroskop de senarmont tasarımı varsa, maksimum arka plan tükenmesi yakın set polarize ile başlayın ve yavaş yavaşça arka plan yok olma yönünde polarize döndürmek. Arka plan yoğunluğu kademeli olarak artacaktır.
      2. Mikroskop bir de Senarmont tasarımı yoksa, maksimum arka plan tükenmesi optik tren seti ile başlayın. Bu durumda, kademeli olarak arka planda tükenme yönünde objektif prizma konumunu ayarlayın.
         Not: nanopartiküller en büyük yoğunluk farkını (yani kontrast) ortalama yerel arka plan değerinden ulaştığınızda ideal ayar elde edilir. Plazmonik nanopartiküller için, optimum kontrast normalde nispeten karanlık bir arka plan ile elde edilir, böylece maksimum arka plan tükenmesi yakın ayarlar.
3. Örnek görüntü.
   1. İşlem ile etkileşime gelen sokak aydınlatması önlemek için oda aydınlatma kapatın.
   2. Bilimsel görüntüleme kamera ile nanopartiküller görüntülerken, optimum arka plan seviyesini belirlemek. Ana LSPR dalga boyu ile ortak bulunan merkezi dalga boyu ile yarım maksimum (fwhm) bant geçiren filtre 10 Nm tam genişlik kullanarak, ilgi bölgeyi görüntüleyin. Arka plan seviyesi kameranın maksimum kapasite seviyesinin% 15 –% 40 aralığında olana kadar lamba yoğunluğunu veya pozlama süresini ayarlayın ve ilgi alanı içindeki hiçbir nesne, kameranın maksimum yoğunluk seviyesinin% 90 'ini aşan sinyal yoğunlukları sergiler.
      Not: adım 2.3.2 hedefi filtreleri arasında geçiş yaparken sensörü doyurarak önlemek için. İdeal arka plan seviyesi örnekler ve kameralar arasında farklılık gösterecektir. Bu adım tamamlandıktan sonra, pozlama süresi ayarlanabilir ama lamba yoğunluğu değil.
   3. Her bir fwhm 10 Nm ve tüm ilgi dalga boyu aralığı boyunca görüntüleme sağlayan bir dizi bant geçiren filtreleri ile örnek görüntü. Pozlama süresini ayarlayarak arka plan yoğunluğunun yansımadan görüntüye (birbirlerinin ~% 5 ' i içinde) tutarlı kalmasını sağlayın. Filtreleri değiştirdikten sonra, görüntü yakalamadan önce numuneyi yeniden odaklanın.
   4. Tüm bilgileri korumak için görüntüleri sıkıştırılmamış TIFF dosyaları ve/veya yazılımın yerel dosya biçiminde kaydedin.
4. Örneği döndürün.
   1. Numunenin görüntülerini orijinal konumunda topladıktan sonra, örnek şimdi döndürülebilir ve ışık yolundaki ek yönlerde görüntülenebilir. 180 ° veya 360 ° aralığında (örneğin, 10 ° veya 15 °) düzenli aralıklarla rotasyon gerçekleştirin.
      Not: döndürme, döndürülemez bir örnek aşama gerektirir.
   2. 2.1-2.3 bölümlerinde olduğu gibi, görüntünün görüntüye tutarlı bir arka plan düzeyi sağlamak için kamera ayarlarını yapın.
      Not: Kohler aydınlatma hiçbir ayarlama yapılmalıdır.

3. ımagej kullanarak veri analizi

Not: aşağıdaki hesaplamalar çeşitli yazılım paketlerinde ve bazen görüntüleri toplamak için kullanılan yerel programda gerçekleştirilebilir. Imagej Ulusal Sağlık Enstitüleri (NıH) serbestçe kullanılabilir bir yazılımdır.

1. Parçacık karşıtlığını veya yoğunluğunu hesaplayın.
   1. ImageJ ile görüntüyü açın.
   2. Dikdörtgen aracı seçin ve ilgi ana bölge etrafında bir dikdörtgen çizin.
   3. Araç çubuğunda resim'i, ardından Yakınlaştırma'Yı, sonra da seçimiseçin. Görüntüleme penceresi seçili alanda yakınlaştırır.
   4. Araç çubuğunda, resim'i seçin, ardından ayarlayın, ardından Parlaklık/kontrastseçeneğini belirleyin. Yeni bir pencere görüntülenir. Örnek bölgenin daha iyi görüntülenmesini sağlamak için dört ayarı ayarlayın: minimum, maksimum, parlaklık ve kontrast. Bu ayarlamalar bilimsel verileri değiştirmez, yalnızca örnek bölgenin daha iyi görünürlüğünü etkinleştirir.
      Not: adımları 3.1.3 ve 3.1.4 birden çok kez ve ters sırada gerçekleştirilebilir.
   5. Dikdörtgen aracını yeniden kullanarak, ölçülecek ilk nano maddenin etrafında bir kutu çizin. Kutu sadece nanopmaddenin havadar diskten biraz daha büyük olmalıdır.
   6. Araç çubuğunda, analizet 'i ve ardından ölçü birimi'ni seçin. Seçili kutunun içinde bulunan pikseller için minimum, maksimum ve ortalama yoğunlukları raporları yeni bir pencere görüntülenir.
   7. Arka plan kontrast nispeten bile ve hiçbir parçacık veya kirletici mevcut olduğu parçacık, hemen bitişik bir alana nanopartikül ölçmek için kullanılan kutuyu sürükleyin. Kutunun orijinal boyutunu koruyun.
   8. Arka plan alanı için Ortalama yoğunluğunu belirlemek üzere Ölçü aracını kullanın.
   9. Her biri için kalan parçacıkları ve bitişik arka plan alanını ölçün.
   10. Serinin tüm görüntülerde her parçacık için işlemi tekrarlayın.
   11. Tüm dalga boyları ve açıları arasında her parçacık kontrast veya yoğunluğunu hesaplamak için bir elektronik tabloya veri dışa aktarın.
   12. Aşağıdaki denklem^13,14,15kullanarak her partikül karşıtlığı hesaplayın:
       
       Not: Bu denklemin kullanılması, parçacık kontrastı her zaman 0 > olmalıdır.
   13. Ölçülen maksimum parçacık yoğunluğunu arka plan ortalamasına bölerek parçacığın arka planda ayarlanmış maksimum değerini hesaplayın:
       
   14. Aynı şekilde, ölçülen minimum parçacık yoğunluğunu arka plan ortalaması ile bölerek arka planda ayarlanan minimum değeri hesaplayın:
       
       Not: hesaplanan, en fazla bir değere sahip olması gerekir, en az birden az olacaktır. Her değeri "1" tarafından çıkarmak için kabul edilebilir, böylece ortalama arka plan temelde sıfır, maksimum pozitif bir değer olarak temsil edilir ve minimum değer¹⁶negatif bir değer atanır. Bu ikinci yaklaşım, analistin, her kutuplaşma alanlarının her birinde neler olduğunu ayrı olarak düşünmesini sağlar, bu da anisotropik parçacıklar okurken yararlıdır.
   15. Belirli bir nanopartikül pozisyonunda spektral profili grafik için, x ekseni boyunca dalga boyu ile veri çizmek ve kontrast veya yoğunluk y ekseni boyunca.
   16. Dönme profilini belirli bir dalga boyunda grafiklendirmek için, döndürme açısını x ekseni boyunca ve y ekseni boyunca kontrast veya yoğunluğa çizin.

Çıplak gözle görülebilecek kadar büyük örneklerle çalışırken, cam substrat üzerinde simge yerleştirme normalde gerekli değildir. Ancak, Nanomalzemeler ile çalışırken veya numunenin dönüşü gerektiğinde, simgeler, numunenin yönünü bulmak, ayırt etmek ve izlemek için kolay bir yöntem sağlayabilir. Daha sofistike teknikler cam substratlar üzerinde Simgesel yapılar bırakarak için kullanılabilir olmasına rağmen¹⁷, bir karalama kalemi ile cam çizilmeye birçok durumda çalışan bir ekonomik ve basit bir yöntemdir. Çizik işaretleri veri etkileyen potansiyeline sahip karmaşık bir arka plan oluşturmadan bu simge yapılarına hemen bitişik olan örnek bölgeleri incelemekten kaçınmak önemlidir (Şekil 3). Ancak, çizik işaretleri uçları, "örümcek ağları" genellikle sıfırdan dışa doğru genişletir. Bu çizgiler oldukça simge olarak değerlidir, ancak tekrar, bu kusurları ile çakışırsa nanopartiküller kaçınılmalıdır.

DıC mikroskobu ile optimum görüntüleme elde etmek için, uygun odak düzlemini belirlemek hayati önem taşımaktadır. Biraz odak dışında olan nesneler bulanık görünür, kenarları bulanık ve kontrast azalır. Şekil 4 farklı derecelerde odak dışında olan altın nanopartiküller görüntüler. Sağ alt köşesinde nanopartiküller odağı, bu görüntünün sol üst köşesinde yaklaşım olarak nanopartiküller daha uzak odak haline iken. DıC sığ bir alan derinliğine sahip olduğundan, bazı nanopartiküller bir cam substrat üzerinde görüntüleme zaman diğerleri odak dışında iken odak olması nadir değildir. Sonuç olarak, bir deney sırasında mikroskop üzerinde ayarlamalar yaparken sürekli olarak aynı parçacıklara odaklanmak önemlidir.

Şekil 5 görüntüleme altın nanospheres iken polarize ayarları ayarlama etkisi bir örnek sağlar. Beş nanopartiküller odaklanabilir, biri biraz odaklanabilir. A 540 NM bant geçiren filtresi 10 Nm fwhm ile optik yolda da oldu. Bu görüntü dizisinde, arka plan parlaklığı, beş parçacığın arka plana karşı daha belirgin olmasını sağlamak için görüntü edinme işleminden sonra ımagej ile ayarlandı. Polarize bir de senarmont tasarlanmış nomarski DIC mikroskop 0 ° olarak ayarlandığında, bu analizöre ortogonal (Şekil 5A). 0 ° ' de, parçacıklar orta bölümünde çalışan karanlık bir şerit ile çoğunlukla beyaz görünür. Bu nano küre örnekleri için çapraz polarizasyon göstergesidir. Polarize farklı açılara döndürüldüğünde (Şekil 5B-E), parçacıklar güneybatısında doğru koyu gölgeler döküm gibi görünüyor. Sinyalin siyah-beyaz bileşenleri, DIC 'nin iki polarizasyon alanı sonucunda ortaya çıkar ve bant geçiren filtreleri ile çalışırken Plazmonik Nanopartiküllerin oryantasyonu hakkında bilgi sağlar. Polarize daha yüksek açılara doğru döndürüldüğünde, gölge deseni benzer kalır. Ancak, parçacık kontrast değerleri önemli ölçüde değişir. Bu, yukarıda verilen denklemin kullanılması ile, bireysel partiküllerin kontrast değerlerini ölçerek en iyi şekilde gösterilmiştir. Siyah kutu ile vurgulanan parçacık 0,65 kontrast değerleri (çapraz polarize), 0,84 (polarizer kayması 5 °), 1,10 (10 °), 0,44 (20 °) ve 0,23 (45 °) vardır. Bu nedenle, bu örnek için, en iyi görüntüleme ayarı 10 ° polarize vardiya ile. Plasmonik nanopartiküller genellikle 5 ° – 15 ° aralığında bir polarize ayarı gerektirir ve bunlar normalde ideal ayarı tanımlamak için kullanılmalıdır daha küçük artışlarla. Küresel altın nanopartiküller görüntüleme ve analiz hakkında daha fazla bilgi için, okuyucular Sun ve al.¹¹tarafından önceden çalışmaya atıfta bulunmaktadır.

Anototropik şekilli nanopartiküller nanospheres daha yüksek karmaşıklık desenleri üretir. Altın nanoçubuklar (Şekil 6) uzunlamasına LSPR dalga boyunda, 650 nm görüntülenmiş. İlk resimde (Şekil 6a), beş parlak nanoray ve birkaç dimmer parçacık belirgindir. Bunun yerine bir gölge döküm görünümü sahip, üç çubuklar ağırlıklı olarak siyah havadar diskler var iki çoğunlukla beyaz iken. Polarize, çapraz polarizasyon ayarının solunda 10 ° ' ye ayarlandı. Şekil 6B'de, çapraz polarizasyon kullanıldı; tam beyaz havadar diskler gibi parçacıklar sadece üç görünür. Diğerleri ortadan kayboldu veya biraz odak dışında görünüyor. Polarizatör, çapraz polarizasyon (Şekil 6C) sağındaki 10 ° ' ye ayarlı olarak, desen şimdi Şekil 6agözlenen ne tersine çevrilir. Polarize sonraki 45 ° sağ çapraz polarizasyon (Şekil 6d), maksimum ayarı, partiküllerin bu ortamda renklerini korumak göstermek için, ancak kontrast önemli ölçüde reddetti döndü. Kalan şekil panellerinde, nanopillerin toplanması kademeli olarak tam 90 ° saat yönünde döndürülürken, polarize 10 ° ' de çapraz polarizasyon sağa ayarlandı. Desen her Nanorod için kademeli olarak değişir ve tam 90 ° rotasyondan sonra parçacıklar renklerini ilk ayardan tersine çevirdiler. Kısacası, bir Plazmonik Nanorod eksenleri biri iki polarizasyon alanlarından biri ile sıralı ise, ve Nanorod bu eksen ' LSPR dalga boyunda görüntülenmiş ise, Nanorod çoğunlukla beyaz veya çoğunlukla siyah görünür, hangi polarizasyon alanı aligne bağlı olarak d (Şekil 6a, C)². Nanopmadde tam 90 ° döndürülürse (Şekil 6H), şimdi karşı polarizasyon alanı ile sıralı ve ters renk almak olacaktır. Bunun yerine nano madde sadece 45 ° döndürülmüş ise (Şekil 6F), o zaman parçacık en büyük gölge döküm görünümünü sergiler bir konumda olacak, plasmonik nanospheres ile gözlenen ne çarpıcı benzerlik gösteren. Bu optik davranışların bir sonucu olarak, bir anisotropik şekli ile Plazmonik nanopartiküller genellikle nanospheres üç boyutlu gölge döküm görünümüne sahip yerine düz bakmak. Optik davranışla bu farkın sonucu, daha önce birden fazla araştırma çalışmaları²' de tartışıldığı gibi, küresel ve anisotropik şekildeki Plazmonik nanopartikülleri ayırt etmek için yararlanılabilmesi, ^3,6,^7,11,13,16.

Son olarak, Şekil 7 temsil tek parçacık spektroskopisi verileri, bir altın NanoSphere karşıtlığı (şekil 7a)¹¹, tek bir altın Nanorod yoğunluğu boyuna ekseni ile polarizasyon birine paralel odaklı alanları (şekil 7b)⁶ve yoğunluk profili tek bir altın NANOROD onun LSPR dalga boyu ve sahne döndürme sırasında (Şekil 7c)⁶. Her iki sunum yöntemi de LSPR efektinin genişliğini ve konumunu gösterir. Bir anisotropik şekli ile Plazmonik nanopartiküller için, yoğunluk ve dönme verileri etkisinin yönünü ortaya çıkarır, ve bu nedenle, daha önce bağıntılı çalışmaları ile kanıtlanmış örnek substrat, parçacık oryantasyonu DIC ve şanzıman elektron mikroskobu gibi parçacıklar^2,16,18.

Şekil 1: iletilen ışık Nomarski tabanlı DIC mikroskobu ışık yolu. Işık kaynağını (S) ayrıldıktan sonra, ışık bir polarize (P), bir ışın-kesme Nomarski prizma (NP), kondansatör (C), odak düzlem (FP), amaç (O), bir kiriş-Nomarski prizma (NP), Analyzer (A) ve sonunda dedektör (D) birleştirerek geçer. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: LSPR dalga boylarında 10 Nm bant geçiren filtresi ile görüntülenmiş Plazmonik Nanopartiküllerin örnekleri, DIC mikroskop kullanarak. Her iki görüntü 100x toplanır. (A) 40 Nm çap ile gümüş nanospheres 10 Nm fwhm sahip bir bant geçiren filtresi ile 480 Nm 'de görüntülenmiş. (B) 10 Nm fwhm ile bir bant geçiren filtresi kullanılarak 700 nm 'de görüntülenmiş Rod-benzeri altın nano maddeler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: karalama kalemi ile cam kapak kayma içine yapılan bir çizik görüntüsü. Gerçek girintileme sonuna yakın, dar ve sığ bir dizi "örümcek ağı" çizgiler çizilmeye kendisi, bir görüntüleme dönüm noktası olarak kullanılabilecek bir desen sonuçlanan şube. Bu görüntü 100x büyütme ve geniş bant beyaz ışık kullanılarak toplanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: altın nanospheres 100x genişbant beyaz ışık ile görüntülenmiş. Alt sağ parçacıkların odağı vardır ama parçacıklar sol üst köşeye doğru odak düzleminden uzağa sürüklenmeye. Görüntü ortasında nesne enkaz olduğunu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 5: altın nanospheres 540 NM bir dalga boyu farklı polarize ayarları bir dizi altında görüntülenmiş ve 100x bir büyütme. Arka plan parlaklığı, parçacıkları daha belirgin kılmak için ımagej ile görüntüleme sonrası ayarlandı. Polarizer ayarı (A) 0 ° (analiz için polarizer ortogonal), (B) 5 °, (C) 10 ° (Bu görüntü serisinin en iyi kontrast), (D) 20 °, ve (E) 45 °. Siyah kutudaki parçacık ölçülen kontrast (A) 0,65, (B) 0,84, (C) 1,10, (D) 0,44 ve (E) 0,23. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 6: görüntüleme anizotropik Plazmonik nanopartiküller örneği: 650 nm uzunlamasına LSPR dalga boyunda altın nanoçubuklar ve 100x bir büyütme. Ana ilgi parçacıkları sarı kutu içine alınır. Polarizer ayarları şunlardır: (A) sol 10 °, (B) 0 °, (C) sağ 10 °, (D) sağ 45 °. Polarize sağ 10 ° olarak ayarlanmış, sahne saat yönünde döndürüldü (E) 20 °, (F) 45 °, (G) 70 °, ve (H) 90 °. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 7: tek parçacık spektroskopisi verilerinin temsili sonuçları. (A) altın NanoSphere SPEKTROSKOPISI DIC Contrast açısından gösterilir. Her veri noktası ortalama 20 nanospheres her parçacık çapı ve veri yakalama 10nm fwhm bant geçiren filtreleri üzerinde güvenilmiş temsil eder. (B) iki farklı polarize ayarları (çapraz polarizasyon her iki tarafında 2 °) kullanarak DIC yoğunluk veri olarak görüntülenen tek bir altın Nanorod. (C) 680 Nm LSPR dalga boyunda tek bir altın Nanorod için DIC yoğunluğu veri, 180 ° döndürülmüş ve polarize 2 ° çapraz polarizasyon konumu kapalı yapıldı. Şekil 7A, Sun ve al., Analitik Kimya'dan izin ile adapte edilir. 81 (22), 9203-9208 (2009) ve şekil 7B, C Stender ve al., Analitik Kimya. 84 (12), 5210-5215 (2012). Copyright Amerikan Kimya Derneği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

DıC mikroskobu ile görüntüleme yapılırken, veri toplamadan önce optik bileşenleri optimize etmek önemlidir. Bir denemenin ortasında polarizatör için küçük ayarlamalar bile son verilere önemli etkilere neden olabilir⁶. Dahası, farklı malzemeler farklı polarize ayarları gerektirir. Polarizasyon açısının etkisini göstermek için burada büyük adım boyutları kullanılsa da, gerçek bir deneyde, en uygun kontrast ayarının 1 ° – 2 ° içinde polarize ayarını optimize etmek zorunludur. Polarize ayarı da gelecekteki referans için kaydedilmelidir. Aynı zamanda her zaman çapraz polarize (0 °) noktası aynı tarafında çalışmak için tavsiye edilir. İleri geri geçiş herhangi bir avantaj sağlamaz, ancak gölge deseninde tersine çevirme nedeniyle karışıklığa yol açabilir.

Önemli bir sonraki, spektroskopinin gerçekleştirilmesini planlarken arka plan yoğunluğunu izlemek önemlidir. Bu, kamera pozlama süresini ayarlayarak veya ışık yoluna nötr yoğunluk filtreleri ekleyerek en iyi şekilde gerçekleştirilir. Diyafram veya lamba yoğunlukları ayarlama Kohler aydınlatma etkileyebilir ve kontrast değerleri değiştirebilirsiniz. Arka plan bölgenin seçimi kontrast hesaplama değiştirmez, böylece arkaplan nispeten bile örnek arasında olması gerekir. Temiz bir arka plan alanına bitişik olmayan örnek numuneler kaçınılmalıdır. Dahası, arka plan yoğunluğu başlangıçta çok yüksek veya çok düşük ayarlanamaz. Arka plan yoğunluğu çok yüksek olarak ayarlanırsa, bazı sinyallerin kameranın maksimum aralığını aşacağı riski vardır, bu bölgelerde kontrastı hesaplamak imkansız hale gelmiştir. Arka plan yoğunluğu çok düşük ayarlanırsa, DıC sinyalinin karanlık bileşeni ve arka plan sinyali arasında iyi bir kontrast elde etmek son derece zor olacaktır. Bir numunenin tipik veya beklenen davranışını anlamak, uygun arka plan yoğunluğunu seçmeye yardımcı olabilir.

Uygun odak düzlemini bulmak da önemlidir. Nomarski DIC 'in avantajlarından biri, sığ bir alan derinliğine sahip olmasıdır. Ancak bu, nanopartiküller gibi ince örneklere odaklanmayı daha zor hale getirir. Kalın örnekleri ile, zorluk büyük ilgi gerçek odak düzlemini bulma olduğunu. Birçok odak düzlemleri ilginç olabilir ve onlara nanopartiküller var, bu yüzden büyük ilgi nanopartiküller erken belirlemek önemlidir.

Nanopartiküller durumunda, microscopist bir havadar disk veya nesne²"nokta yayılma işlevi" görüntülemekte olduğunu tanımak için önemlidir. Genel olarak, havadar disk bir plasmonik nanopmadenin izotropik veya anisotropik bir şekle sahip olup olmadığını belirlemede yararlıdır, ancak nanopmadde görüntüleme burada tartışılan şeyden çok daha karmaşıktır. Kompleks nanopmadde toplamları bazen izotropik parçacıklar benzer ve sonuç olarak, elektron mikroskopi yöntemleri daha sonra nanopartikül desenleri karakterize etmek için gerekli^{2,16,18, 19}. DIC mikroskop ile plasmonik nanopartikülleri görüntü için, filtrelenmiş görüntüleme kullanmak ve partikülleri yüksek emici Plazmonik dalga boylarından birinde görüntü almak çok önemlidir⁶. Uygunsuz bir dalga boyu veya filtreler olmadan görüntüleme, çözmek zor olan gölge döküm desenlerinin yakalanmasına neden olabilir.

Işık kırması sınırından daha büyük nesnelerle birlikte görüntüleme nanopartiküller, mikroskobun objektif "nispeten düz bir odak uçağı görür" hatırlamak önemlidir. DıC genel bir yanlış anlayış gerçek 3D rahatlama bir nesnenin görüntülenmesini sağlar olmasıdır. Bu, gerçekten birçok nesne üç boyutlu gibi görünüyor kılan gölge cast deseninden kaynaklanır. Ancak, birden fazla odak düzleminde dikey bilgi toplamak için, sahne yükseltmek veya düşürmek ve bir dizi görüntü toplamak gerekli olacaktır. Bu, özellikle hücreler gibi kalın örnekler için gerçekleştirmek ve yorumlamak için çok zor olabilir. Böylece, microscopist bu tür deneyler yaparken dahil tüm malzemelerin derin bir anlayış ihtiyacı ve kullanılan bireysel odak düzlemleri konumlarını kaydetmek gerekir.

Son olarak, veri analizi adım veri toplama gibi önemlidir. Numunenin kontrast veya yoğunluk değerlerini ölçerken, çeşitli faktörler akılda tutulmalıdır. Genellikle, analist öncelikle ilgi parçacık için minimum ve maksimum değerleri ilgileniyor. Örnek için gürültü oranı kontrast yeterince yüksek olduğunda ve arka plan alanı temiz ve eşit aydınlatılmış ise, sonra basit bir geometrik şekil kirleticiler tarafından tanıtılan sinyal endişesi olmadan örnek bölgenin etrafında çizilebilir. Ayrıca, arka plan temiz ve eşit aydınlatılırsa, numunenin hemen bitişiğinde herhangi bir alanda bir arka plan ölçümü yapılabilir. Ancak, Eğer kirleticiler varsa veya arka plan düzensiz ise, o zaman analist numunenin çevresini kritik bir inceleme yapmak zorundadır ve Analist makul bir arka plan ölçümü yapmak bile mümkün olup olmadığını değerlendirmek gerekir. Ayrıca hesaplama içine önyargı giriş önlemek için aynı boyutlu ve şekilli aracı ile örnek ve arka plan alanları ölçmek için önemlidir. Genel olarak, daha küçük ölçekli ölçüm alanları (örneğin, kirleticiler, kötü pikseller, vb.), ancak daha büyük örnekleme alanları genellikle arka planda ortalama değeri daha güvenilir bir ölçüm sağlamak için daha düşük bir olasılığı vardır.

Yazarın ifşa etmesi gereken bir şey yok.

Dr. Anthony S. Stender Ohio Üniversitesi 'nde Nanoscale ve kuantum fenomen Enstitüsü (NQPı) aracılığıyla teknik destek kabul etmek istiyor. Bu makale, Ohio Üniversitesi tarafından Dr. Stender 'a sağlanan başlangıç finansmanı ile mümkün hale gelmiştir.