Protein kinaz C-delta inhibitör peptid formülasyonu altın nano tanecikleri kullanarak

Daha önce bir sentetik peptid, akut akciğer iskemi reperfüzyon bağlı yaralanma azaltılmış protein kinaz C-delta inhibitörü intravenöz sunmak için bir altın nanopartikül peptid melez kullandık. İşte detaylı iletişim kuralı uyuşturucu formülasyon göstermektedir. Hücre içi diğer peptidler benzer şekilde formüle edilebilir.

Protein kinaz C-delta inhibitörü (PKCδi) iskemi reperfüzyon bağlı organ yaralanması önlemek için umut verici bir ilaçtır. Genellikle bir hücre Penetran peptid, TAT, hücre içi teslimat için için Birleşik. Bununla birlikte, TAT non-spesifik biyolojik faaliyetleri göstermektedir. Altın nano tanecikleri (GNPs) olarak tanınan toksisite olmadan ilaç teslim taşıyıcılar kullanılabilir. Bu nedenle, PKCδi teslim etmek için bir GNP/peptid melez kullandık. İki kısa peptidler (P2: CAAAAE ve P4: CAAAAW), bir 95:5 oranında GNP yüzey özelliklerini değiştirmek için kullanıldı. PKCδi (GNP/PKCi) ile Birleşik GNPs distile su içinde kararlı %0.9 NaCl ve fosfat tamponlu tuz (PBS) sığır serum albümin veya fetal sığır serum içeren. İntravenöz enjeksiyon GNP-PKCi daha önce akciğerin iskemi-reperfüzyon hasarı önlemek için gösterildi. Bu makalede GNP/PKCi formüle ve GNP/PKCi physiochemical özelliklerini değerlendirmek için bir protokol özetlenmektedir. GNP peptid tabanlı diğer ilaçlarla formüle için benzer yöntemler kullandık. Bu makalede Umarım bu roman hücre içi uyuşturucu teslim teknoloji ve uygulamaları içinde vivo daha fazla dikkat çekecek.

Akciğer nakli hastaların son aşama akciğer hastalığı¹ile kaydeder. Ancak, akciğer nakli sonrası ciddi komplikasyonlar bir engel olarak kalır. Akciğer nakli takip erken aşamalarında birincil greft disfonksiyon en zararlı komplikasyon¹ise onun birincil neden iskemi-reperfüzyon (IR)-Akut akciğer yaralanma²indüklenen.

Soğuk koruma altında bir donör akciğer metabolizmasında çok düşük bir düzeye sınırlıdır. Ancak, Reaktif oksijen türleri ve nitrik oksit sentezi kan akışı³kesilmesi nedeniyle aktif hale gelir. Ekimi sonra kan dolaşımını geri yüklenir ve Reaktif oksijen türlerine ve nitrik oksit soğuk iskemi sırasında oluşturulan doku yaralanma sonucu inflamasyon ve hücre ölüm artırır.

IR yaralanma önlemek için bir protein kinaz Cδ inhibitörü (PKCδi) kalp, beyin ve akciğer^4,5,6,7,8' kullanılmıştır. Bu çalışmalar PKCδi reperfüzyon sırasında inflamasyon ve Apoptozis azalma gösterdi. Ayrıca akciğer IR yaralanma fareler ve akciğer nakli modeli⁶engelledi. PKCδi genellikle bir hücre Penetran peptid, TAT, hücre içi teslimat için ile Birleşik. Ancak, yalnız TAT peptid anjiogenezi, Apoptozis ve inhibisyon birden çok sitokinler^9,10,11dahil non-spesifik biyolojik etkileri vardır gösterilmiştir. Nano tanecikleri, 1'den 100'e kadar küçük parçacıklar ilaç teslim¹³kolaylaştırma aday olarak keşfedilmeyi çapı¹²' nm. Özellikle, altın nano tanecikleri (GNPs) kadar noninvaziv ve toksik olmayan kabul edilir. Bu nedenle, uyuşturucu teslim taşıyıcıları peptid bazlı ilaçlara^14,15olarak GNPs geliştirdik.

GNPs yüzeyinin Moleküler tanıma^16,17, kimyasal algılama¹⁸, görüntüleme¹⁹ve ilaç dağıtım gibi belirli uygulamalar için manipüle edilebilir. 20 nm GNPs ve iki kısa peptidler içeren bir GNP/peptid hibrid sistemi geliştirilmiştir (P2: CAAAAE ve P4: CAAAAW) 95:5 oranında, GNPs yüzey özelliklerini değiştirmek için. P2 peptid, sonunda, olumsuz ücret glutamik asit (E) ile GNPs sulu bir çözüm stabilize ve P4 peptid, sonunda, hidrofobik triptofan (W) ile GNPs yardımcı olur giriş hücreleri¹⁴içine. Bu peptidler N terminus de sistein (C) kalıntı için altın yüzeyler¹⁴eşlenik thiol grubunu içerir. Bu peptid/GNP hibrid daha fazla PKCδi (CSFNSYELGSL) teslim etmek için kullanıldı. P2:P4 PKCδi için en iyi duruma getirilmiş molar oranını 47.5:2.5:50 var. PKCδi (GNP/PKCi) ile Birleşik GNPs distile su, % 0,9 NaCl ve sığır albümin veya fetal sığır serum¹⁴içeren PBS istikrarlı vardır. İntravenöz enjeksiyon GNP/PKCi akciğer¹⁵iskemi-reperfüzyon hasarı önlemek için gösterilmiştir. Bu makalede GNP/PKCi formüle etmek bir yöntem özetliyor ve GNP/PKCi fizikokimyasal özellikleri değerlendirmek açıklar. Diğer peptid bazlı ilaçlara GNP^20,21,22' ye Birleşik formüle için benzer yöntemler kullandık. Umarız bu makale bu roman formülasyonu hücre içi ilaç dağıtım için daha fazla dikkat çekecek.

1. hazırlanması peptid çözümleri

1. Peptidler almak (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL)-20 ° C-dondurucu ve tezcan, oda sıcaklığında (RT).
   Not: peptidler üzerinde Yoğuşmalı nem önlemek için kapalı şişe tutmak.
2. Her peptid 0,01 g bir microscale üzerinde tartın. Her peptid ayrı 50 mL konik tüp içine koymak.
3. P2 tüp 18.74 mL deiyonize (DI) su ekleyin.
4. DI su 16.93 mL P4 tüp ekleyin.
5. PKCδi Tube DI suda seyreltilmiş % 50 Asetonitril 8.21 mL ekleyin.
6. Girdap peptid çözümleri kısaca. 50 mL konik boru 5 min için bir sonicator (40 MHz) koyun.
7. Peptid çözümleri bir biyogüvenlik kabine getir. Hazırlanan tüm peptid çözümler 1 mM olmalıdır.
8. 1 mL her peptid çözeltisi için yeni 50 mL konik tüp aktarın. P2 ve P4 tüpler 19 mL DI su ekleyin ve öyle ki her çözüm için 50 µM seyreltilmiş ve kendi tüp içinde depolanan 19 mL % 50 Asetonitril PKCδi tüp için ekleyin.

2. GSMH/PKCi formülasyonu

1. Peptidler GNP çözümde hala iken BSC eklenmelidir
2. 475 μL P2, 25μL P4 ve δPKCi çözüm 500 μL 15 mL tüp içine ekleyin. 9 mL 20 nm GNP çözeltisi (7.0x10¹¹ parçacık/mL) aynı 15 mL tüp ekleyin.
3. Biyogüvenlik kabini çıkın. 15 mL tüp alüminyum folyo ile sarın. Bir shaker RT at üzerinde gece bırakın.
4. Örnekleri için Biyogüvenlik kabini dönün. GNP/PKCi aliquot 1 mL her 1.5 mL mikrotüpler içine.
5. Mikro santrifüj 15,294 x g 4 ° C'de 30 min için tüplerde santrifüj kapasitesi
6. Süpernatant her tüpün altında bir biyogüvenlik kabini kaldırın.
   Not: süpernatant GNP Pelet değişmeden kalır ve değil Aspire sağlarken kaldırmak için dikkatli olun.
7. Pelet gerekli toplama göre istenen solvent yeniden askıya. İlgili maddeleri olabilir DI su, PBS ve % 0,9 NaCl.
   Not: GNP/PKCi 1 mL itibaren GNP Pelet üreticisi tarafından sağlanan GNP konsantrasyon göre 10¹¹ parçacıklar x 6,3 içerir. 1.3 x 500 µL % 0,9 10¹² parçacıklar yönetmek için NaCl, biz eklemek 232 µL % 0,9 NaCl her üç briketler. Onları birlikte havuzu sonra sonra 500 µL GNP/PKCi çözüm toplayabilirsiniz.
   Not: istenen Mix solvent GNP/PKCi Pelet sulandrarak çok önce aksi takdirde GNP/PKCi toplamak.

3. GSMH/PKCi hibrid çözünürlük değerlendirilmesi

1. 0.5 mL GNP/PKCi çözeltisi bir akrilik küvet dökün. Akrilik küvet bir UV-VIS Spektrofotometre yerleştirin ve en yüksek emme¹⁵sınayın.

Bakım alınmalıdır GNP/PKCi Hybrid biyofiziksel özellikleri değerlendirmek için olarak GNP eğilimi solvent toplamak. GNP toplanır, belgili tanımlık eriyik rengini pembe mor (Şekil 1a) değişir. UV-VIS Spektrofotometre daha hassas değişiklikleri tespit edebilmektedir. Eğer GNP/PKCi değil toplanan emilme doruk-meli var olmak 525 nm (Şekil 1b). Eğer GNP toplanır, emme zirvesine sağa değiştirilecektir. Ne zaman toplamları ΔOptical yoğunluk oluşmuş analizi, alternatif bir yöntem olarak (ΔOD 525 OD = nm - OD, 440 nm) azaltır.

Resim 1 : GSMH/PKCi kalitesini. (A)düzgün hazırlanmış GNP/PKCi (solda) rengi pembedir. Toplanan GNP/PKCi görünür ışık (sağda) mor. (B) su, PBS, veya % 0,9 NaCl çözüm iyi GNP/PKCi hazırlık kararlı. Okuma bir UV-VIS Spektrometre üzerinde belirtilen emme zirvesine 525 olduğunu tüm çözümlerinde nm. (C) iyi ve kötü GNP/PKCi hazırlıkları bir örnek. GNP toplanan zaman emme zirvesine sağa doğru kaymıştır. Ayrıca, ΔOD düşmüştür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Uygun formülasyon emin olmak için δPKCi çözüm 1,6 olarak özetlenen sonication adım geçer önemlidir. ΔPKCi peptid sıra hidrofobik moieties, içeriyor, bu nedenle bir sonicator PKCi % 50 Asetonitril çözümde çözülmesinde yardımcı olur. Buna ek olarak, solvent titizlikle 2.7. adımda açıklandığı şekilde karıştırmak çok önemlidir.  Eğer aşağıdaki adımları düzgün, δPKCi peptid²³toplama nedeniyle bitmiş değil GNP/PKCi hibrid de formüle edilecektir değil.
 
Uyuşturucu GNP tabanlı formülasyon birçok avantaj sağlar. İlk olarak, GNPs kolayca birkaç nanometre ~ 100'e de kontrollü bedenleri, sentezlenmiş nm. Genellikle, daha küçük ölçekli GNPs uyuşturucu hücrelere küçük olanlar kolayca onların hedef bölge²⁴diffüz gibi büyük olanlar daha verimli bir şekilde teslim edebilirsiniz.  İkinci olarak, GNPs are non-toksik²⁵tüp bebek ve içinde vivo, onları güvenli uyuşturucu taşıyıcıları yapım.  Üçüncüsü, hidrofobik ilaçların değiştirilmiş GNPs²⁶yüklenebilir.  İleri, GNPs yüzey kimyası özel uygulamalar için kolayca değiştirilebilir. Çalışmalarımız, iki kısa peptidler onları fizyolojik şartlarda stabilize ve yeni bioactivities vermek için GNP yüzeyi, değiştirmek için kullanılır. Peptidler düşünceli altın bağlama, Aralık ve fonksiyonel bölgeler de dahil olmak üzere üç bölgeler ile dizayn edilmiştir.  Özellikle peptid N terminus altınla bağlayabilirsiniz thiol grubu içeren sistein (C) kalıntı vardır. Orta bölümü dört hidrofobik alanin artıkları GNPs üzerinde yoğun paketlenmiş monolayer peptid derlemesinde tanıtmak için vardır. Bir fonksiyonel dışa, işaret GNPs yüzey özelliklerini işlemek için kullanılan Aminoasit C terminus adlı amino asittir. Bu iki peptidler 95:5 oranını sistemik bir önceki çalışmada¹⁴' seçildi. PKCi ve P2/P4 peptidler arasındaki oran da sistemik test edildi ve¹⁵seçili.

Öte yandan, GNP uyuşturucu dağıtım sistemi sınırlamaları vardır. GNPs hücre tipi ya da doku belirli değildir. GNPs esas olarak intravenöz yönetim^27,28,29sonra akciğer, karaciğer ve dalak biriktirilir. Şimdiye kadar bu formül yalnızca hücre kültürü ve küçük hayvan sınanmıştır modelleri. Tercüme klinik uygulama, büyük hayvan modeller ve onun farmakokinetik daha fazla çalışmalar için doku dağıtım ve potansiyel toksisitesi gerek belirlenecek.

Yazarlar bu proje üzerinde ifşa gerek yok.

Bu eser Kanada Sağlık Enstitüleri araştırma (PJT-148847), Bakanlığı araştırma ve yenilik, Ontario (RE-08-029) ve Kanada ilk araştırma mükemmellik programı, tasarım Toronto Üniversitesi Tıp araştırma hibe tarafından desteklenmektedir. Dr. Mingyao Liu James ve Mary Davie sandalye akciğer yaralanma, onarım ve yenileme olduğunu.