Протеин киназы C-Дельта ингибитор пептид формулировка с использованием наночастиц золота

Ранее мы использовали гибридом пептид золотых наночастиц внутривенно доставить синтетический пептид, белка ингибитора киназы C-Дельта, который сокращен индуцированной ишемии реперфузии острого повреждения легких. Здесь мы покажем подробный протокол разработки препарата. Другие внутриклеточные пептиды могут быть сформулированы аналогичным образом.

Белка ингибитора киназы C-Дельта (PKCδi) является перспективным наркотиков для предотвращения ишемии реперфузии индуцированной орган травмы. Это обычно спрягаются для ячейки проникая пептид, ТАТ, внутриклеточный доставки. Однако ТАТ показал неспецифической биологической деятельности. Наночастиц золота (ВНП) может использоваться в качестве перевозчиков наркотиков доставки без признанного токсичности. Таким образом мы использовали ВНП/пептид гибрид для доставки PKCδi. Два коротких пептидов (P2: CAAAAE и P4: CAAAAW), в соотношении 95:5, были использованы для изменения свойств поверхности ВНП. ВНП, конъюгированных с PKCδi (ВНП/PKCi) являются стабильными в дистиллированной воде, 0,9% NaCl и фосфат амортизированное saline (PBS), содержащие бычьим сывороточным альбумином или плода бычьим сывороточным. Внутривенные инъекции ВНП-PKCi был ранее виден для предотвращения ишемии реперфузии повреждения легких. Эта статья конспектирует протокол сформулировать ВНП/PKCi и оценить свойства физико ВНП/PKCi. Мы использовали аналогичные методы для разработки других препаратов на основе пептида с ВНП. Эта статья будет мы надеемся привлечь больше внимания к этой технологии доставки Роман внутриклеточных наркотиков и ее применения в естественных условиях.

Трансплантации легких сохраняет больных с терминальной стадии легких заболеваний¹. Однако серьезные осложнения после трансплантации легких остаются препятствием. На ранних этапах после трансплантации легких, первичный трансплантата дисфункция является наиболее вредных осложнение¹, и ее основной причиной является ишемии реперфузии (ИК)-индуцированной ОПЛ травмы².

При холодной сохранения метаболизм в донорских легких ограничен до очень низкого уровня. Однако из-за прекращения потока крови³активизируются реактивнооксигенных видов и синтеза оксида азота. После пересадки восстанавливается кровообращение, и активных форм кислорода и окиси азота, созданные во время холодной ишемии повышение воспаления и клеток смерти, травме ткани.

Чтобы предотвратить травмы ИК, ингибитор Cδ киназы протеина (PKCδi) был использован в сердце, мозг и легких^4,5,6,7,8. Эти исследования показали, что PKCδi снижение воспаления и апоптоза при реперфузии. Это также мешало легочной ИК травмы в крыс и в пересадке легких модель⁶. PKCδi обычно проспряганное с клетки проникая пептид, ТАТ, внутриклеточный доставки. Однако было показано, что ТАТ пептид только имеет неспецифической биологические эффекты, включая содействие ангиогенезе, апоптозе и ингибирование несколько цитокинов^9,10,11. Наночастицы, мелкие частицы, от 1 до 100 Нм в диаметре¹², были изучены как кандидатов в содействии наркотиков доставки¹³. В частности наночастиц золота (ВНП) рассматриваются как неинвазивной и нетоксичен. Таким образом мы разработали ВНП как носители доставки наркотиков на основе пептидные препараты^14,15.

На поверхности ВНП можно манипулировать для конкретных приложений, таких как Молекулярное распознавание^16,17, химические зондирования¹⁸, изображений¹⁹и доставки лекарств. Была разработана ВНП/пептид гибридной системы, содержащие 20 Нм ВНП и два коротких пептидов (P2: CAAAAE и P4: CAAAAW) в соотношении 95:5, чтобы изменить свойства поверхности ВНП. P2 пептид с отрицательно заряженных глутаминовая кислота (Е) в конце, стабилизирует ВНП в водном растворе, и P4 пептид с гидрофобным триптофан (W) в конце, помогает ВНП вход в клетки¹⁴. Остатков цистеина (C) на конечной остановке N этих пептидов содержит тиоловых группу, которая может конъюгат на золотых поверхностях¹⁴. Далее этот пептид/ВНП гибрид использовался для доставки PKCδi (CSFNSYELGSL). Оптимизированный молярное соотношение P2:P4 к PKCδi-47.5:2.5:50. ВНП, конъюгированных с PKCδi (ВНП/PKCi), стабильная в дистиллированной воде, 0,9% NaCl и PBS, содержащие альбумина bovine или плода бычьим сывороточным¹⁴. Внутривенные инъекции ВНП/PKCi было показано для предотвращения ишемии реперфузии травмы легких¹⁵. Эта статья описывает метод для разработки ВНП/PKCi и описывает способы оценки физико-химических свойств ВНП/PKCi. Мы использовали аналогичные методы формулировать другие препараты на основе пептида, конъюгированных ВНП^20,,2122. Мы надеемся, что эта статья будет привлечь больше внимания к этот роман формулировка для доставки внутриклеточных лекарств.

1. Приготовление растворов пептида

1. Извлечение пептидов (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) от-20 ° C морозильника и разморозить при комнатной температуре (RT).
   Примечание: Держите бутылку закрыты, чтобы предотвратить влаги от конденсации на пептиды.
2. Весят 0,01 г каждый пептид на микромасштабной. Положите каждый пептид в отдельном 50 мл Конические трубки.
3. Добавьте 18,74 мл деонизированной воды (DI) P2 трубки.
4. Добавьте 16,93 мл воды ди P4 трубки.
5. Добавьте 8.21 мл 50% ацетонитриле, разводят в воде ди PKCδi трубу.
6. Вихревой пептид решения кратко. Положите 50 мл конические трубы в sonicator (40 МГц) за 5 мин.
7. Привести решения пептид биобезопасности кабинета. Все решения пептид подготовлен должна быть 1 мм.
8. 1 мл раствора Каждый пептид передать новой 50 мл Конические трубки. Добавить 19 мл воды ди к трубкам P2 и P4 и добавьте 19 мл 50% Ацетонитрил PKCδi трубки, что каждый раствор разбавляют до 50 мкм и хранится в собственной трубе.

2. Формулирование ВНП/PKCi

1. Пептиды должны быть добавлены в ВНП решение еще в BSC
2. Добавление 475 мкл P2, 25μL P4 и 500 мкл раствора δPKCi в 15 мл трубку. Добавление же 15 мл 9 мл раствора 20 Нм ВНП (7.0x10¹¹ частиц/мл).
3. Выйдите из кабинета по биобезопасности. Оберните 15 мл тюбик с алюминиевой фольгой. Оставьте его на шейкер на RT на ночь.
4. Возвращает образцы биобезопасности кабинета. Аликвота 1 мл ВНП/PKCi в каждом 1.5 мл пробирок.
5. Центрифуга для труб в микро центрифуга для 30 мин при 15,294 x g при 4 ° C.
6. Удалите супернатант из каждой трубы под биобезопасности кабинета.
   Примечание: Будьте осторожны удалить супернатант обеспечивая Пелле ВНП остается неизменным и не наддува.
7. Вновь приостановите гранулы в нужный растворитель согласно необходимо концентрацию. Применимые растворители могут быть ди воды, PBS и 0,9% NaCl.
   Примечание: Начиная с 1 мл раствора ВНП/PKCi, Пелле ВНП содержит 6.3 x 10¹¹ частицы, основанный на концентрации ВНП, предоставляемых производителем. Чтобы администрировать 1.3 x 10¹² частиц в 500 мкл 0,9% NaCl, мы мкл 232 0,9% NaCl для каждого из трех окатышей. После объединения их вместе, мы можем затем собрать 500 мкл раствора ВНП/PKCi.
   Примечание: Смешать желаемого задолго до разбавления Пелле ВНП/PKCi растворителей, в противном случае будет агрегировать ВНП/PKCi.

3. Оценка ВНП/PKCi гибридные растворимость

1. Залейте 0,5 мл раствора ВНП/PKCi в кювет акрил. Поместите кювету акрил на Спектрофотометр UV-Vis и проверить пик поглощения¹⁵.

Следует для оценки биофизических свойств ВНП/PKCi гибрид, как ВНП, как правило, чтобы совокупные в растворителе. При агрегировании ВНП, цвет раствора меняется от розового до пурпурного (рис. 1a). Спектрофотометр UV-Vis способен обнаружить изменения более чутко. Если PKCi ВНП не агрегируются пик поглощения должно быть в 525 Нм (рис. 1b). Если агрегируется ВНП, пик поглощения будет смещен вправо. Как альтернативный метод анализа, когда агрегаты образовали ΔOptical плотность (ΔOD = OD в 525 Нм - ОД при 440 Нм) уменьшается.

Рисунок 1 : Качество ВНП/PKCi. (A) должным образом подготовлена ВНП/PKCi-розового цвета (слева). Агрегированные ВНП/PKCi появляется свет фиолетовый (справа). (B) подготовка хороших ВНП/PKCi является стабильным, в воде, PBS, или в растворе 0,9% NaCl. Чтений на UV-Vis спектрометр указал, что пик поглощения в 525 Нм во всех решений. (C) пример хороших и плохих ВНП/PKCi препаратов. При агрегировании ВНП, пик поглощения был перенесен на право. Кроме того снижение ΔOD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Для обеспечения надлежащей разработки, важно, что δPKCi раствор подвергается sonication шаг, изложенные в 1.6. ΔPKCi пептид последовательность содержит гидрофобные постановление, так что sonicator помогает в растворении PKCi в ацетонитриле 50% растворе. Кроме того очень важно тщательно, как указано в шаге 2.7 смешать растворитель.  ВНП/PKCi гибрид не будет быть хорошо сформулированы, если эти шаги не выполняются должным образом, благодаря агрегации δPKCi пептид²³.
 
На основе ВНП наркотиков формулировка обеспечивает несколько преимуществ. Во-первых, ВНП могут быть легко синтезированы в хорошо контролируемых размеров, начиная от нескольких нанометров до ~ 100 Нм. Как правило меньше размера ВНП могут доставить наркотики в клетки более эффективно, чем крупные, мелкие легко может диффундировать в их целевого региона²⁴.  Во-вторых ВНП являются токсичными в vitro и in vivo²⁵, делая их безопасным препаратом перевозчиков.  Третьих, гидрофобные наркотиков может быть загружен на изменение ВНП²⁶.  Далее химии поверхности ВНП легко модифицируется для конкретных приложений. В наших исследованиях два коротких пептидов используются для изменения поверхности ВНП, стабилизировать их в физиологических условиях и распространять новые bioactivities. Пептиды были тщательно разработан с тремя регионами, включая золото привязки, интервал и функциональных областей.  В частности N-го пептида имеет остатков цистеина (C), содержащие тиоловых групп, который можно связать с золотом. Средняя часть имеет четыре гидрофобные аланина остатков для содействия Ассамблее пептида в плотно упакованных монослоя на ВНП. Амино кислоты на конечной остановке C является функциональной аминокислота указывая наружу, который может использоваться для манипулирования свойств поверхности ВНП. 95:5 соотношение этих двух пептиды системно был выбран в предыдущем исследовании¹⁴. Соотношение между PKCi и P2/P4 пептиды также системно тестировалось и отдельных¹⁵.

С другой стороны система доставки наркотиков ВНП имеет ограничения. Не типа клеток или тканей конкретных ВНП. ВНП основном накапливается в легких, печени и селезенке после внутривенного введения^27,,2829. До настоящего времени, эта формула протестирована только в культуре клеток и небольших животных моделей. Чтобы перевести его клинического применения, дальнейшие исследования на больших животных моделей и его фармакокинетики, распределения и потенциал токсичность ткани должны определяться.

Авторы не имеют ничего сообщать на этот проект.

Эта работа поддерживается научно-исследовательских грантов от канадской институты здравоохранения исследований (PJT-148847), Министерство исследований и инноваций Онтарио (RE-08-029) и Канада первой исследований передового опыта программы, медицина дизайн в университете Торонто. Д-р Лю Mingyao, Джеймс и Мэри Дэви стул в легких повреждений, ремонт и восстановление.