Method Article
Burada, bir insan veya hayvan hücresi, KDM1A inhibitörleri ile tedavi edilen doku veya kan örneklerinde KDM1A hedef etkileşimi ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Protokol, serbest KDM1A enziminin chemoprobe etiketlemesini ve hedef işgali kemoprob bazlı immünozit kullanarak doğrudan ölçülmesini kullanır ve preklinik ve klinik çalışmalarda kullanılabilir.
Bir ilacın, tasarlandığı protein ile etkileşimi olarak tanımlanan hedef etkileşiminin değerlendirilmesi, ilaç gelişiminde veya temel araştırma projelerinde herhangi bir bileşiğin biyolojik aktivitesinin yorumlanmasında temel bir gerekliliktir. Epigenetik olarak, hedef nişan en sık hedef bileşik Birliği ölçmek yerine vekil işaretçileri analizi ile değerlendirilir. Analiz edilmiş olan akım biyolojik okuymalar histon işareti modülasyonu veya gen ifadesi değişikliklerini içerir. KDM1A, metil gruplarını Mono-ve dimethylated H3K4, Gen ifadesinin susturulması ile ilişkili bir modifikasyondan kaldıran bir lizin demethylase 'dir. Vekil işaretçileri modülasyonu hücre türü ve fonksiyon genetik makyaj, incelenen hücreleri bağlıdır, hangi yorumlama ve çapraz durum karşılaştırma oldukça zor yapabilirsiniz. Bu sorunları aşmak için, doğrudan KDM1A hedef etkileşimi doz etkilerini ve dinamiklerini değerlendirmek için çok yönlü bir protokol sunulmaktadır. Tahlil açıklanan bir KDM1A chemoprobe yakalamak ve Unin, enzim ölçmek için yaygın olarak hücreler veya doku örnekleri genetik modifikasyon için gerek kalmadan uygulanabilir, algılama mükemmel bir pencere vardır ve kullanımı yapar temel araştırma için hem de kullanılabilir ve klinik numunelerin analizi.
Lizin spesifik demethylase 1 (KDM1A)1 Gen transkripsiyonu kontrolünde yer alan bir demethylase 'dir. Bu protein, Onkoloji 'de bir aday farmakolojik hedef2 olarak ortaya çıkmıştır; Akut myeloid lösemi3 (ayl), myelodisplazi Sendromu (MDS)4, myelofibroz (MF)5,6, küçük hücreli akciğer kanseri (sclc)7; orak hücre hastalığı (SCD)8,9ve Alzheimer hastalığı (reklam), multipl skleroz (MS) dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi hastalıklarında; ve saldırganlık10.
Klinik gelişiminde KDM1A inhibe bileşiklerin çoğu siklopropilamin türevleri ve flavin adenin dinükleotid (FAD) kofaktör11için kovalent bağlayıcı tarafından protein inhibe. KDM1A inhibisyonu gen ifade değişikliklerini indükler, ancak bu değişiklikler, doku, hücre türleri veya hastalık vakaları arasında muazzam farklılık gösterir. KDM1A inhibisyonu da histon işaretleri değiştirir12, henüz bu değişiklikler genellikle genom belirli bir sitede yerel olarak üretilir, ve yine, yüksek doku ve hücre spesifik.
Protokol, biyolojik örneklerde KDM1A hedef etkileşimi doğrudan ölçmek için geliştirilmiştir ve siklopropilamin türev inhibitörleri ile kullanılmak üzere optimize edilmiştir. Tahlil ELISA teknolojisi dayanmaktadır ve analiz, paralel olarak, Total ve ücretsiz (yani inhibitör tarafından ilişkisiz) KDM1A bir doğal protein özü bir biyolojik örnek bir katı faz tahlil. İlk adım olarak, biyolojik numune biyotinlenmiş KDM1A seçici chemoprobe OG-881, seçici KDM1A inhibitörü ORY-1001 (ıadademstat), KDM1A klinik olarak güçlü bir inhibitör türetilmiştir, varlığı içinde lysed onkolojik hastalığın tedavisi için gelişme. Chemoprobe bir IC50 için KDM1A 120 nm ve bir FAD bağlayıcı kısım bir biyotinlenmiş Polietilen glikol (PEG)-kuyruk bağlı içerir. Chemoprobe özel olarak ücretsiz KDM1A bağlar, ancak numunenin inhibitörü bağlı KDM1A. Chemoprobe bağladıktan sonra, örnekteki kompleksleri içeren KDM1A, ücretsiz KDM1A belirlemek için streptavidin kaplamalı yüzeyli mikrotiter plaklarda veya toplam KDM1A belirlemek için monoklonal Anti-KDM1A yakalama antikor ile kaplanmış plaklarda yakalanır. Yıkandıktan sonra, her iki plaka bir anti-KDM1A algılama antikor ile inkübe, tekrar yıkanır, ve göreli ölçüm tarafından bir Işıksaçan substrat ve Ölçüleme kullanarak algılama için ikincil bir HRP-konjuate eşek Anti-tavşan IgG antikor ile inkübe ışık ünitelerinin (RLU) bir Luminometre (Şekil 1).
Şekil 1. KDM1A hedef nişan için ELıSA enzim bağlantılı chemoprobe immunemici tahlil şeması: A) Toplam KDM1A sandviç ELISA ve B kullanarak belirlenmesi) ÜCRETSIZ KDM1A chemoprobe ELıSA kullanarak belirlenmesi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Her testin doğrusallık doğrulamak için her iki ELıSA plakaları standart bir eğrisi dahil edilir. Her örnekteki KDM1A hedef etkileşimi belirlenmesi daha sonra ön doz veya araç tedavi örnek göreli bir değer olarak hesaplanır.
Kan numuneleri, Ispanyolca mevzuatına (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) ve yerel etik komitelerinin onayı uyarınca Instituto de Investis Biomédica Sant Pau biobank 'tan alınmıştır. Hayvansal dokularla yapılan çalışmalar, laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak (Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 86/609/EEC), Hayvan deneyi Etik Komitesi tarafından kurulan PRAAL-PCB.
1. tahlil için biyolojik numunelerin hazırlanması.
DIKKAT: Bu protokol, Iş güvenliği ve sağlık Idaresi (OSHA) kan kaynaklı patojenler standardına (29 CFR 1910,1030), Avrupa Parlamentosu 'nun 2000/54/EC Direktifi ve 18 Eylül 2000 Konseyi veya eşdeğer düzenlemeler. Buna ek olarak, biyolojik numuneler biyolojik olarak aktif araştırma kimyasal bileşiklerin izlerini içerebilir ve protokol bu tür bileşiklerin daha fazla manipülasyon gerektirebilir. Denemenin başlangıcından önce kullanılan bileşiklerin güvenlik veri sayfasını (SDS) gözden geçirin ve yeterli kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanımı da dahil olmak üzere araştırma merkezinde kurulan tüm geçerli güvenlik önlemlerini kesinlikle gözlemlemek. Uygun koruyucu giysiler giyin ve deney süresince uygun kalkanı kullanın. Uygun atık konteynerlerde (biyolojik/sitotoksisik atık) kalıntıları atın.
Not: Bu protokol, hücreler veya KDM1A inhibitörü ile tedavi edilen konuların örnekleri ile başlar ve onların tedavi edilmemiş veya araç/plasebo tedavi kontrolleri3.
2. çözüm hazırlığı
3. yerli protein ekstraksiyon
4. Bradford tahlil kullanarak yerli protein ölçümü
5. Toplam ve ücretsiz KDM1A belirlenmesi için Işıksaçan ELISAs
Not: Laboratuvar sıcaklığını 23-24 °C ' de (RT) sabit tutun.
STANDART SERI | KDM1A standart çalışma çözümü (μL) | |
(PG KDM1A/Well) | PBS (μL) | |
C için 2500-* | 800 | - |
2500 | 800 | - |
1750 | 560 | 240 |
1250 | 400 | 400 |
750 | 240 | 560 |
250 | 80 | 720 |
25 | 8 | 792 |
0 | 0 | 800 |
Not: | ||
(1) her seyreltme hazırlanan hacim test triplicate 2 plaka çalıştırmak için yeterlidir. | ||
(2) Önerilen Aralık arasında 2,5 ve 5.000 pg/iyi | ||
* Negatif kontrol C-KDM1A algılama antikor olmadan |
Tablo 1: Standart hazırlık. Standart KDM1A proteini hazırlamak için, KDM1A standart çalışma çözeltisi ve PBS 'nin belirtilen hacimlerini sekiz düzgün etiketli 1,5 mL mikrosantrifüjli tüplere pipet etmek.
Tablo 2: derin kuyu plaka tasarımı. Standartlar (mavi) ve örnekleri (sarı) adım 5.4.2. mavi (Standart) ve sarı (numune) okları yönünde aşağıdaki ELISA plakaları içine yükleme kolaylaştırmak için derin kuyu plaka yansıyan pozisyonlara pipetli edildi. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 3: ELıSA plaka tasarımı. Tahlil plakası rekombinant KDM1A hedef (mavi) azalan miktarlarda standart eğri içerir; sarı biyolojik numune (ler); ve karşılık gelen negatif kontroller (örnekleri içerir, ancak birincil algılama antikor) beyaz, derin kuyu plaka ELıSA plakaları üzerinde yüklenecek. Boş (Standart eğri 0) tüm yakalama ve algılama reaktifleri içerir, ancak örnek yok. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
6. hedef etkileşimi hesaplanması
Toplam ve serbest KDM1A belirlenmesinde doğrusallık.
A standart serisi adım 5.3.2 açıklandığı gibi hazırlanmıştır., kullanarak 0 için 2500 pg tam uzunlukta insan rekombinant KDM1A enzim. Toplam ve ücretsiz rKDM1A RLU değerleri doğrusallık doğrulamak için değerlendirildi (Şekil 2a ve 2B). Veriler 3 Teknik çoğaltır (n) ± SD ile 3 deneyden ortalama olarak temsil edilir. 3 bağımsız gönüllülerin kanından insan PBMCs 'de algılanan Total ve Free KDM1A RLU değerleri Şekil 2C ve 2D'de standart eğrinin üzerinde yer aldı. Kan numuneleri, Ispanyolca mevzuatına (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) ve yerel etik komitelerinin onayı uyarınca Instituto de Investis Biomédica Sant Pau biobank 'tan alınmıştır.
Şekil 2. Sağlıklı gönüllülerin PBMCs toplam ve ücretsiz rKDM1A belirlenmesi. ELISA (A) ve ücretsiz rKDM1A tarafından değerlendirilen toplam rKDM1A RLU değerleri chemoprobe yakalama ELıSA (B) tarafından değerlendirildi. Veriler 3 çoğaltma deneyinden elde edilmiştir ve her biri üç kopya olarak incelenir (N = 3; n = 3). Toplam KDM1A RLU değerleri, standart eğri üzerinde Süperpoze 3 bağımsız tedavi edilmemiş gönüllülerin (kırmızı, mavi ve yeşil kareler) pbmcs için ELISA (C) ve ücretsiz KDM1A (D) tarafından değerlendirildi. Veriler, triplicate içinde analiz edilen bir deneyden (N = 1; n = 3) elde edildi. Temsil edilen değerler ± SD demektir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Hücrelerde KDM1A hedef etkileşimi Analizi
AI hücreleri sağlayıcı önerileri aşağıdaki kültürlü. Hücreler farklı konsantrasyonlarda araç veya ORY-1001 ile tedavi edildi (0,25; 0,5; 1; 5 ve 25 nM) (Şekil 3). Yerli protein özler 25 nM OG-881 chemoprobe varlığında elde edildi. 0,5, daha önce açıklandığı gibi hedef nişan analizini gerçekleştirmek için toplam protein μg kullanılmıştır. Toplam ve ücretsiz KDM1A belirlendi ve ORY-1001 için hedef nişan yüzdesi KDM1A ' e göre araç olarak belirtildiği şekilde hesaplanır.
Şekil 3. Doz-yanıt-in KDM1A hedef nişan içinde a insan AYL hücre hat. Hücreler farklı konsantrasyonlarda araç veya ORY-1001 ile tedavi edildi (0,25; 0,5; 1; 5 ve 25 Nm) ve açıklandığı gibi hedef etkileşimi belirlenmesi için kullanılır. Veriler 3 çoğaltma deneyinden elde edildi, her biri üç plağını analiz etti (N = 3, n = 3). Temsil edilen değerler ± SD demektir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
In vivo KDM1A hedef etkileşimi Analizi
Bu denemenin amacı, doz seviyesinin işlevinde, farklı sıçan dokularında ORY-1001 hedef etkileşimi karakterize etmektir. Bu hedefe ulaşmak için, 15 Sprague-Dawley fareler (200-250 g) test edilmiş bileşik tarafından potansiyel kontaminasyonu önlemek için bir sitostatik güvenlik odasında barındırıldı. 5 çalışma grubuna maksimum 3 sıçan/kafes rasgele atanmıştır. Alınan 5 farklı çalışma grubu sırasıyla araç; 1 3 10 veya 30 μg/kg ORY-1001 oral yönetim tarafından ardışık 4 gün boyunca. Bileşik stok çözümleri her gün hazırlanmıştır. Hayvanlar gerekli hacmi ayarlamak için her yönetim önce tartıldı. Tüm hayvanlar sabit oda sıcaklığında (20-24 º C) ve bağıl nemi (45-% 65) barındırıldı 12 h açık karanlık döngüsü altında (ışıklar açık 6:00 AM). Gıda ve su kullanılabilir reklam Isteğe bağlı. Kan örnekleri toplanan 2 h son uygulamadan sonra K2EDTA tüpler ve PBMCs daha önce adım 1.2.2 açıklanan prosedüre göre izole edildi. ve-80 °C ' de yerli protein ekstraksiyonu kadar korunur. Akciğer numuneleri de son ilaç yönetiminden 2 saat sonra toplanır, hemen sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve-80 °C ' de saklanır. Araştırmalar, PRAAL-PCB ' l e hayvan deneyi Etik Komitesi tarafından kurulan Laboratuvar hayvanlarının (Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 86/609/EEC) bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak yapılmıştır.
Pulverizasyon sonra, akciğer doğal protein ekstraları açıklandığı ve nicelleşmiş olarak elde edildi. KDM1A hedef nişan tahlili için doz grubu başına 5 μg toplam protein havuzlanmış PBMCs veya 7,5 μg toplam protein akciğer 3 hayvandan kullanıldı.
PBMCs 'de KDM1A hedef etkileşimini ve ORY-1001 ' i n oral gavaj ile sıçanların akciğer tedavisinde doz-tepkisi, araç grubuna göre hesaplanan Şekil 4A ve 4B'de gösterilir. Figure 4c'de gördüğünüz gibi, 25 Nm ORY-1001 ile ex vivo inkübasyon, araç tarafından tedavi edilen hayvanlardan gelen akciğer proteini EKSTRALARı tam te henüz ama daha fazla ten örneklerinde te artış yapmaz 4 gün boyunca tedavi et 30 μg/kg ORY-1001 , KDM1A teyit zaten tamamen içinde vivo engellenir.
Şekil 4. In vivo ve ex vivo Native KDM1A hedef etkileşimi. PBMCs (A) ve akciğer örneklerinde (B) KDM1A hedef etkileşimi, ORY-1001 ile tedavi edilen farelerden (s. o) 4 ardışık gün için doz-yanıtı. Veriler, kohort başına 3 hayvandan havuza alınan PBMCs ekstrelerinden, yinelenen (N = 1, n = 2) ya da kohort başına 3 bireysel hayvandan gelen akciğerlerden (N = 3, n = 3) incelenmiştir. C. araç (sol) veya 30 μg/kg ORY-1001 ile tedavi edilen fareler havuzlu akciğer proteini özler TE karşılaştırılması; (gri çubuklar) veya 25 nM ORY-1001 (mavi çubuklar) (N = 3, n = 3) olmadan özler 1 h ex vivo inkübasyon sonra. Tüm veriler ± SD anlamına gelir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Burada sunulan protokol doğrudan KDM1A hedef nişan bir roman KDM1A chemoprobe yakalama tabanlı ELISA kullanarak ölçmek için geliştirilmiştir. Yöntem, insan, sıçan ve fare ve babun (pbmcs, akciğer, beyin, cilt, tümörler dahil), ama kolayca diğer türler için uygulanabilir hangi KDM1A antikor hedef epitopları ve katalitik olarak kültürlü insan hücresi hatları ve ex vivo örnekleri üzerinde doğrulandı Merkezi temin edilmektedir. OG-881 bir aktivite bazlı chemoprobe olduğu için, örnek kalite önemli ve uygun manipülasyon ve numunelerin korunması özellikle protokolün ilk adımlar sırasında, KDM1A aktivite korunması sağlamak için takip edilmelidir.
Geçerli Deneysel protokol, KDM1A hedef etkileşimi, kovalent FAD hedefleme inhibitörleri tarafından analiz etmek için optimize edilmiştir. Ayrıca KDM1A FAD kofaktör erişimi engelleyen geri dönüşümlü inhibitörleri ile kullanılabilir. Uzun ikamet süreleri ile güçlü geri dönüşümlü inhibitörler değiştirilmemiş protokol istihdam edebilir.
OG-881 chemoprobe, yüksek off-RATES ile düşük potens geri dönüşümlü inhibitörleri için uygun olmayabilir. Bu yazıda kullanılan özel kemoprob hücre Penetrant değildir ve bu nedenle analizler ex vivo lysed örneklerinde gerçekleştirilir.
Yöntem, araştırma ve analitik laboratuvarlarda geniş bir şekilde kullanılabilen araçlarla çalıştırılabilir; Bu hücreler içine tanıtılacak genetik değişiklikler gerektirmez ve kolayca farklı örnek türlerine uygulanabilir. Başka bir avantaj da, kavram çalışmalarının preklinik kanıtında ve toksikoloji modellerinde sık kullanılan farklı türlerden türeyen örneklerde ve klinik numunelerin analiz edilmesi için başarıyla çevrildiği örneklerde kullanılabilmesi.
KDM1A hedef etkileşimi analizi için diğer yöntemler kullanılmıştır. Bu yöntemlerin çoğu H3K4me2 histon işareti değişiklikleri gibi proxy işaretçileri kullanmak, alphalisa15kullanarak; veya qRT-PCR veya FACS Analizi16kullanarak ifade işaretçileri indüksiyon. Ancak, hücreler veya dokularda, histon işaretleri birden fazla faktör tarafından kontrol edilir ve histon işaretindeki değişikliklerin ölçülmesi her zaman analiz için iyi bir Dinamik Aralık sağlamasırlar. KDM1A inhibisyonu gen ve protein ifadesinde güçlü değişiklikler yapabilir, ancak yanıt doz tepkisi analizlerini zorlaştırabilir çok heterojen ve yüksek hücre bağlamı bağımlı eğilimindedir3,7.
Hedef işgalinin doğrudan değerlendirilmesi, bu nedenle, hedef etkileşimi ölçmek için en iyi seçenektir. Bu için önerilen bir tahlil hücresel termal vardiya tahlil (CETSA), inhibitörleri bağlama üzerine hedef proteinlerin termal stabilitesi artışa dayanmaktadır. Bu yöntem, prensip olarak, değiştirilmemiş hücrelere ve farklı doku türlerine uygulanabilir ve yakın zamanda KDM1A inhibitörlerinin hücresel aktivitesini değerlendirmek için kullanılan hücrelerde17. Ancak, bu teknoloji nadiren in vivo Farmakodinamik çalışmalar için kullanılan18 ve bilgi en iyi, onun kullanımı klinik çalışmalarda rapor edilmedi.
Burada sağlanan protokol, hücreler ve doku örneklerinde KDM1A hedef etkileşimi belirlemek için kullanılan tam olarak doğrulanmış bir chemoprobe tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Yöntem başarıyla KDM1A inhibitörü19 ile tedavi insan konuları örnekleri analiz etmek için çevrilmiş ve KLINIK çalışmalarda PK/PD tepkiler modeli için büyük kullanım olacaktır.
Yazar Tamara Maes bir İcra Direktörü ve hissedar, ve yazarlar Cristina Mascaró ve Raquel Ruiz Rodriguez Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. çalışanları KDM1A inhibitörleri geliştirir ve patentleri kapsayan bileşikler ve yöntemleri kullanılan tutar Bu makalede.
Bu çalışmada Oryzon Genomics tarafından finanse edilmiştir. S.A., Hoffman-La Roche ve CIıP-20152001 ve RETOS işbirliği programı RTC-2015-3332-1 tarafından kısmen desteklenmektedir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
Streptavidin | Promega | #Z704A | |
Syringe | BD | #303172 | |
Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır