أداء الطيفي علي جسيمات نانويه Plasmonic مع القائم علي انتقال Nomarski نوع التداخل التفاضلي التباين المجهر

والهدف من هذا البروتوكول هو التفصيل نهج ثبت لاعداد عينات جسيمات متناهي plasmonic ولأداء الطيفية الجسيمات واحد عليها مع تباين التداخل التفاضلي (DIC) المجهر.

المجهر التفاضلي التباين (DIC) هو أداه التصوير القوية التي تستخدم الأكثر شيوعا لتصوير الأجسام المجهرية باستخدام ضوء المدى المرئي. والغرض من هذا البروتوكول هو التفصيل طريقه ثبت لاعداد عينات جسيمات متناهي plasmonic وأداء الطيفية الجسيمات واحد عليها مع المجهر DIC. ويجب اتباع العديد من الخطوات الهامه بعناية من أجل اجراء تجارب طيفيه قابله للتكرار. أولا ، يمكن حفر المعالم في الركيزة العينة ، والتي تساعد في تحديد مكان سطح العينة وفي تتبع المنطقة من الفائدة اثناء التجارب. بعد ذلك ، يجب تنظيف الركيزة بشكل صحيح من الحطام والملوثات التي يمكن ان تعيق أو تحجب فحص العينة. بمجرد ان يتم اعداد عينه بشكل صحيح ، يجب محاذاة المسار البصري لمجهر ، وذلك باستخدام كولر الاضاءه. مع معيار Nomarski نمط DIC المجهر ، قد يكون من الضروري دوران العينة ، لا سيما عندما الجسيمات النانويه plasmonic تظهر الخصائص البصرية التي تعتمد علي الاتجاه. لان المجهر DIC لديه اثنين من حقول الاستقطاب المتعامد المتاصله ، ونمط التباين DIC تعتمد علي الطول الموجي يكشف عن اتجاه جسيمات نانويه plasmonic علي شكل قضيب. وأخيرا ، يجب الاضطلاع بعناية بعمليات الحصول علي البيانات وتحليل البيانات. من الشائع ان تمثل بيانات الطيف الطيفي المستندة إلى DIC كقيمه تباين ، ولكن من الممكن أيضا تقديمها كبيانات كثافة. في هذه المظاهرة من DIC لطيفي الجسيمات واحد ، والتركيز علي جسيمات نانويه الذهب علي شكل كرويه وقضيب.

ومنذ الثمانينات ، ينظر إلى المجهر التفاضلي المتباين للتداخل (DIC) إلى حد كبير علي انه طريقه تصوير مهمة محجوزه للأجسام المجهرية داخل العلوم البيولوجية. مهما, اثناء تطويره في الخمسينات والستينات, كان نويت هو كتقنية ل [متريلس] علم¹. مع التطورات الاخيره في العلوم المادية المتعلقة بالجسيمات النانويه plasmonic ، وقد تم زيادة الاهتمام في توصيف المواد مع المجهر البصري مكان.

العديد من التقنيات البصرية هي بالتاكيد متاحه لتوصيف نانوماتيريال (علي سبيل المثال ، الحقل المظلم ، برايت فيلد ، الاستقطاب الضوء ، فلوري ، الخ). الحقل المظلم هو شعبيه علي نطاق واسع في البحوث الجسيمات متناهية ، ولكنه يعتمد فقط علي جمع مبعثر ويوفر معلومات محدوده حول العينات المعقدة². الفلورية يمكن ان تكون مفيده ، ولكن فقط مع العينات التي الاناره أو التي يمكن ان تكون ملطخه بشكل صحيح. المجهر DIC لديه العديد من الصفات التي تجعل من أداه قيمه لتحليل الجسيمات النانويه. المزايا الأكثر شيوعا من DIC بالمقارنة مع غيرها من الطرق وفيما يتعلق بجسيمات نانويه plasmonic هي: لا تلطيخ عينه المطلوبة ، لا اثار هاله ، عمق الضحلة من الميدان ، وارتفاع القرار الجانبي³. DIC لديها نقاط القوه الاضافيه التي هي قيمه للبحوث جسيمات متناهي plasmonic. أولا وقبل كل شيء ، يوجد حقلان للاستقطاب المتاصل والمتعامد ، ويمكن قياسهما في وقت واحد لأغراض الطيفية². ثانيا ، لا يتم التقاط اشاره الاستقطاب من الجسيمات النانويه في الصورة النهائية²، والتي يمكن ان تكون سببا للقلق الشديد في القياسات الطيفية الميدانية المظلمة.

الغرض من هذه المقالة هو توفير منهجيه واضحة لاستخدام المجهر الضوئي المرسلة الخفيفة لاجراء الطيفي علي جسيمات نانويه plasmonic. علي الرغم من ان DIC هو تقنيه قويه التي يمكن تطبيقها علي مواد متنوعة للغاية ، بل هو أيضا تقنيه تتطلب مهارة كبيره وفهم لتشغيله بشكل صحيح عند التصوير النانويه. المجهر المستندة إلى ناقل الحركة Nomarski DIC لديه مسار ضوء معقده¹ التي سيتم فقط استعراضها بإيجاز هنا. يتم عرض القطار البصري من DIC في الشكل 1. وينتقل الضوء من خلال المجهر أولا يتم تمريرها من خلال المستقطب والمنظور تقسيم شعاع Nomarski قبل ان تركز علي المكثف علي الطائرة عينه. بعد المرور من خلال الهدف ، والضوء يصادف شعاع الجمع بين المنشور Nomarski ومحلل قبل الخروج إلى كاشف. المستقطبات اثنين والمناشير Nomarski هي حاسمه لتشكيل الصورة DIC وهي المسؤولة عن إنتاج المجالات الاستقطاب المتعامدين DIC¹. للقارئ المهتمة في معرفه المزيد عن مبادئ العمل والمسار البصري من المجاهر DIC Nomarski ، أو الاختلافات بين Nomarski DIC وأنماط أخرى من DIC ، يرجى الرجوع إلى حسابات أخرى مكتوبه بشكل جيد علي هذه المواضيع^{1، 4 , 5 , 6 , 7}-

من المهم بنفس القدر لفهم الطبيعة الاساسيه للجسيمات النانويه plasmonic قبل محاولة اجراء الطيفي عليها ، سواء كان ذلك مع Nomarski DIC ، حقل مظلم ، أو اي تقنيه المجهر الأخرى. في مجال plasmonics ، يتم تعريف جسيمات نانويه الجسيمات مع ابعاد علي مقياس 10-100 nm^8،9. يمكن ان تاخذ الجسيمات النانويه علي العديد من الاشكال (علي سبيل المثال ، المجالات ، القضبان ، النجوم ، الاثقال ، الخ) ، ومعظم خصائصها الهامه تنشا من التفاعلات مع الضوء في نطاق الاشعه فوق البنفسجية المرئي-القريب من الطيف الكهرومغناطيسي. ولا يقتصر مصطلح "plasmonic" علي الجسيمات النانويه¹⁰؛ ومع ذلك ، عند مناقشه الجسيمات النانويه ، يتم استخدامه في الاشاره إلى الصدى الموضعي لسطح البلازما (LSPR خاص). [لسد] ظاهره في اي التوصيل الكترونات في [جسيمات متناهي] يتذبذب واجبه إلى [كولومبيك] تفاعل مع إشعاع كهرومغناطيسية من جدا محدده ونسبيا ضيقه تردد نطاق⁸. في هذه الترددات نفسها ، والجسيمات النانويه plasmonic تظهر زيادة امتصاص وتشتت الضوء ، مما يجعلها قابله للملاحظة مع المجهر البصري. في كثير من الحالات ، يفضل ان نلاحظ الجسيمات النانويه في حين وضع مرشحات الممرات قبل المكثف²، لتحسين التباين التصوير والقضاء علي الضوء الذي يفشل في الحث علي تاثير lspr. كما ان استخدام الفلاتر يجعل من الممكن اجراء تجارب طيفيه واحده للجسيمات.

السلوك البصري المرتبط بالشركة يعتمد إلى حد كبير علي حجم وشكل الجسيمات النانويه ، ويمكن التحقيق مع العديد من تقنيات المجهر البصري. ومع ذلك ، من أجل فك المعلومات التوجيهية من الجسيمات النانويه plasmonic مع التباين (اي غير كرويه) الشكل ، فمن الضروري استخدام الاستقطاب من حقل الضوء. بالتناوب بعناية حقل الاستقطاب أو الركيزة عينه بزيادات صغيره ، فمن الممكن لمراقبه الخصائص الطيفية التي تعتمد علي الاتجاه من الجسيمات النانويه الفردية. ويمكن ان يساعد الدوران والاستقطاب أيضا في تحديد ما إذا كانت السمة الطيفية ناجمه عن تذبذب النظام القطبي أو الأعلى للكترونات سطح الجسيمات متناهي. ومع ذلك ، ففي حاله الجسيمات النانويه الانسيابية (اي كرويه) ، يظل الملف الطيفي بدون تغيير أساسا عند تدوير العينة تحت ضوء مستقطب.

عند عرضها من خلال المجهر DIC (الشكل 2) ، والجسيمات النانويه لديها قرص مهواه مع مظهر الظل الزهر الأبيض والأسود ضد خلفيه رمادية. سوف الجسيمات النانويه كرويه الاحتفاظ بهذا المظهر تحت التناوب ومع تغيير مرشحات ممر. ومع ذلك ، فان الجزيئات تتلاشي تدريجيا من وجهه نظر كما يصبح الطول الموجي المركزي للمرشح أكثر فصلها من المجال الوحيد القطبية الطول الموجي LSPR¹¹. ظهور nanorods يمكن ان تتغير بشكل كبير جدا لأنها استدارة². Nanorods لديها اثنين من العصابات LSPR مع السلوك ثنائي القطبية ، والموقع الذي يستند إلى الابعاد المادية لل nanorods. عندما المحور الطولي لل nanorod هو المنحى موازيه لواحده من حقول الاستقطاب DIC ، فان القرص مهواه تظهر جميع الأبيض أو كل الأسود إذا كان ينظر اليها مع فلتر ممر المرتبطة بهذا الطول الموجي LNNNN. بعد تناوب عينه 90 درجه ، وسوف يستغرق علي اللون المعاكس. بدلا من ذلك ، نظرا لان المحور العرضي ل nanorod متعامد مع المحور الطولي ، فان القضيب سياخذ اللون المعاكس عند التبديل بين الفلاتر التي تتطابق مع الأطوال الموجية لجهاز الدوران للمحورين. في الاتجاات الأخرى وإعدادات التصفية ، سوف تظهر nanorods أكثر مثل المجالات ، وتقديم مجموعه متنوعة من أنماط القرص مهواه الظل المصبوب. ل nanorods مع محور عرضيه < 25 نانومتر ، فانه يمكن ان يكون من الصعب الكشف عن اشاره في هذا الطول الموجي LNN'S باستخدام المجهر DIC.

لاجراء الطيف الطيفي للجسيمات المفردة ، من المهم استخدام المكونات البصرية الصحيحة ومحاذاتها بشكل صحيح. يجب استخدام هدف قادر علي المجهر DIC. للتجارب الجسيمات واحد ، 80x أو 100x أهداف النفط مثاليه. Nomarski DIC المناشير عاده ما تاتي في ثلاثه أصناف: القياسية ، وارتفاع التباين ، وارتفاع القرار. النوع المثالي يعتمد بشكل كبير علي الغرض من التجربة وحجم الجسيمات النانويه. المناشير القياسية علي ما يرام بالنسبة للعديد من التجارب; ولكن عند العمل مع الجسيمات النانويه الصغيرة (< 50 نانومتر) ، يمكن ان تكون المنشورية عاليه التباين مفيده ، حيث ينخفض تباين الجسيمات مع انخفاض حجم الجزيئات¹¹. يتم تحقيق ضبط التباين DIC اما عن طريق تدوير المستقطب أو عن طريق ترجمه واحده من الprisms DIC ، اعتمادا علي العلامة التجارية المجهر أو نموذج⁶.

بعد اعداد أضاءه كولر وإعدادات الاستقطاب ، من المهم عدم تعديل هذه الإعدادات اثناء جمع بيانات الطيف الطيفي. وعلاوة علي ذلك ، يجب الحفاظ علي متوسط ثابت لاشاره الخلفية في جميع الأوقات اثناء جمع البيانات ، حتى عند التبديل بين الفلاتر وإعدادات الزاوية. تعتمد قيمه الخلفية المثالية الفعلية علي النطاق الديناميكي للكاميرا العلمية ، ولكن بشكل عام ، يجب ان تكون الخلفية في نطاق 15% – 40% من مستوي الكشف الأقصى للكاميرا. وهذا يقلل من احتمال تشبع مستشعر الكاميرا مع تمكين التباين الأمثل للجسيمات. لجمع بيانات الطيف الطيفي ، من الضروري العمل مع كاميرا علميه تلتقط الصور بالأبيض والأسود ، بدلا من الكاميرا الملونة.

اعداد العينة هو جانب آخر حرجه من التصوير النانويه plasmonic. فمن المحتم ان مشغلي المجهر DIC لديهم فهم الخصائص البصرية للعينه والركيزة العينة. "قبل تنظيف" المجهر الزجاج ليست مستعدة بما فيه الكفاية للتصوير النانويه ، ويجب أعاده تنظيفها بشكل صحيح قبل ترسب عينه لضمان المراقبة دون عائق من العينة. تم توثيق العديد من بروتوكولات التنظيف لشرائح المجهر سابقا¹²، ولكنها ليست خطوه التي يتم الإبلاغ عنها عاده في الدراسات التجريبية.

وأخيرا ، فان أساليب تحليل البيانات هي المكون النهائي للتحليل الطيفي للجسيمات الواحدة. ويجب قياس الكثافة القصوى والدنيا لكل جسيمات متناهي ، فضلا عن متوسط الخلفية المحلية. يجب ان تكون الجزيئات ذات الاهميه موجودة في المناطق التي لا يوجد بها حطام خلفي أو عيوب في الركيزة أو أضاءه غير متساوية. طريقه واحده لتحديد الملامح الطيفية لجسيمات متناهي هو عن طريق حساب تباين الجسيمات في كل طول موجي ، وذلك باستخدام المعادلة أدناه^{11،13،14،15}:

وبدلا من ذلك ، يمكن تقسيم طيف الجزيء الواحد إلى مكونات الاشاره القصوى والدنيا الفردية ، والتي تمثل مجالي الاستقطاب في DIC ، التالي عرض الأطياف التي تعتمد علي directionally والتي تم جمعها في نفس الوقت ، من خلال المعادلتين:

1. اعداد العينة مع الشرائح المجهر الزجاج القياسية

1. اعداد الشرائح المجهر الزجاجي لترسب عينه.
   ملاحظه: في بعض الحالات ، قد يكون من الأنسب لتخزين الزجاج في الماء فائق النقاء بدلا من الايثانول. ومع ذلك ، تخزين في الماء أو الهواء يجعل الزجاج مسعور مع مرور الوقت.
   1. للحصول علي أفضل النتائج ، وشراء الزجاج أو الكوارتز الشرائح المجهر وتغطيه الزجاج.
   2. باستخدام قلم خربشه ، ضع علامة خدش ضحلة وقصيرة علي وسط كل زلة غطاء زجاجي.
   3. تنظيف جميع الزجاج المجهر ، حتى لو تم شراؤها "قبل تنظيفها" ، لأزاله شظايا الزجاج ، والغبار ، ومسحوق ، وبقايا العضوية ، وأي ملوثات أخرى تؤثر علي جوده التصوير أو ترسب عينه.
      ملاحظه: هذه الطريقة التنظيف أدناه يعمل بشكل جيد لأنواع العينات الموصوفة هنا ويتجنب استخدام المواد الكيميائية القاسية. يمكن ان المواد الكيميائية اقسي حفر الزجاج وتتطلب المزيد من الرعاية في المناولة والتخلص منها.
      1. وضع الزجاج المجهر علي رفوف التخزين ثم في الكاس ، أو في جره تلطيخ. لا تضع الزجاج المجهر في الجزء السفلي من الأكواب وغيرها من الأواني الزجاجية مختبر دون الإجهاد ، وذلك لان كل قطعه وسطح الزجاج المجهر ينبغي ان تتعرض تماما لوكلاء التنظيف.
      2. صب ~ 1 مل من المنظفات السائلة (جدول المواد) في الحاوية واعلي قباله الحاوية مع الماء. سوكاتي لمده 30 دقيقه.
         ملاحظه: بمجرد بدء عمليه التنظيف ، والتعامل مع الزجاج فقط اثناء ارتداء القفازات ، لتجنب ترك بقايا بصمات الأصابع علي الزجاج.
      3. صب المحتويات السائلة من حاويه التنظيف في بالوعة. شطف الحاويات عده مرات مع الماء نقاء لأزاله كل مظهر من المنظفات. أعاده ملء الحاوية بالماء فائق النقاء. سوكاتي الحاوية مع الزجاج المجهر لمده 30 دقيقه أخرى.
      4. كرر الخطوة السابقة مره أخرى علي الأقل. اجراء جولات اضافيه من سونيكيشن في الماء حتى انه من الواضح ان جميع اثار المنظفات قد أزيلت.
      5. صب محتويات حاويه التنظيف. شطف الحاوية بالماء فائق النقاء. أعاده ملء الحاوية مع الايثانول. الزجاج المجهر سوكاتي لمده 30 دقيقه.
      6. صب محتويات حاويه التنظيف في حاويه نفايات. أعاده ملء مع الايثانول. تغطيه الحاوية لمنع فقدان الايثانول من خلال التبخر. تخزين الزجاج المجهر في هذه الحاوية حتى وقت التجربة. تبقي الشرائح نظيفه وقابله للاستخدام طالما انها تبقي مغمورة في الايثانول داخل حاويه مغطاه.
2. اعداد الحل الجسيمات متناهي
   1. باستخدام الماصات المجهرية ، قم بازاله 100 μL من 0.05 mg/mL محلول جسيمات متناهي الذهب من حاويه التخزين الاصليه وإخراج الحل إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL.
   2. الطرد المركزي العينة لمده 10 دقيقه في 6,000 x g.
   3. أزاله ماده طافي مع ميكروماص ، من أجل أزاله السطحي الزائد.
   4. باستخدام ميكروماص ، ضع 100 μL من الماء فائق النقاء في أنبوب الطرد المركزي.
      ملاحظه: إذا لم يكن كل من ماده طافي يمكن ازالتها في المحاولة الاولي ، كرر الخطوات طرد وأعاده التعليق.
   5. لفتره وجيزة دوامه العينة لأعاده تعليق بيليه. [سنوكت] فورا [افتروردس] ل 20 [مين] ان تماما [ربرك] ويكسر فوق جسيمات متناهي مجاميع.
      ملاحظه: إذا لم يتم استخدام العينة علي الفور ، يجب ان تكون سونيكاتيد مره أخرى لمده 20 دقيقه قبل إيداع الحل علي الزجاج المجهر.
3. عينه ترسيب
   1. أزاله كشوف الغطاء المنظفة والشرائح المجهر من حاويات التخزين الخاصة بهم. ضربه جافه الزجاج مع النيتروجين المضغوط أو الارجون.
   2. باستخدام الماصة الصغيرة ، قطره 6 μL من محلول جسيمات متناهي من الخطوة التالية إلى زلة الغطاء. لنشر قطره بالتساوي ، ضع بعناية الثاني ، قطعه أكبر من الزجاج المجهر علي راس زلة الغطاء ، مثل زلة الغطاء الثاني أو شريحة المجهر. تجنب الحصول علي فقاعات الهواء المحاصرين بين قطعتين من الزجاج.
      1. تحويل الركيزة العينة أكثر ، وختم قباله حواف زلة الغطاء مع خط ضيق من طلاء الأظافر من أجل منع تبخر الحل المتوسط.
      2. بدلا من ذلك ، لصوره العينة "الجافة" ، والسماح للحل للوقوف لمده 5-15 دقيقه علي زلة الغطاء ، قبل أزاله قطعه غير المرغوب فيها من الزجاج. ضربه برفق زلة الغطاء الجاف مع النيتروجين المضغوط أو الارجون.
   3. إذا كان ذلك ممكنا ، عينات الصورة مباشره بعد التحضير. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، قم بتخزين العينات في حاويه مغطاه ، مثل طبق بيتري حتى التصوير.

2. التصوير الضوئي

1. محاذاة الهدف والمكثف.
   1. بعد وضع العينة علي المجهر ، والعثور علي المستوي البؤري مع العينة علي ذلك. أولا تحديد موقع والتركيز علي علامة الصفر التي تم إنشاؤها في وقت سابق. ثم صقل التركيز حتى الجسيمات النانويه تاتي في الاعتبار.
   2. لتحديد موضع دقيق من المكثف ، والاستفادة من أسلوب الاضاءه كولر. ⁵ كولر الاضاءه في التكبير العالي (80x ، 100x) هو أكثر سهوله يتحقق من خلال الاعداد الاولي للاضاءه كولر في التكبير اقل ، مثل 20x.
      ملاحظه: عاده ، كولر الاضاءه لا تحتاج إلى أعاده ضبطها اثناء التصوير من عينه واحده. ومع ذلك ، فمن الممارسة الجيدة للتحقق من ان الاضاءه كولر يتم تعيينها بشكل صحيح عند التبديل إلى شريحة المجهر الجديد.
2. تحسين إعدادات التباين.
   1. حدد منطقه الاهتمام داخل العينة للتصوير. توسيط المنطقة في مجال رؤية الكاميرا واضبط التركيز حسب الضرورة.
      1. إذا كان المجهر لديه تصميم دي Senarmont ، تبدا مع المستقطب تعيين بالقرب من الحد الأقصى للانقراض الخلفية وتناوب تدريجيا الاستقطاب نحو خفض الانقراض الخلفية. ستزداد كثافة الخلفية تدريجيا.
      2. إذا لم يكن المجهر لديها تصميم Senarmont دي ، تبدا مع القطار البصرية التي تم تعيينها في الحد الأقصى من الانقراض الخلفية. في هذه الحالة ، ضبط تدريجيا موقف المنظور الموضوعي نحو خفض انقراض الخلفية.
         ملاحظه: يتم تحقيق الاعداد المثالي عندما تصل الجسيمات النانويه إلى أكبر فرق الكثافة (اي التباين) من قيمه الخلفية المحلية المتوسطة. لجسيمات نانويه plasmonic ، وعاده ما يتحقق التباين الأمثل مع خلفيه داكنه نسبيا ، التالي في الإعدادات بالقرب من الحد الأقصى لانقراض الخلفية.
3. صوره العينة.
   1. إيقاف تشغيل أضاءه الغرفة لمنع الاضاءه الضالة من التفاعل مع العملية.
   2. اثناء عرض الجسيمات النانويه مع كاميرا التصوير العلمي ، تحديد مستوي الخلفية الأمثل. باستخدام العرض الكامل 10 نانومتر في نصف الحد الأقصى (FWHM) مرشح ممر مع الطول الموجي المركزية المشتركة التي تقع مع الطول الموجي الرئيسي لل ، وعرض المنطقة من الفائدة. اضبط كثافة المصباح أو وقت التعريض الضوئي حتى يكون مستوي الخلفية في نطاق 15% – 40% من مستوي السعه القصوى للكاميرا ولا توجد كائنات داخل المنطقة ذات كثافة اشاره المعرض التي تتجاوز 90% من مستوي الكثافة الأقصى للكاميرا.
      ملاحظه: الهدف من الخطوة 2-3-2 لمنع تشبع جهاز الاستشعار عند التبديل بين عوامل التصفية. سيختلف مستوي الخلفية المثالي بين العينات والكاميرات. وبمجرد الانتهاء من هذه الخطوة ، يمكن تعديل وقت التعرض ولكن ليس كثافة المصباح.
   3. صوره العينة مع سلسله من مرشحات الممرات التي لديها كل FWHM من 10 نانومتر وانه ككل تمكين التصوير عبر نطاق الطول الموجي بأكمله من الفائدة. تاكد من ان كثافة الخلفية تبقي متناسقة من الصورة إلى الصورة (داخل ~ 5% من بعضها البعض) عن طريق ضبط وقت التعرض. بعد تبديل الفلاتر ، أعد تركيز العينة قبل التقاط الصورة.
   4. احفظ الصور كملفات TIFF غير مضغوطه و/أو في تنسيق الملف الأصلي للبرنامج ، من أجل الحفاظ علي كافة المعلومات.
4. تدوير العينة.
   1. بعد جمع الصور من العينة في موقفها الأصلي ، يمكن الآن ان تكون العينة استدارة والذين لديهم اتجاات اضافيه في مسار الضوء. قم باجراء الاستدارة علي فترات منتظمة (علي سبيل المثال ، 10 درجات أو 15 درجه) عبر نطاق 180 درجه أو 360 درجه.
      ملاحظه: يتطلب التدوير مرحله عينه قابله للتدوير.
   2. كما هو الحال في الأقسام 2.1-2.3 ، اضبط إعدادات الكاميرا لتوفير مستوي خلفيه متناسق من الصورة إلى الصورة.
      ملاحظه: لا ينبغي اجراء اي تعديل علي الاضاءه كولر.

3. تحليل البيانات باستخدام ImageJ

ملاحظه: يمكن اجراء العمليات الحسابية التالية في مجموعه متنوعة من حزم البرامج ، وأحيانا في البرنامج الأصلي المستخدمة لجمع الصور. ImageJ هو برنامج متاح مجانا من المعاهد الوطنية للصحة.

1. احسب تباين الجسيمات أو شدتها.
   1. افتح الصورة باستخدام ImageJ.
   2. حدد أداه المستطيل وارسم مستطيلا حول المنطقة الرئيسية التي تهمك.
   3. علي شريط الاداات ، حدد الصورة ، ثم التكبير ، ثم إلى التحديد. سيتم تكبير نافذه التصوير في المنطقة المحددة.
   4. في شريط الاداات ، حدد الصورة ، ثم اضبط، ثم السطوع /التباين. تظهر نافذه جديده. لتمكين عرض أفضل لمنطقه العينة ، اضبط الإعدادات الاربعه: الحد الأدنى والأقصى والسطوع والتباين. هذه التعديلات لا يغير البيانات العلمية ، فانها مجرد تمكين رؤية أفضل للمنطقة عينه.
      ملاحظه: قد يتم تنفيذ الخطوات 3-1-3 و 3-1-4 عده مرات وبترتيب عكسي.
   5. باستخدام أداه المستطيل مره أخرى ، ارسم مربعا حول الجسيمات متناهي الاولي التي سيتم قياسها. يجب ان يكون مربع أكبر قليلا فقط من القرص مهواه جسيمات متناهي.
   6. علي شريط الاداات ، حدد تحليل، ثم قياس. يظهر اطار جديد يبلغ عن الحد الأدنى والحد الأقصى والشدة المتوسطة للبيكسلات الموجودة داخل المربع المحدد.
   7. اسحب المربع المستخدم لقياس الجسيمات متناهي إلى منطقه مجاوره مباشره للجسيم ، حيث يكون التباين في الخلفية نسبيا حتى ولا توجد جزيئات أو ملوثات موجودة. الاحتفاظ بالحجم الأصلي للمربع.
   8. استخدم أداه القياس لتحديد الكثافة المتوسطة لمنطقه الخلفية.
   9. قياس الجزيئات المتبقية ومنطقه الخلفية المجاورة لكل منهما.
   10. كرر العملية لكل الجسيمات في جميع الصور في السلسلة.
   11. تصدير البيانات إلى جدول بيانات لحساب التباين أو كثافة كل الجسيمات ، عبر جميع الأطوال الموجية والزوايا.
   12. حساب تباين كل الجسيمات ، باستخدام المعادلة التالية^13،14،15:
       
       ملاحظه: استخدام هذه المعادلة ، يجب ان يكون التباين الجسيمات دائما > 0.
   13. احسب القيمة القصوى المعدلة للخلفية الخاصة بالجسيمات من خلال قسمه الحد الأقصى لكثافة الجسيمات المقيسة علي الخلفية بمعني:
       
   14. المثل ، يحسب الحد الأدنى للقيمة المعدلة في الخلفية عن طريق قسمه كثافة الجسيمات الدنيا المقاسه حسب الخلفية علي ما يلي:
       
       ملاحظه: كما هو محسوب ، يجب ان يكون الحد الأقصى قيمه أكبر من واحد ، بينما الحد الأدنى سيكون اقل من واحد. من المقبول طرح كل قيمه بواسطة "1" ، بحيث يكون متوسط الخلفية صفرا ، ويتم تمثيل الحد الأقصى كقيمه موجبه ، ويتم تعيين القيمة الدنيا بقيمه سالبه¹⁶. هذا النهج الأخير يسمح للمحلل بالنظر بشكل منفصل في ما يحدث علي طول كل من حقول الاستقطاب ، وهو أمر مفيد عند دراسة الجزيئات المتباينة الخواص.
   15. للرسم البياني للتشكيل الطيفي في موضع جسيمات متناهي معين ، ارسم بيانات بالطول الموجي علي المحور س والتباين أو الكثافة علي طول محور y.
   16. لرسم التشكيل الجانبي للتناوب في الطول الموجي المعطي ، ارسم زاوية الاستدارة علي المحور س والتباين أو الكثافة علي طول محور y.

عند العمل مع العينات التي هي كبيره بما يكفي ان ينظر اليها مع العين المجردة ، ووضع المعالم علي الركيزة الزجاجية ليست مطلوبه عاده. ومع ذلك ، عند العمل مع المواد النانويه أو عند الحاجة إلى دوران العينة ، يمكن ان توفر المعالم طريقه سهله لتحديد موقع العينة وتمييزها وتتبع اتجاهها. علي الرغم من انه يمكن استخدام تقنيات أكثر تطورا لترك المعالم علي ركائز الزجاج¹⁷، خدش الزجاج مع القلم سكريبينج هو طريقه اقتصاديه وبسيطه التي تعمل في العديد من الحالات. ومن المهم تجنب فحص مناطق العينات المتاخمة مباشره لهذه المعالم ، لان علامات الخدش تخلق خلفيه معقده مع امكانيه التاثير علي البيانات (الشكل 3). ومع ذلك ، في نصائح من علامات الصفر ، "شبكات العنكبوت" غالبا ما تمتد إلى الخارج من الصفر. هذه الخطوط هي قيمه جدا كمعالم ، ولكن مره أخرى ، ينبغي تجنب جسيمات نانويه إذا كانت تتداخل مع هذه العيوب.

من أجل تحقيق التصوير الأمثل مع المجهر DIC ، فانه من الاهميه الحيوية لتحديد المستوي البؤري المناسب. ستظهر الكائنات الخارجة عن التركيز بشكل طفيف ضبابية ، ولها حواف غير واضحة ، وقد انخفضت التباين. الشكل 4 يعرض الذهب النانويه التي هي خارج التركيز بدرجات متفاوتة. الجسيمات النانويه في الزاوية اليمني السفلي في التركيز ، في حين تصبح جسيمات نانويه ابعد من التركيز لأنها تقترب من الزاوية اليسرى العليا من هذه الصورة. لان DIC لديه عمق الضحلة من الميدان ، فانه ليس من غير المالوف بالنسبة لبعض الجسيمات النانويه ان تكون في التركيز بينما البعض الآخر خارج التركيز عند التصوير لهم علي ركيزة زجاجيه. ونتيجة لذلك ، من الضروري التركيز باستمرار علي نفس الجزيئات الدقيقة عند اجراء تعديلات علي المجهر اثناء التجربة.

ويقدم الشكل 5 مثالا علي تاثير ضبط إعدادات الاستقطاب اثناء تصوير nanospheres الذهب. خمسه جسيمات نانويه في التركيز ، في حين ان واحدا من التركيز قليلا. وكان مرشح ممر 540 nm مع 10 نانومتر FWHM أيضا في المسار البصري. في هذه السلسلة من الصور ، تم تعديل سطوع الخلفية مع ImageJ بعد اكتساب الصورة من أجل جعل الجزيئات الخمسة أكثر وضوحا ضد الخلفية. عندما يتم تعيين المستقطب في 0 ° في المجهر دي Senarmont تصميم Nomarski DIC ، فمن متعامد إلى محلل (الشكل 5A). في 0 ° ، تظهر الجزيئات في الغالب بيضاء ، مع شريط داكن يركض في منتصف القسم الخاص بهم. وهذا يدل علي الاستقطاب المتقاطع لعينات الغلاف النانو. عندما يتم تدوير المستقطب إلى زوايا مختلفه (الشكل 5B-E) ، يبدو ان الجزيئات صب الظلال الداكنة نحو الجنوب الغربي. المكونات السوداء والبيضاء للاشاره تنشا نتيجة للمجالين الاستقطاب في DIC وتوفير معلومات حول اتجاه جسيمات نانويه plasmonic عند العمل مع مرشحات ممر. ومع استدارة المستقطب نحو زوايا اعلي ، يظل نمط الظل متشابها. ومع ذلك ، تتغير قيم تباين الجسيمات بشكل كبير. ويتجلى هذا بشكل أفضل من خلال قياس قيم التباين للجسيمات الفردية ، وذلك باستخدام المعادلة الواردة أعلاه. الجسيمات التي تم تسليط الضوء عليها مع المربع الأسود لديها قيم التباين من 0.65 (الاستقطاب عبرت) ، 0.84 (التحول المستقطب من 5 درجه) ، 1.10 (10 درجه) ، 0.44 (20 درجه) ، و 0.23 (45 درجه). ولذلك ، لهذه العينة ، واعداد التصوير الأمثل مع تحول الاستقطاب من 10 درجه. جسيمات نانويه plasmonic غالبا ما تتطلب اعداد الاستقطاب في نطاق 5 °-15 ° ، وزيادات أصغر من هذه ينبغي عاده ان تستخدم لتحديد الاعداد المثالي. لمزيد من المعلومات حول التصوير وتحليل جسيمات نانويه الذهب كرويه ، ويشار إلى القراء العمل السابق من قبل Sun وآخرون¹¹.

تنتج الجسيمات النانويه علي شكل متباين الخواص أنماطا من التعقيد الأعلى من الnanospheres. وكانت الذهب nanorods (الشكل 6) في الطول الموجي الطولي lnnm ، 650 نانومتر. في الصورة الاوليه (الشكل 6A) ، خمسه nanorods مشرق والعديد من الجزيئات باهته واضحة. بدلا من وجود مظهر الظل المدلي بها ، وثلاثه من قضبان لديها في الغالب أقراص مهواه السوداء في حين ان اثنين من معظمهم من البيض. وضعت المستقطب في 10 ° إلى اليسار من الاستقطاب عبرت الاعداد. وفي الشكل 6 باء، استخدم الاستقطاب المتقاطع ؛ فقط ثلاثه من الجزيئات تظهر ، وأقراص مهواه بيضاء تماما. اما الآخرون فقد اختفوا أو يبدو انهم خارج التركيز قليلا. مع المستقطب تعيين في 10 درجه إلى اليمين من الاستقطاب عبرت (الشكل 6C) ، والآن عكس أنماط من ما لوحظ في الشكل 6c. وتحولت الاستقطاب المقبل إلى 45 درجه الحق في الاستقطاب عبرت (الشكل 6D) ، والحد الأقصى للاعداد ، لإثبات ان الجزيئات تحتفظ بألوانها في هذا الاعداد ، ولكن التباين قد انخفض بشكل ملحوظ. وفي اللوحات الشخصية المتبقية ، تمت بشكل متزايد استدارة مجموعه النانو الكاملة 90 درجه في اتجاه عقارب الساعة بينما تم تعيين المستقطب عند درجه 10 إلى يمين الاستقطاب المتقاطع. يتغير النمط تدريجيا لكل nanorod ، وبعد دوران كامل 90 درجه ، عكست الجزيئات ألوانها من الاعداد الاولي. باختصار ، إذا كان واحدا من محاور nanorod البلازما واصطف مع واحد من اثنين من مجالات الاستقطاب ، وإذا كان nanorod هو الذين يعانون من التطرف في هذا المحور ' الطول الموجي لل ، وسوف nanorod يبدو ان معظمهم من البيض أو الأسود في الغالب ، اعتمادا علي المجال الذي الاستقطاب هو اليجني (د) مع (الشكل 6 ا، ج)². إذا تمت استدارة جسيمات متناهي كامل 90 ° (الشكل 6H) ، فانه سيتم الآن اصطف مع حقل الاستقطاب المعاكس وتاخذ علي اللون المعاكس. إذا بدلا من ذلك كان جسيمات متناهي استدارة فقط 45 ° (الشكل 6F) ، ثم سيكون في موقف حيث الجسيمات سوف تظهر لها أعظم مظهر الظل المدلي بها ، والتي تبين تشابه ملفتة للنظر مع ما لوحظ مع nanospheres plasmonic. ونتيجة لهذا السلوك البصري ، والجسيمات النانويه plasmonic مع شكل متباين الخواص في كثير من الأحيان تبدو مسطحه بدلا من وجود ثلاثي الابعاد الظل المدلي بها المظهر من nanospheres. نتيجة هذا الاختلاف في السلوك البصري هو انه يمكن استغلالها من أجل التمييز بين جسيمات نانويه plasmonic التي هي كرويه ومتباينة الخواص في الشكل ، كما سبقت مناقشته في دراسات بحثيه متعددة^{2، 3،6،7،11،13،16}.

وأخيرا ، يعرض الشكل 7 بيانات الطيف الطيفي للجسيمات الواحدة التمثيلية ، علي النقيض من نانو الذهب (الشكل7a)¹¹، كثافة nanorod الذهب واحد مع محورها الطولي المنحى موازيه لواحده من الاستقطاب الحقول (الشكل 7 ب)⁶، والملف الشخصي لكثافة nanorod الذهب واحد في الطول الموجي لل lnc واثناء دوران المرحلة (الشكل 7b)⁶. اما أسلوب العرض التقديمي يكشف عن العرض والموقع لتاثير الموارد الخاصة. بالنسبة للجسيمات النانويه البلازمية ذات الشكل المتباين ، تكشف بيانات الكثافة والدوران عن اتجاه التاثير ، التالي ، توجه الجسيمات علي الركيزة النموذجية ، والتي ثبت سابقا من خلال الدراسات النسبية علي مثل هذه الجزيئات باستخدام DIC وانتقال الكترون المجهر^2،16،18.

الشكل 1: المسار الضوئي في المجهر الضوئي الذي يستند إلى Nomarski. بعد ترك مصدر الضوء (ق) ، يمر الضوء من خلال المستقطب (P) ، وشعاع القص Nomarski المنشور (NP) ، والمكثف (C) ، والمستوي البؤري (FP) ، والهدف (O) ، شعاع الجمع بين المنشور Nomarski (NP) ، محلل (A) ، وأخيرا كاشف (D). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: أمثله لجسيمات نانويه plasmonic التي في أطوالها الموجية lnnnnnnnnnnnnnnm مع 10 نانومتر مرشحات ممر ، وذلك باستخدام مجهر DIC. يتم جمع كل من الصور في 100x. (ا) nanospheres الفضة مع القطر 40 نانومتر في 480 nm مع مرشح الممر وجود 10 نانومتر FWHM. (B) الجسيمات النانويه الذهبية مثل قضيب في 700 nm باستخدام فلتر ممر مع 10 نانومتر FWHM. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: صوره الخدش المصنوعة في زلة غطاء زجاجي مع قلم سكريبينج. القرب من نهاية المسافة البادئة الفعلية ، تتفرع سلسله من خطوط "ويب العنكبوت" الضيقة والضحلة من الخدش نفسه ، مما يؤدي إلى نمط يمكن استخدامه كمعلم تصوير. تم جمع هذه الصورة باستخدام التكبير 100x والضوء الأبيض واسع النطاق. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: nanospheres الذهب مع الضوء الأبيض واسع النطاق في 100x. الجزيئات في أسفل اليمين هي في التركيز ولكن الجزيئات الانجراف ابعد من المستوي البؤري نحو الزاوية اليسرى العليا. الكائن في منتصف الصورة هو الحطام. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: الذهب nanospheres تصوير تحت سلسله من إعدادات الاستقطاب مختلفه في الطول الموجي 540 نانومتر والتكبير 100x. تم تعديل سطوع الخلفية بعد التصوير مع ImageJ لجعل الجزيئات أكثر وضوحا. الاستقطاب الاعداد من (ا) 0 ° (المستقطب متعامد إلى محلل) ، (ب) 5 درجه ، (ج) 10 درجه (أفضل النقيض من هذه السلسلة من الصور) ، (د) 20 درجه ، و (ه) 45 درجه. قياس التباين من الجسيمات في المربع الأسود هو (ا) 0.65 ، (ب) 0.84 ، (ج) 1.10 ، (د) 0.44 ، و (ه) 0.23. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: مثال علي التصوير النانويه البلازمية المتباينة الخواص: nanorods الذهب في الطول الموجي لل lnnm الطولي من 650 نانومتر والتكبير 100x. يتم تضمين جزيئات من الفائدة الرئيسية في مربع اصفر. إعدادات الاستقطاب هي: (ا) اليسار 10 ° ، (ب) 0 درجه ، (ج) الحق 10 درجه ، (د) الحق 45 درجه. مع تعيين المستقطب إلى اليمين 10 درجه ، وكانت المرحلة استدارة في اتجاه عقارب الساعة من قبل (E) 20 درجه ، (F) 45 درجه مئوية ، (ز) 70 ° ، و (H) 90 °. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: النتائج التمثيلية لبيانات الطيف الطيفي للجسيمات الواحدة. (ا) الطيف الطيفي للغلاف الذهبي الذي يظهر من حيث تباين DIC. وتمثل كل نقطه بيانات متوسط 20 nanospheres لكل قطر من الجسيمات ، ويعتمد التقاط البيانات علي مرشحات التمرير FWHM التي تبلغ 10 نانومتر. (ب) نانو ذهب واحد معروض كبيانات كثافة DIC ، باستخدام إعدادين مستقطبين مختلفين (2 درجه علي جانبي الاستقطاب المتقاطع). (ج) بيانات الكثافة الخاصة بالذهب الواحد nanorod في الطول الموجي لل lnc 680 نانومتر ، في حين كانت استدارة 180 ° وعقد المستقطب في درجه 2 قباله موقف الاستقطاب متقاطعة. وقد تم تعديل الشكل 7 ا باذن من Sun et al., كيمياء تحليليه. 81 (22) ، 9203-9208 (2009) ، والشكل 7 ب ، ج من ستندر وآخرون ، الكيمياء التحليلية. 84 (12) ، 5210-5215 (2012). حقوق الطبع الجمعية الكيميائية الامريكيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

عند التصوير مع المجهر DIC ، فمن المهم لتحسين المكونات البصرية قبل جمع البيانات. حتى التعديلات الطفيفة علي المستقطب في منتصف التجربة يمكن ان تؤدي إلى تاثيرات كبيره علي البيانات النهائية⁶. وعلاوة علي ذلك ، تتطلب مواد مختلفه إعدادات الاستقطاب مختلفه. علي الرغم من انه تم استخدام احجام الخطوات الكبيرة هنا لإثبات تاثير زاوية الاستقطاب ، في تجربه فعليه ، فانه من الضروري تحسين اعداد الاستقطاب داخل 1 °-2 درجه من اعداد التباين الأمثل. وينبغي أيضا تسجيل الاعداد المستقطب للرجوع اليها في المستقبل. ومن المستحسن أيضا ان تعمل دائما علي نفس الجانب من المستقطب متقاطعة (0 °) نقطه. التبديل ذهابا وإيابا لا يوفر اي مزايا ، ولكن يمكن ان يؤدي إلى الارتباك ، وذلك بسبب انعكاس في نمط الظل.

التالي في الاهميه ، من المهم لمراقبه كثافة الخلفية عند التخطيط لأداء الطيفي. ومن الأفضل إنجاز ذلك عن طريق ضبط وقت التعرض للكاميرا ، أو عن طريق أضافه فلاتر الكثافة المحايدة إلى المسار الضوئي. يمكن ان يؤثر ضبط الفتحات أو كثافة المصباح علي أضاءه كولر وتغيير قيم التباين. يجب ان تكون الخلفية نسبيا حتى عبر العينة ، بحيث لا يغير اختيار منطقه الخلفية حساب التباين. يجب تجنب عينات العينات التي ليست مجاوره لمساحة خلفيه نظيفه. وعلاوة علي ذلك ، لا يمكن تعيين كثافة الخلفية في البداية عاليه جدا أو منخفضه جدا. إذا تم تعيين كثافة الخلفية عاليه جدا ، هناك خطر متزايد ان بعض الإشارات سوف تتجاوز الحد الأقصى للنطاق من الكاميرا ، مما يجعل من المستحيل لحساب التباين في تلك المناطق. إذا تم تعيين كثافة الخلفية منخفضه جدا ، سيكون من الصعب للغاية لتحقيق التباين الجيد بين المكون المظلم من اشاره DIC واشاره الخلفية. يمكن ان يساعد فهم السلوك النموذجي أو المتوقع للعينه في تحديد كثافة الخلفية المناسبة.

ومن الضروري أيضا إيجاد المستوي البؤري المناسب. واحده من مزايا Nomarski DIC هو ان لديها عمق الضحلة من الميدان. ومع ذلك ، وهذا يجعل من الصعب التركيز علي عينات رقيقه ، مثل الجسيمات النانويه. مع عينات أكثر سمكا ، والتحدي هو في العثور علي المستوي البؤري الفعلي لأكبر قدر من الاهتمام. قد تكون العديد من الطائرات المحورية مثيره للاهتمام ولها جسيمات نانويه عليها ، لذلك من المهم تحديد في وقت مبكر علي جسيمات نانويه ذات الاهتمام الأكبر.

في حاله الجسيمات النانويه ، من المهم بالنسبة لميكروسكوبيست الاعتراف بأنهم يشاهدون قرص مهواه أو "وظيفة نقطه انتشار" من الكائن². بشكل عام ، القرص مهواه مفيد في تحديد ما إذا كان جسيمات متناهي plasmonic الشكل الذي هو الانسيابية أو متباينة الخواص ، ولكن التصوير جسيمات متناهي هو في الواقع أكثر تعقيدا بكثير مما هو موضح هنا. المجاميع جسيمات متناهي المعقدة يمكن ان تشبه في بعض الأحيان الجزيئات الانسيابية ، ونتيجة لذلك ، فان طرق المجهر الكتروني ضرورية لتوصيف أنماط الجسيمات متناهي^{2،16،18، 19}. لصوره جسيمات نانويه plasmonic مع المجهر DIC ، فمن المهم لاستخدام التصوير المصفاة وصوره الجزيئات في واحده من موجات plasmonic امتصاص عاليه⁶. يمكن ان يؤدي التصوير بطول موجه غير صحيح أو بدون فلاتر إلى التقاط أنماط التظليل المصبوب التي يصعب فكها.

عند تصوير الجسيمات النانويه إلى جانب الكائنات التي تكون أكبر من حد الانكسار للضوء ، من المهم ان نتذكر ان هدف المجهر "يري" مستوي بؤري مسطح نسبيا. ومن المفاهيم الخاطئة الشائعة لل DIC انها تمكن من عرض كائن في الاغاثه 3D الفعلية. ويرجع ذلك إلى زخرفه الظل المدلي بها ، مما يجعل العديد من الكائنات يبدو ان ثلاثه الابعاد. ومع ذلك ، لجمع المعلومات العمودية علي الطائرات البؤرية المتعددة ، سيكون من الضروري رفع أو خفض المرحلة وجمع سلسله من الصور. هذا يمكن ان يكون من الصعب جدا لأداء وتفسير ، وخاصه بالنسبة للعينات أكثر سمكا ، مثل الخلايا. التالي ، فان الميكروسكوبيست يحتاج إلى فهم عميق لجميع المواد المعنية عند اجراء مثل هذه التجارب ويجب ان يسجل مواقف الطائرات البؤرية الفردية التي تم استخدامها.

وأخيرا ، تكون خطوه تحليل البيانات حرجه مثل جمع البيانات. عند قياس التباين أو كثافة القيم من العينة ، وينبغي ان توضع عده عوامل في الاعتبار. عاده ، المحلل هو المهتمة في المقام الأول في الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم للجسيمات الفائدة. عندما يكون التباين إلى نسبه الضوضاء للعينه عاليه بما فيه الكفاية ، وإذا كانت منطقه الخلفية نظيفه ومضاءه بالتساوي ، ثم شكل هندسي بسيط يمكن رسمها حول منطقه عينه دون القلق من اشاره يجري إدخالها من قبل الملوثات. وعلاوة علي ذلك ، إذا كانت الخلفية نظيفه ومضاءه بالتساوي ، يمكن اجراء قياس الخلفية في اي منطقه مجاوره مباشره للعينه. ومع ذلك ، إذا كانت هناك ملوثات أو إذا كانت الخلفية غير متساوية ، فيجب علي المحلل اجراء مراجعه نقديه لمحيط العينة ، ويحتاج المحلل إلى تقييم ما إذا كان من الممكن اجراء قياسات خلفيه معقولة. ومن الاهميه بمكان أيضا قياس العينة ومجالات الخلفية باستخدام الاداه ذات الحجم والشكل ، من أجل تجنب إدخال التحيز في الحساب. وعموما ، فان مناطق القياس الأصغر حجما لها احتمال اقل للكشف عن القيم المتطرفة (مثل الملوثات ، والشوائب السيئة ، وما إلى ذلك) ، ولكن المناطق الكبيرة لأخذ العينات غالبا ما توفر قياسا أكثر موثوقيه للقيمة المتوسطة للخلفية.

وليس لدي صاحب البلاغ ما يكشف عنه.

الدكتور أنتوني س. ستندر يرغب في الاعتراف بالدعم الفني من خلال معهد الظواهر الكمية (NQPI) في جامعه أوهايو. وقد أتيحت هذه المادة من خلال بدء التمويل المقدم للدكتور ستندر من جامعه أوهايو.